專利名稱：豬IFNγ-Fc融合蛋白及其編碼基因和表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和生物工程技術(shù)，尤其是涉及一種豬IFNY-Fc融合蛋白及其編碼基因和利用家蠶生物反應(yīng)器表達(dá)豬IFNy-Fc融合蛋白的方法。
背景技術(shù)：
干擾素(Interferon, IFN)是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)(主要是糖蛋白)，是一種由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。它們?cè)谕N細(xì)胞上具有廣譜的抗病毒、影響細(xì)胞生長(zhǎng)，以及分化、調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物活性。根據(jù)IFN的來(lái)源即動(dòng)物種類、細(xì)胞類型、誘生劑的性質(zhì)和誘生條件不同，可分為α、β、Y三種。其中干擾素-Y (Interf eron-gamma, IFN- Y )是一種具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，主要由活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，在機(jī)體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。但由于干擾素分子量小、吸收快、半衰期短、容易被酶水解等特點(diǎn)，在臨床中需要頻繁注射給藥才能達(dá)到治療的效果。IgG免疫球蛋白是體內(nèi)的主要抗體，IgG的Fe片段可以和新生的Fe受體(FcRn)結(jié)合，避免IgG進(jìn)入溶酶體中被降解。因此，IgG的Fe片段可以用來(lái)與IFNy連接構(gòu)成融合蛋白，以提高IFN Y在體內(nèi)的半衰期，達(dá)到長(zhǎng)效作用的目的；同時(shí)IgG可以通過(guò)Fe片段上的補(bǔ)體集合位點(diǎn)激活補(bǔ)體，起到細(xì)胞殺傷作用；此外，帶Fe片段的IFNy融合蛋白可以通過(guò)Protein A親和層析得到高效便捷的純化。目前豬干擾素的批量生產(chǎn)主要有誘導(dǎo)血液淋巴細(xì)胞法和大腸桿菌異源表達(dá)法。前一種方法以動(dòng)物細(xì)胞為原料，生產(chǎn)工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本高，產(chǎn)品有攜帶外源病毒和其他病原微生物的危險(xiǎn)。相比之下，大腸桿菌異源表達(dá)法`具有產(chǎn)量大、純度高、適合規(guī)模化生產(chǎn)、產(chǎn)品質(zhì)量容易控制等優(yōu)點(diǎn)，但是其生產(chǎn)工藝相對(duì)較繁瑣。并且，由于大腸桿菌體系內(nèi)缺乏蛋白翻譯后加工系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物多以無(wú)活性的包涵體形式產(chǎn)生。而包涵體的復(fù)性過(guò)程復(fù)雜、復(fù)性率低，從而導(dǎo)致蛋白比活性也較低。另外，大腸桿菌表達(dá)體系的產(chǎn)品純度不高，含有其他雜蛋白，分離純化較困難。而桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)作為一種真核表達(dá)系統(tǒng)，具有表達(dá)效率高、表達(dá)的外源蛋白質(zhì)可進(jìn)行翻譯后修飾，使目的蛋白在生化性質(zhì)及生理活性方面與天然蛋白基本相似、生產(chǎn)成本較低等優(yōu)點(diǎn)，從而為基因工程干擾素在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中廣泛奠定了基礎(chǔ)。因此，本發(fā)明提供了一種新穎的豬IFN Y-Fe融合蛋白桿狀病毒表達(dá)體系——家蠶(Bm)-家蠶桿狀病毒(BmNPV)表達(dá)系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種豬IFNy-Fc融合蛋白及其編碼基因，以及利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，尤其是家蠶(Bm)-家蠶桿狀病毒(BmNPV)表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)、生產(chǎn)豬IFN Y-Fe融合蛋白的方法。本發(fā)明提供了一種豬IFNy-Fc融合蛋白，其氨基酸序列包含有豬Y干擾素蛋白序列的成熟肽部分，同時(shí)，在豬Y干擾素蛋白序列C端的終止密碼子之前添加有Fe蛋白序列。本發(fā)明的上述所述豬IFN Y -Fe融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。本發(fā)明還提供了一種豬IFNy-Fc第一優(yōu)化基因，其堿基序列如SEQ ID N0:1所
/Jn ο本發(fā)明還提供了一種豬IFNy-Fc第二優(yōu)化基因，其堿基序列如SEQ ID NO:2所
