專利名稱：一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)川蔗23號(hào)遺傳轉(zhuǎn)化Bt基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程中對(duì)植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的方法，特別是涉及根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法，具體是一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)甘蔗品種川蔗23號(hào)遺傳轉(zhuǎn)化Bt抗蟲基因的方法。
背景技術(shù)：
甘鹿(Saccharum officinarum L.)是重要的糖能經(jīng)濟(jì)作物,在世界各地廣泛栽植，其產(chǎn)糖量約占世界糖產(chǎn)量的60% 70%，在我國則占到90%以上。甘蔗大田生產(chǎn)的整個(gè)生長發(fā)育期內(nèi)均會(huì)受到多種蟲害威脅，尤以鱗翅目害蟲一蔗螟(主要有條螟、二點(diǎn)螟、大螟、白螟、黃螟等)危害最大，以幼蟲蛀入甘蔗幼苗和蔗莖，導(dǎo)致甘蔗商品性、糖份等品質(zhì)下降，并帶來每年20% 25%的損失。利用有性雜交技術(shù)培育抗蟲甘蔗品種是提高甘蔗抗蟲能力的重要途徑。但是，甘蔗是高度雜合的異源多倍體和多倍的非整倍體植物，遺傳背景十分復(fù)雜，利用傳統(tǒng)育種方法從有性雜交到良種育成要10 13年，周期長成效低。基因工程可以定向改變作物的某些性狀，為植物的育種開辟了新途徑。Bt (cryIAb)基因是從微生物蘇云金桿菌分離出的一種殺蟲結(jié)晶蛋白基因，是一種廣譜性的抗蟲基因，它指導(dǎo)合成的殺蟲結(jié)晶蛋白(ICP)。對(duì)許多鱗翅目、雙翅目及鞘翅目的昆蟲均有較強(qiáng)毒性。至1987年首次獲得轉(zhuǎn)Bt煙草植株以來，現(xiàn)已在許多植物的遺傳轉(zhuǎn)化中得以運(yùn)用。甘蔗的遺傳轉(zhuǎn)化研究首次報(bào)道始于1987年，目前成功培育出轉(zhuǎn)基因甘蔗的轉(zhuǎn)化方法有原生質(zhì)體電穿孔法、基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等3種。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法簡(jiǎn)便、易于操作，克服了基因槍法及電擊法等直接轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化效率低，轉(zhuǎn)化體嵌合體多、轉(zhuǎn)化外植體不易成活及拷貝數(shù)多的缺點(diǎn)，因此研究甘蔗農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化對(duì)甘蔗遺傳工程改良有重要的理論與實(shí)踐意義。1998年，Arencibia等采用工程菌LBA4404和EHAlOl成功進(jìn)行了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化，平均轉(zhuǎn)化率為0.194% 1.115%，開辟了甘蔗農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)基因研究的先河。同年，Elliott使用工程菌株AGLO進(jìn)行甘蔗轉(zhuǎn)基因研究，轉(zhuǎn)化效率為5.13%。此后國內(nèi)外都相繼開展了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化研究。國內(nèi)有關(guān)甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化的研究較晚，王自章等、羅敬萍等、于蘭等、唐建平等先后通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功獲得了甘蔗的轉(zhuǎn)基因植株。出乎預(yù)料的是，研究過程中發(fā)現(xiàn)按照現(xiàn)有技術(shù)中的甘蔗的遺傳轉(zhuǎn)化方法對(duì)自育甘蔗品種川蔗23號(hào)的進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，幾乎無法實(shí)現(xiàn)，而到目前為止還沒有見到對(duì)特定的川蔗23號(hào)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的報(bào)道。本領(lǐng)域公知，影響農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗的因素很多，如甘蔗的基因型、受體材料類型、農(nóng)桿菌株系、菌體濃度、乙酰丁香酮(AS)濃度、浸染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間等。