/Jn ο本發(fā)明還提供了一種豬IFNY-Fc第三優(yōu)化基因，其堿基序列如SEQ ID NO:3所
/Jn ο本發(fā)明還提供了一種質(zhì)粒，所述質(zhì)粒含有上述所述的豬IFN Y-Fe第一、第二或第三優(yōu)化基因，所述質(zhì)粒優(yōu)選為Bacmid。本發(fā)明還提供了一種病毒，所述病毒具有上述所述的質(zhì)粒，所述病毒優(yōu)選為桿狀病毒，最優(yōu)選為BmNPV。本發(fā)明還提供了一種豬IFNy-Fc融合蛋白的表達(dá)方法，包含如下步驟:(I)在合適的條件下將上述所述的病毒轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞或穿刺接種家蠶幼蟲(chóng)；(2)家蠶BmN細(xì)胞或家蠶幼蟲(chóng)表達(dá)豬IFN Y -Fe融合蛋白。優(yōu)選的，所述表達(dá) 方法步驟如下:(I)將豬IFN Y -Fe第二優(yōu)化基因或第三優(yōu)化基因克隆到Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移表達(dá)載體pFastBac Dual中；(2)通過(guò)位點(diǎn)的特異性轉(zhuǎn)座，將轉(zhuǎn)移表達(dá)載體上的所述豬IFN Y -Fe第二優(yōu)化基因或第三優(yōu)化基因整合入Bacmid桿狀病毒質(zhì)粒完成病毒基因組的重組；(3)將步驟(2)中整合了豬IFN Y-Fe第二優(yōu)化基因或第三優(yōu)化基因的桿狀病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒并完成重組桿狀病毒的擴(kuò)增，并用桿狀病毒穿刺接種1-5齡的家蠶幼蟲(chóng)；所述家蠶幼蟲(chóng)優(yōu)選為4或5齡的家蠶幼蟲(chóng)；(4)經(jīng)重組病毒感染的家蠶BmN細(xì)胞和經(jīng)接種的家蠶幼蟲(chóng)可表達(dá)豬IFN Y -Fe融合蛋白。本發(fā)明利用上述表達(dá)系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)豬IFNy-Fc融合蛋白的優(yōu)點(diǎn)在于:1.本發(fā)明的表達(dá)方法的表達(dá)效率高，因而可大大降低豬IFNy-Fc融合蛋白的生產(chǎn)成本，并使通過(guò)基因工程方法大規(guī)模生產(chǎn)豬IFN Y-Fe融合蛋白成為可能。2.這一表達(dá)系統(tǒng)為真核表達(dá)系統(tǒng)，其表達(dá)的外源蛋白質(zhì)可進(jìn)行翻譯后修飾，使目的蛋白在生化性質(zhì)和生物活性與天然產(chǎn)品類似，從而為所表達(dá)的豬IFNy-Fc融合蛋白具有正確的蛋白結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性提供了保證。3.與天然豬IFNy相比，本發(fā)明的豬IFNy-Fc融合蛋白增加了 Fe蛋白片段，延長(zhǎng)了豬IFNy-Fc融合蛋白的半衰期，增加了其在體內(nèi)發(fā)揮效應(yīng)的時(shí)間和整體免疫調(diào)節(jié)作用。此夕卜，F(xiàn)e片段可以起到蛋白標(biāo)簽的作用，有利于后期目的蛋白純化及豬IFNy-Fc融合蛋白注射劑的制備。4.家蠶體內(nèi)有多種天然蛋白質(zhì)保護(hù)劑，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物有保護(hù)作用，使基因表達(dá)產(chǎn)物十分穩(wěn)定，而且家蠶是可以無(wú)菌大規(guī)模飼養(yǎng)經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，可以低成本地大規(guī)模飼養(yǎng)，而蠶蛹也是中藥中的一味常用中藥，所以，本發(fā)明的通過(guò)家蠶表達(dá)的豬IFNy-Fc融合蛋白不僅可以經(jīng)過(guò)進(jìn)一步純化后制備注射用制劑，而且也可以不經(jīng)過(guò)純化而經(jīng)過(guò)病毒滅活后直接添加到禽畜(如雞、豬)的飼料中去。


圖1:總實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程圖。圖2-a、圖2-b:豬IFN Y -Fe原始基因序列與豬IFN Y -Fe第一優(yōu)化基因序列優(yōu)化前后在家蠶表達(dá)宿主中CAI指數(shù)。其中，圖2-a表示優(yōu)化前的豬IFN Y -Fe原始基因序列在家蠶表達(dá)宿主中CAI指數(shù)為0.88 ;圖2-b表示優(yōu)化后的豬IFN Y -Fe第一優(yōu)化基因序列在家蠶表達(dá)宿主中CAI指數(shù)為 0.89。圖3-a、圖3-b:豬IFN Y -Fe原始基因序列與豬IFN Y -Fe第一優(yōu)化基因密碼子在家蠶表達(dá)宿主中最優(yōu)密碼子頻率分布區(qū)域圖其中，圖3-a表示優(yōu)化前的豬IFNy-Fc原始基因序列在家蠶表達(dá)宿主中最優(yōu)密碼子頻率分布區(qū)域圖，優(yōu)化前的序列低頻密碼子出現(xiàn)百分比為1% ;圖3-b表示優(yōu)化后的豬IFN Y-Fe第一優(yōu)化基因密碼子在家蠶表達(dá)宿主中最優(yōu)密碼子頻率分布區(qū)域圖，優(yōu)化后的序列低頻密碼子出現(xiàn)百分比為O。圖4-a、圖4-b:豬IFN Y -Fe原始基因序列與豬IFN Y -Fe第一優(yōu)化基因密碼子在家蠶表達(dá)宿主中GC含量分布區(qū)域圖其中，圖4-a表示優(yōu)化前的豬IFN Y -Fe原始基因序列在家蠶表達(dá)宿主中GC含量為45.98% ;圖4-b表示優(yōu)化后的豬IFN Y -Fe第一優(yōu)化基因密碼子在家蠶表達(dá)宿主中GC含量為 47.75%。圖5-a、圖5-b:豬IFN Y -Fe原始基因序列與豬IFN Y -Fe第一優(yōu)化基因在家蠶表達(dá)宿主中mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖其中，圖5-a表示優(yōu) 化前的豬IFN Y -Fe原始基因序列mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖；圖5-b表示豬IFN Y -Fe第一優(yōu)化基因進(jìn)行了優(yōu)化，去掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)、剪切位點(diǎn)、內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)之后mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖。圖6:重組pFastBac-(IFN Y-Fe)轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建不意圖。圖7:人工合成的pVL1393-(IFNY-Fc)質(zhì)粒為模板的豬IFN Y-Fe第一優(yōu)化基因的PCR擴(kuò)增圖。其中，泳道I為經(jīng)PCR擴(kuò)增的豬IFN Y -Fe第一優(yōu)化基因，在1200和1400bp中間出現(xiàn)目的條帶；泳道2為200bp DNA ladder。圖8:pFastBac_(IFNy-Fc)的BamH I和Hind III的雙酶切鑒定圖。其中泳道I為pFastBac-(IFN Y-Fe)經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切后的條帶，5000bp處的為pFastBac Dual條帶，1300bp處的為豬IFN Y -Fe第二優(yōu)化基因條帶；泳道2為陽(yáng)性對(duì)照的原始pFastBac Dual質(zhì)粒；泳道3為陽(yáng)性對(duì)照的豬IFN Y -Fe第二優(yōu)化基因的PCR條帶；泳道4 為 200bp DNA ladder。圖9 =Bacmid-(IFNy-Fc)重組質(zhì)粒利用M13引物的PCR鑒定圖。其中泳道I為未轉(zhuǎn)座的重組Bacmid，在300bp出現(xiàn)條帶；泳道2為已成功轉(zhuǎn)座的重組Bacmid-(IFN Y-Fe)，在4000bp處出現(xiàn)目的條帶；泳道3為200bp DNA ladder。圖10-a、圖10-b:在100X的顯微鏡下BmN細(xì)胞感染重組桿狀病毒BmNPV-(IFNy-Fc)前后細(xì)胞形態(tài)比較。圖10_a為未感染病毒的BmN細(xì)胞，細(xì)胞呈圓梭狀貼壁生長(zhǎng)；圖ΙΟ-b為感染BmNPV-(IFN Y-Fe)病毒72小時(shí)后的BmN細(xì)胞，細(xì)胞變圓，細(xì)胞核膨大，細(xì)胞失去貼壁性能而懸浮于培養(yǎng)基中。
圖11:家蠶BmN細(xì)胞和家蠶幼蟲(chóng)表達(dá)豬IFNy-Fc融合蛋白的PCR鑒定。其中泳道I為以表達(dá)豬IFNy-Fc融合蛋白家蠶BmN細(xì)胞上清中重組桿狀病毒的基因組為模板的PCR產(chǎn)物；泳道2為以表達(dá)豬IFN Y -Fe融合蛋白家蠶幼蟲(chóng)蠶血基因組為模板的PCR產(chǎn)物；泳道 3 為 200bp DNA ladder。圖12:家蠶BmN細(xì)胞和家蠶幼蟲(chóng)表達(dá)的豬IFN Y -Fe融合蛋白的westernblotting鑒定。使用的一抗為鼠抗IFN Y抗體，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠的IgG。其中I為10-230kD范圍的預(yù)染Protein ladder ；2為感染BmNPV-(IFNy)病毒72小時(shí)后的BmN細(xì)胞；3為家蠶幼蟲(chóng)感染BmNPV-(IFNY)病毒72小時(shí)后的家蠶血液。