經(jīng)過長時(shí)間的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于川蔗23號(hào)而言，菌體濃度與浸染時(shí)間是影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素。在較高菌液濃度與較長浸染時(shí)間的條件下可導(dǎo)致受體胚性愈傷組織在篩選培養(yǎng)基上因農(nóng)桿菌過度增殖而污染死亡， 其污染死亡率高達(dá)90%以上，從而進(jìn)一步導(dǎo)致轉(zhuǎn)化無法實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的方法大大降低了川蔗23號(hào)胚性愈傷組織的污染率并成功實(shí)現(xiàn)其遺傳轉(zhuǎn)化Bt抗蟲基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)甘蔗品種川蔗23號(hào)遺傳轉(zhuǎn)化Bt抗蟲基因的方法，可以顯著降低川蔗23號(hào)胚性愈傷在轉(zhuǎn)基因過程中因農(nóng)桿菌過度增殖而污染死亡的現(xiàn)象，并成功實(shí)現(xiàn)其遺傳轉(zhuǎn)化。本發(fā)明具體包括如下步驟:獲得川蔗23號(hào)遺傳轉(zhuǎn)化所需受體胚性愈傷組織；預(yù)培養(yǎng)及預(yù)處理胚性愈傷組織；攜帶有植物表達(dá)載體及目的基因的農(nóng)桿菌工程菌液的制備；工程菌液浸染胚性愈傷組織；胚性愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)；抗性愈傷、抗性芽及抗性小苗篩選培養(yǎng)；抗性植株P(guān)CR檢測(cè)。所述的胚性愈傷組織是以川蔗23號(hào)的幼嫩葉鞘為外植體，經(jīng)(常規(guī))滅菌后切成幼葉卷(厚度為0.3cm左右)，接種于胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，25°C黑暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)胚性愈傷組織。胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基并添加I 2mg L—1的2，4_D (2，4- 二氯苯氧乙酸)與0 50mg L—1的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。受體材料以誘導(dǎo)40 50d呈淡黃色、結(jié)構(gòu)疏松、顆粒狀、胚性一致的愈傷組織為轉(zhuǎn)化最佳受體。所述的預(yù)培養(yǎng)是將胚性愈傷轉(zhuǎn)入胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于25°C黑暗培養(yǎng)3 4d。預(yù)處理是將胚性愈傷于浸染前在超凈工作臺(tái)風(fēng)干處理30 45min，至其微微干縮。所述的工程菌液制備是指挑取攜帶PCAMBIA1301質(zhì)粒(以玉米的Ub1-1為啟動(dòng)子)與目的基因Bt (crylAb)的農(nóng)桿菌菌株EHA105 (四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物與核技術(shù)研究所提供)單菌落于農(nóng)桿菌培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，48 72h后刮取長0.5 1.0cm的菌體,懸浮于農(nóng)桿菌活化培養(yǎng)基內(nèi)，其0D_為0.1左右，再置于28 °C，180rpm條件下振蕩培養(yǎng)2h，以誘導(dǎo)農(nóng)桿菌vir基因的活化表達(dá)，此菌液即為轉(zhuǎn)化工程菌液。農(nóng)桿菌培養(yǎng)基以YEP為基本培養(yǎng)基并添加50mg L—1的卡那霉素(Kan)、50mg L—1的利福平(Rif)和15g L—1的瓊脂(Agar),農(nóng)桿菌活化培養(yǎng)基以AAM為基本培養(yǎng)基并添加100 150 ii m L—1的AS (乙酰丁香酮)。所述的工程菌液浸染是將預(yù)處理的胚性愈傷浸沒于工程菌液中感染1.5 2min，轉(zhuǎn)到濾紙上吸干多余菌液。所述的共培養(yǎng)是將浸染的胚性愈傷轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，于23°C黑暗培養(yǎng)3 4d，待有少量可見農(nóng)桿菌增殖時(shí)為宜。共培養(yǎng)培養(yǎng)基以胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基并添加100 150um I/1 的 AS。所述的篩選培養(yǎng)是指將共培養(yǎng)后的胚性愈傷組織用無菌水清洗至無渾濁后，用含有羧節(jié)青霉素(Car)500mg L—1的無菌水浸泡2min,再用無菌水清洗3次,無菌濾紙吸干后，接種于抗性胚性愈傷篩選培養(yǎng)基上，25°C黑暗培養(yǎng)15 20d，轉(zhuǎn)入抗性芽篩選培養(yǎng)基上，25°C，20001x光照強(qiáng)度下培養(yǎng)以誘導(dǎo)芽的形成，當(dāng)抗性芽長至5cm左右時(shí)，轉(zhuǎn)入生根篩選培養(yǎng)基上以篩選抗性完 整植株。抗性胚性愈傷篩選培養(yǎng)基為胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基并添加潮霉素(Hyg) 20 30mg !^+CarfOO 500mg L—1，抗性芽篩選培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基并添加 6-BA1.0 2.0mg L:+NAA 0.1 0.5mg L ^Hyg 20 30mg L 1+Car 300 500mg L_1+PVP 0 50mg I71，生根篩選培養(yǎng)基為 1/2MS+NAA 1.0 2.0mg L-1+Hyg 20 30mg L 1+Car 300 500mg L、所述的PCR分子檢測(cè)是根據(jù)Bt (CrylAb)序列合成反應(yīng)引物，分別以潮霉素抗性植株的DNA、對(duì)照甘蔗植株的DNA及質(zhì)粒DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。


圖1為獲得的胚性愈傷組織(①為非胚性愈傷；②為致密性白色胚性愈傷；③為淡黃色疏松型胚性愈傷);圖2為抗性愈傷；圖3為抗性芽；圖4為生根的抗性植株(左為非轉(zhuǎn)化植株，右為轉(zhuǎn)化植株)；圖5為川蔗23號(hào)PCR檢測(cè)結(jié)果，其中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(Maker iii)，I為攜帶有Bt (cryIAb)基因的pCAMBIA1301質(zhì)粒PCR擴(kuò)增結(jié)果，2為未轉(zhuǎn)基因的川蔗23號(hào)PCR擴(kuò)增結(jié)果，3、5為成功遺傳轉(zhuǎn)化的川蔗23號(hào)的PCR擴(kuò)增結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明:
實(shí)施例1胚性愈傷的獲得1.選取生長健壯無病蟲害的川蔗23號(hào)蔗稍，剪去葉片并剝離最外層葉鞘，用洗衣粉搓洗干凈，于自來水下沖洗30mi n，擦干于超凈工作臺(tái)上用75%酒精擦洗滅菌，再進(jìn)行外部葉鞘的剝離，每剝離二層用無水乙醇擦洗，并灼燒其上沾附的酒精，直至莖尖出現(xiàn)，切取距莖尖生長點(diǎn)IOcm左右的幼葉組織為外植體，切成厚度為0.3cm左右的幼葉卷，接種于胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2，4-Dlmg噸―1，25°C黑暗培養(yǎng)，2周左右繼代一次，誘導(dǎo)愈傷組織的發(fā)生。誘導(dǎo)的愈傷組織一般有三種形態(tài):①非胚性愈傷，呈黃褐色有黏性；②致密型白色胚性愈傷；③淡黃色結(jié)構(gòu)疏松型胚性愈傷。這誘導(dǎo)初期以前兩種愈傷為主，約40d左右即可形成淡黃色分散性較好的愈傷，以此作為受體材料(圖1)。甘蔗外植體極易褐化，在切取外植體的過程中其傷口隨即變?yōu)楹稚谂囵B(yǎng)過程中約有15%左右的外植體不能產(chǎn)生愈傷組織，終因褐化而死亡，有些外植體在形成愈傷組織后也極易褐化，研究發(fā)現(xiàn)通過添加50mg 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)可有效減輕愈傷組織在培養(yǎng)過程中的褐化。實(shí)施例2抗生素濃度篩選愈傷組織繼代培養(yǎng)階段:潮霉素(Hyg)設(shè)置6個(gè)梯度濃度(O、10、20、30、40、50mg L-1)。選取生長旺盛實(shí)施例1制備的淡黃色結(jié)構(gòu)疏松的胚性愈傷組織(直徑大小約
0.3cm左右)為實(shí)驗(yàn)材料，接種在含有潮霉素的胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2，4-D1.0mg -L^1的培養(yǎng)基上，在25°C黑暗條件下培養(yǎng)，每2周轉(zhuǎn)接一次新鮮培養(yǎng)基，每處理10個(gè)愈傷，重復(fù)3次，30天后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。根據(jù)愈傷組織的生長情況確定Hyg的濃度。不定芽分化培養(yǎng)階段:潮霉素(Hyg)設(shè)置6個(gè)梯度濃度(O、10、20、30、40、50mg T1) 選取生長旺盛實(shí)施例1制備的淡黃色結(jié)構(gòu)疏松的胚性愈傷組織(直徑大小約0.3cm左右)為實(shí)驗(yàn)材料，接種在含有潮霉素的芽分化培養(yǎng)基MS+6-BA
2.0mg I^+NAA0.2mg L—1培養(yǎng)基上，在28°C，每天14h，2000Lx光照條件下培養(yǎng)，每2周轉(zhuǎn)接一次新鮮培養(yǎng)基，每處理10個(gè)愈傷，重復(fù)3次，30天后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。根據(jù)愈傷組織的分化情況確定Hyg質(zhì)量濃度。