具體實(shí)施例實(shí)驗(yàn)材料:1.菌株與載體:大腸桿菌 E.coli DH5a、DH10Bac 和 pVL1393 載體購(gòu)自 Invitrogen公司。載體pFastBac Dual、家蠶BmN細(xì)胞由蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院貢成良教授惠贈(zèng)；家蠶品種為青松皓月，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所提供。2.酶與試劑:DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶為NEB公司產(chǎn)品。3.生化試劑:IPTG、X_Gal為Sigma公司產(chǎn)品。過(guò)硫酸銨、TEMED、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、低熔點(diǎn)瓊脂糖為Promega公司產(chǎn)品。慶大霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素購(gòu)自上海生物工程有限公司。Lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen公司。鼠抗IFN Y —抗購(gòu)自ThermoScientific公司、羊抗鼠的IgG 二抗購(gòu)自Sigma公司。胎牛血清購(gòu)自Gibco公司。細(xì)胞培養(yǎng)基TC-100購(gòu)自Applichem 公司；魯米諾/增強(qiáng)劑溶液和穩(wěn)定型過(guò)氧化物溶液購(gòu)自ThermoScientific 公司。4.培養(yǎng)基:大腸桿菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、l%NaCl，pH7.0)；家蠶細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的TC-100。實(shí)施例一、豬IFNy-Fc融合蛋白的cDNA基因設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank 已公開(kāi)的 Sus scrofa breed Fengjing interferon gamma 的 cDNA序列(GenBank序列登錄號(hào):EU249804.1)，在該序列的3’端的終止密碼子之前添加Fe片段標(biāo)簽，所述Fe 片段的基因由 Sus scrofa IgG heavy chain (GenBank 登錄號(hào):ΝΜ_213828.I)中鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)的cDNA序列組成，所得序列記為豬IFN Y -Fe原始基因序列。再根據(jù)家蠶表達(dá)系統(tǒng)的特性對(duì)該基因序列進(jìn)行了整體優(yōu)化，優(yōu)化后的基因序列記為豬IFNy-Fc第一優(yōu)化基因序列1如SEQ ID NO:1所示。優(yōu)化后的豬IFN Y -Fe第一優(yōu)化基因序列更適合于家蠶表達(dá)系統(tǒng)，主要體現(xiàn)在下面幾方面:1.基因序列的密碼子適應(yīng)指數(shù)CAI (Codon Adaptation Index)由圖2-a可知，優(yōu)化前的豬IFNy-Fc原始基因序列的cDNA基因序列在家蠶表達(dá)宿主中CAI為0.88。由圖2-b可知，經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化后，使得豬IFNy-Fc第一優(yōu)化基因的cDNA基因序列在家蠶表達(dá)宿主中CAI指數(shù)達(dá)到0.89。通常CAI=I時(shí)被認(rèn)為該基因在該表達(dá)系統(tǒng)中是最理想的高效表達(dá)狀態(tài)，CAI指數(shù)越低表明該基因在該宿主中表達(dá)水平越差。本發(fā)明通過(guò)密碼子優(yōu)化提高了 CAI指數(shù)，從而提高本發(fā)明豬IFN Y -Fe第一優(yōu)化基因在家蠶表達(dá)宿主中的表達(dá)水平。
2.最優(yōu)密碼子頻率分布區(qū)域圖 FOP(Frequency of Optimal Codons)由圖3_a可知,基于家香宿主的表達(dá)載體,優(yōu)化如的豬IFN Y-Fe原始基因序列的低頻密碼子(遺傳密碼有64種，但是絕大多數(shù)生物傾向于利用這些密碼子中的一部分。那些被最頻繁利用的稱為最佳密碼子(optimal codons)，那些不被經(jīng)常利用的稱為稀有密碼子、低頻密碼子或利用率低的密碼子(rare or low-usage codons))出現(xiàn)百分比為1% ;未進(jìn)行優(yōu)化的基因采用串聯(lián)低頻密碼子，這些密碼子可能降低翻譯效率，甚至能夠解散翻譯裝配物。由圖3-b可知，經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化之后的豬IFN Y-Fe第一優(yōu)化基因在家蠶表達(dá)系統(tǒng)中出現(xiàn)稀有密碼子的頻率為O。3.GC 含量調(diào)整(GC Content Adjustment)GC含量理想分布區(qū)域?yàn)?0%_70%，在這個(gè)區(qū)域外的出現(xiàn)任何峰都會(huì)不同程度地影響轉(zhuǎn)錄和翻譯效率。由圖4-a可知:優(yōu)化前的豬IFN Y -Fe原始基因序列的GC堿基平均含量45.98%，優(yōu)化中減少了基因序列中的GC含量以進(jìn)一步延長(zhǎng)mRNA的半衰期，由圖和4_b可知:最終得到優(yōu)化后的豬IFN Y -Fe第一優(yōu)化基因的GC堿基平均含量為47.75%。