生根培養(yǎng)階段:潮霉素(Hyg)設(shè)置6個(gè)梯度濃度(O、10、20、30、40、50mg L-1)。選取生長旺盛、長勢(shì)一致、株高3cm左右的分化苗，接種在含有潮霉素的生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA2.0mg L—1上，在28°C，每天14h，2000Lx光照條件下培養(yǎng)，每2周轉(zhuǎn)接一次新鮮培養(yǎng)基，每處理10個(gè)愈傷，重復(fù)3次，30天后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。根據(jù)芽苗發(fā)根情況確定生根篩選的Hyg質(zhì)量濃度。潮霉素抗性濃度篩選實(shí)驗(yàn)表明，隨著潮霉素濃度的增加胚性愈傷增殖率、分化率及生根率都逐漸下降。當(dāng)潮霉素濃達(dá)20mg L-1時(shí)甘蔗胚性愈傷分化率僅為11%，并且分化的不定芽不能伸長，IOd后黃化死亡。由于未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的死亡會(huì)影響周圍轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長，為了保證轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長，因此在前期篩選階段選擇較低濃度的潮霉素(20mg L—1)。甘蔗小芽對(duì)潮霉素的耐受性稍大于胚性愈傷，在IOmg L-1濃度下其生根率達(dá)到100%，只是再生的根與對(duì)照相比較少、較纖弱并且顏色為褐色，在20mg L-1時(shí)其生根率在38.9%，但根較短色澤較深，上部叢芽也會(huì)部分黃化，約40d后植株整體死亡。但在30mg L—1時(shí)，不能生根，并且20d后全部褐化死亡。為了防止假陽性植株的逃逸，因此其生根篩選壓以SOmg*!/1為且。實(shí)施例3工程菌液的制備挑取攜帶pCAMBIA1301質(zhì)粒與目的基因Bt (cryIAb)的農(nóng)桿菌菌株EHA105單菌落于農(nóng)桿菌培養(yǎng)基YEP+Kan50mg L:+Rif 50mg L:+Agar 15g L 1上劃線培養(yǎng)，48 72h后刮取長0.5 1.0cm的菌體，懸浮于農(nóng)桿菌活化培養(yǎng)基AAM+AS150 y m L—1內(nèi)，其0D600為0.1左右，再置于28°C，ISOrpm條件下振蕩培養(yǎng)2h，以誘導(dǎo)農(nóng)桿菌vir基因的活化表達(dá)，此菌液即為轉(zhuǎn)化工程菌液。實(shí)施例4川蔗23號(hào)的遺傳轉(zhuǎn)化將實(shí)施例1獲得的淡黃色結(jié)構(gòu)疏松的胚性愈傷在新鮮的胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2, 4-Dlmg L—1上預(yù) 培養(yǎng)4d后，置于超凈工作臺(tái)吹風(fēng)處理45min，至其微微干縮后將其浸沒于實(shí)施例3所制備的工程菌液中浸染2min，無菌濾紙上吸掉多余水分后于共培養(yǎng)基MS+2, 4-Dlmg L^+ASISO y m L—1上，23°C，黑暗培養(yǎng)3d。共培養(yǎng)后將胚性愈傷用無菌水清洗至無渾濁后，用含有羧芐青霉素(Car)500mg L—1的無菌水浸泡2min，再用無菌水清洗3次，無菌濾紙吸干后，接種于抗性胚性愈傷篩選培養(yǎng)基MS+2, 4-Dlmg *L_1+Hyg20mg *L_1+Car5OOmg L—1上，25°C黑暗培養(yǎng)15 20d，獲得抗性愈傷(圖2)，再將其轉(zhuǎn)入抗性芽篩選培養(yǎng)基MS+6-BA2.0mg L^+NAA0.2mg r1+Hyg20mg L_1+Car500mg L-1 上，25°C，20001x 光照強(qiáng)度下培養(yǎng)以誘導(dǎo)抗性芽(圖3)，當(dāng)抗性芽長至5cm左右時(shí)，轉(zhuǎn)入生根篩選培養(yǎng)基1/2MS+NAA2.0mg L_1Hyg30mg L_1+Car300mg L-1 上，以篩選抗性完整植株(圖 4)。在預(yù)實(shí)驗(yàn)階段，參照前人的研究方法，設(shè)定農(nóng)桿菌浸染濃度為0D600=0.6，浸染時(shí)間為30mi n，但均因在篩選培養(yǎng)階段農(nóng)桿菌的過度增殖導(dǎo)致胚性愈傷缺氧而褐化、死亡，未能獲得抗性植株。逐漸降低0D600值和浸染時(shí)間，因農(nóng)桿菌而引起的感染有所降低，當(dāng)0D600=0.1左右浸染時(shí)間為2m i n時(shí)，在此條件下處理后的甘蔗胚性愈傷在共培養(yǎng)3d后也會(huì)有可見的菌體出現(xiàn)，在脫菌中用含有500mg L4Car的無菌水中浸泡2min再轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中即可很好的抑制農(nóng)桿菌的生長。研究中還發(fā)現(xiàn)浸染外植體的大小與胚性愈傷的增殖及分化有很大的影響，外植體過小(直徑0.1-0.2cm)極易褐化，外植體過大(直徑大于
0.5cm)則不利于農(nóng)桿菌的清洗,直徑0.3-0.5cm大小的外植體最適宜。
實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)根據(jù)Bt (CrylAb)中間序列合成反應(yīng)引物 5 ' -TCATCCAGCGAATCTACC-3 '和5' -AACAGTGCCCTTACAACC-3'，目的片段大小為823kb (由上海生工合成)。分別以潮霉素抗性植株的DNA、對(duì)照甘蔗植株的DNA及質(zhì)粒DNA為模板，用合成引物，在49°C退火溫度下進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得川蔗23號(hào)轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)情況如圖5所示。結(jié)果表明獲得了 823bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。I)改良CTAB法提取甘蔗總DNA①將2 X CTAB提取液放入65 °C水浴中預(yù)熱；②取0.2g材料，加液氮磨成粉，將磨好的材料轉(zhuǎn)入2mL的離心管中，加ImLCTAB提取液，充分混勻，置于65°C水浴45min，期間不斷搖動(dòng)；③冷至室·溫，12000rpm,離心5min ；④取上清液，加入500 U I飽和酚，以及等體積的氯仿/異戊醇(24:1)，輕輕搖動(dòng)至溶液成乳化狀，12000rpm,離心IOmi n ；⑤取上清液，重復(fù)步驟(4)兩次，不加飽和酚；⑥取上清液，加入等體積的異丙醇，搖勻，-30°C放15mi n ；⑦12000rpm離心lOmin，棄上清液，沉淀用70%乙醇500 洗2 3次，室溫干燥沉淀；⑧用100 ill滅菌TE溶解沉淀，加入RNA酶I iil，- 20°C保存。⑨取2 ill DNA樣品在0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，與DNA標(biāo)準(zhǔn)比較，估算DNA濃度。2) PCR反應(yīng)體系如下:
權(quán)利要求
1.一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)川蔗23號(hào)遺傳轉(zhuǎn)化Bt基因的方法，其特征在于包括如下步驟: (1)胚性愈傷組織的獲取:以川蔗23號(hào)的幼嫩葉鞘為外植體，經(jīng)滅菌后切成幼葉卷，接種于胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，25°C黑暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)胚性愈傷組織； (2)胚性愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)及預(yù)處理胚性:將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于25 1:黑暗培養(yǎng)3 4 d;然后將胚性愈傷組織于浸染前在超凈工作臺(tái)風(fēng)干處理30 45 min,至其微微干縮； (3)攜帶有植物表達(dá)載體及目的基因的農(nóng)桿菌工程菌液的制備:挑取攜帶PCAMBIA1301質(zhì)粒與目的基因Bt的農(nóng)桿菌菌株EHA105單菌落于農(nóng)桿菌培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，48 72 h后刮取長0.5 1.0 cm的菌體，懸浮于農(nóng)桿菌活化培養(yǎng)基內(nèi)，其OD_為0.1，再置于28 °C,180 rpm條件下振蕩培養(yǎng)2 h，以誘導(dǎo)農(nóng)桿菌Wr基因的活化表達(dá)，此菌液即為轉(zhuǎn)化工程菌液； (4)工程菌液浸染胚性愈傷組織:將預(yù)處理的胚性愈傷組織浸沒于工程菌液中感染1.5 2 min,轉(zhuǎn)到濾紙上吸干多余菌液； (5)胚性愈傷與農(nóng)桿菌共培養(yǎng):將浸染的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，于23V黑暗培養(yǎng)3 4 d ; (6)抗性愈傷、抗性芽及抗性小苗篩選培養(yǎng):將共培養(yǎng)后的胚性愈傷組織用無菌水清洗至無渾濁后，用含有羧芐青霉素(Car) 500 mg噸―1的無菌水浸泡2 min，再用無菌水清洗3次，無菌濾紙吸干后，接種于抗性胚性愈傷篩選培養(yǎng)基上，25 1:黑暗培養(yǎng)15 20d，轉(zhuǎn)入抗性芽篩選培養(yǎng)基上，25 °C, 2000 Ix光照強(qiáng)度下培養(yǎng)以誘導(dǎo)芽的形成，當(dāng)抗性芽長至5 cm左右時(shí)，轉(zhuǎn)入生根篩選 培養(yǎng)基上以篩選抗性完整植株； (7)抗性植株P(guān)CR檢測(cè)。