4.豬IFN Y -Fe融合蛋白在家蠶表達(dá)宿主中mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)示意5-a為優(yōu)化前的豬IFNy-Fc原始基因序列的mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖；在序列的優(yōu)化過(guò)程中去掉了序列中的發(fā)卡結(jié)構(gòu)、剪切位點(diǎn)、內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列等，優(yōu)化之后的豬IFNy-Fc第一優(yōu)化基因的mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖如圖5_b。人工合成優(yōu)化得到的豬IFNY-Fc第一優(yōu)化基因之后，將該基因亞克隆至轉(zhuǎn)移載體PVL1393中，所得質(zhì)粒記為pVL1393-(IFNy-Fc)質(zhì)粒。實(shí)施例二、重纟目轉(zhuǎn)移載體DFastBac-QFN Y -Fe)的構(gòu)律1.PCR擴(kuò)增豬IFN Y -Fe第二優(yōu)化基因產(chǎn)物以人工合成的pVL1393-(IFN Y-Fe)質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增去掉IFNy自身所帶的23個(gè)氨基酸信號(hào)肽，添加適合昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)的系統(tǒng)gp64信號(hào)肽，所得基因序列記為豬IFN Y-Fe第二優(yōu)化基因，該基因序列如SEQ ID NO:2所示。具體如下:使用引物如下:正向引物1:5’_CGCGGATCCATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATT CTGCCTTTGCGCAAGCCCCTTTCTTCAAAGA-3’，反向引物1: 5 ’ -CCCAAGCTTTTATTTTCCTTGGGTCTTGCT-3，。上游引物含BamH I酶切位點(diǎn)及gp64信號(hào)肽序列，下游引物包含Hind III的酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系如下:10 X PCR緩沖液5 μ L，2.5mM dNTP混合物4 μ L,10yM正反向引物各加I μ L,模板I μ L, DNA聚合酶0.25 μ L,加滅菌雙蒸水補(bǔ)足體積至50 μ L。PCR擴(kuò)增條件為:94°C熱變性4min ;94°C變性45s，52°C退火30s，72°C延伸lmin，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 C延伸IOmin后于4 C保溫。2.PCR產(chǎn)物的純化`將PCR擴(kuò)增得到產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出得到約1300bp左右的DNA片段(如圖7所示)。在紫外下用滅菌的手術(shù)刀切取含相應(yīng)DNA片段的凝膠，然后用TIANGEN公司的凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化。方法如下:切取凝膠片段并稱重，將其放入滅菌的1.5ml小離心管中，加入3倍(v/w)體積的溶膠液，50°C放置IOmin使膠充分溶解。將膠溶液冷卻至室溫后放入吸附柱，加入含無(wú)水乙醇的漂洗液洗2次。將漂洗液除盡之后加入30 μ L的洗脫緩沖液洗脫DNA。3.酶切與連接反應(yīng)酶切反應(yīng):純化后的DNA用BamH I和Hind III雙酶切，酶切體系如下:10Χ緩沖液5 μ L，PCR產(chǎn)物10 μ L,BamH I1.5μ L,Hind II11.5 μ L，補(bǔ)足滅菌雙蒸水至總體積50 μ L。將反應(yīng)體系混合均勻之后置于37°C酶切3h。將pFastBac Dual質(zhì)粒作同樣的酶切反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束用1%的瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目的片段并進(jìn)行純化。連接反應(yīng):將雙酶切后的PCR產(chǎn)物和pFastBac Dual質(zhì)粒采用T4連接酶連接，連接體系如下:10 X緩沖液2 μ L，PCR產(chǎn)物10 μ L，pFastBac Dual質(zhì)粒3 μ L，T4連接酶I μ L，補(bǔ)足滅菌雙蒸水至總體積20 μ L0將反應(yīng)體系混合均勻之后于16°C連接過(guò)夜。4.大腸桿菌的轉(zhuǎn)化用75mM CaCl2制備大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞。取步驟3中制備的連接反應(yīng)產(chǎn)物5 μ L，加入到100 μ L的感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min后42°C水浴熱激90s。