2.如權(quán)利要求1所述的一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)川蔗23號(hào)遺傳轉(zhuǎn)化Bt基因的方法，其特征在于:所述胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基并添加I 2 mg -r1的2，4-D與0 50 mg.L—1的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)川蔗23號(hào)遺傳轉(zhuǎn)化Bt基因的方法，其特征在于:步驟(I)誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為40 50 d，選取淡黃色、結(jié)構(gòu)疏松、顆粒狀、胚性一致的愈傷組織進(jìn)行步驟(2)的操作。
4.如權(quán)利要求1或2所述的一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)川蔗23號(hào)遺傳轉(zhuǎn)化Bt基因的方法，其特征在于:所述農(nóng)桿菌培養(yǎng)基以YEP為基本培養(yǎng)基并添加50mg L—1的卡那霉素(Kan)、50mg L—1的利福平(Rif)和15 g L—1的瓊脂(Agar)，所述農(nóng)桿菌活化培養(yǎng)基以AAM為基本培養(yǎng)基并添加100 150 ii m I71的AS。
5.如權(quán)利要求1或2所述的一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)川鹿23號(hào)遺傳轉(zhuǎn)化Bt基因的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)基以胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基并添加100 150 ii m L—1的AS。
6.如權(quán)利要求1或2所述的一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)川鹿23號(hào)遺傳轉(zhuǎn)化Bt基因的方法,其特征在于:所述抗性胚性愈傷篩選培養(yǎng)基為胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基并添加潮霉素(Hyg) 20 30 mg L 1+Car 300 500 mg L、
7.如權(quán)利要求1或2所述的一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)川蔗23號(hào)遺傳轉(zhuǎn)化Bt基因的方法，其特征在于:所述抗性芽篩選培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基并添加6-BA 1.0 2.0 mg-L^+NAA`0.1 0.5 mg L i+Hyg 20 30 mg L:+Car 300 500 mg L ^PVP 0 50 mg L 1
8.如權(quán)利要求1或2所述的一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)川蔗23號(hào)遺傳轉(zhuǎn)化Bt基因的方法，其特征在于:所述生根篩選培養(yǎng)基為1/2 MS+ NAA 1.0 2.0 mg L_1+Hyg 20 30mg L 1+Car 300 500 mg L、
9.如權(quán) 利要求1或2所述的一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)川蔗23號(hào)遺傳轉(zhuǎn)化Bt基因的方法，其特征在于:所述的PCR分子檢測(cè)是根據(jù)Btcry1ab序列合成反應(yīng)引物，分別以潮霉素抗性植株的DNA、對(duì)照甘蔗植株的DNA及質(zhì)粒DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)川蔗23號(hào)遺傳轉(zhuǎn)化Bt基因的方法，包括獲得川蔗23號(hào)遺傳轉(zhuǎn)化所需受體胚性愈傷組織；預(yù)培養(yǎng)及預(yù)處理胚性愈傷組織；攜帶有植物表達(dá)載體及目的基因的農(nóng)桿菌工程菌液的制備；工程菌液浸染胚性愈傷組織；胚性愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)；抗性愈傷、抗性芽及抗性小苗篩選培養(yǎng)；抗性植株P(guān)CR檢測(cè)。在較低濃度的農(nóng)桿菌液(OD600為0.1左右)與較短浸染時(shí)間(1.5～2min)并結(jié)合各種處理方法成功實(shí)現(xiàn)了甘蔗品種川蔗23號(hào)的遺傳轉(zhuǎn)化。
文檔編號(hào)A01H4/00GK103103212SQ20131003045
公開日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2013年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月28日
發(fā)明者秦廷豪, 李曉梅, 安琪, 陽翠 申請(qǐng)人:四川省植物工程研究院