將熱激后產(chǎn)物迅速置于冰上冷卻3min，再加入到已溫育至37°C的900mL LB培養(yǎng)基中，37°C，220rpm震蕩復(fù)蘇Ih。取100 μ L復(fù)蘇后的菌液涂布于含100 μ g/ml氨芐青霉素(Amp)的LB固體培養(yǎng)基平板上，37 °C倒置培養(yǎng)過(guò)夜。5.重組子的鑒定從轉(zhuǎn)化的LB平板中挑取單個(gè)菌落，接種于5ml含100 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。使用TIANGEN公司的質(zhì)粒小提試劑盒，采用堿裂法裂解細(xì)胞后通過(guò)離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異 性的結(jié)合反應(yīng)溶液中的DNA。將所得質(zhì)粒經(jīng)BamH I和Hind在37°C酶切3h，用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析目的片段，發(fā)現(xiàn)重組子在5000bp處出現(xiàn)pFastBacDual的條帶，在1300bp處出現(xiàn)豬IFNy-Fc第二優(yōu)化基因條帶(如圖8所示)。將雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命名為PFastBac-(IFNY-Fc)。本發(fā)明中也可人工合成豬IFNY-Fc第二優(yōu)化基因，并將該基因直接亞克隆至PFastBacDual載體中；或?qū)⑷斯ず铣韶i的IFNy-Fc第一優(yōu)化基因直接亞克隆至pFastBacDual載體中。并基于此進(jìn)一步進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。或者，作為優(yōu)化方案，本發(fā)明中也可進(jìn)一步針對(duì)豬IFNy-Fc第二優(yōu)化基因的gp64信號(hào)肽部分進(jìn)行密碼子優(yōu)化得到豬IFN Y -Fe第三優(yōu)化基因，如SEQ ID NO:3所示。人工合成豬IFN Y-Fe第三優(yōu)化基因，并將該基因直接亞克隆至pFastBac Dual載體中，基于此進(jìn)一步進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例三、桿狀病毒BmN-QFN Y -Fe)的構(gòu)律1.轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 Bacmid-(IFN Y-Fe)的構(gòu)建將5 μ L pFastBac-(IFN Y-Fe)質(zhì)粒加入到100 μ L的DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min后42°C水浴熱激90s。將熱激后產(chǎn)物迅速置于冰上冷卻3min，再加入到已溫育至37°C的900mLLB培養(yǎng)基中，37°C，220rpm震蕩復(fù)蘇lh。取100 μ L復(fù)蘇后的菌液涂布于含50 μ g/mL 卡那霉素,7 μ g/mL 慶大霉素，10 μ g/mL 四環(huán)素，100 μ g/mL X_gal 和 40 μ g/mL IPTG 的LB固體平板上于37°C培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。48h后從LB固體平板中挑取單個(gè)白色菌落加入含50 μ g/mL卡那霉素，7 μ g/mL慶大霉素，10 μ g/mL四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜擴(kuò)大培養(yǎng)。提取Bacmid基因組DNA后使用M13通用引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。所用引物如下:正向引物2:5’ -CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’反向引物2:5’ -AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’PCR反應(yīng)體系為:10XPCR緩沖液5yL，2.5mM dNTP混合物4 μ L，10 μ M正反向引物各加IuL, DNA聚合酶0.25 μ L, Bacmid基因組DNAl μ L,加滅菌雙蒸水補(bǔ)足體積至50 μ L0 PCR擴(kuò)增條件為:94°C熱變性4min ;94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸5min,進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸IOmin后于4°C保溫。將PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，從Bacmid DNA中擴(kuò)增出與理論分子量相一致的目的條帶(4000bp)(如圖9所示)，說(shuō)明已按要求正確構(gòu)建了 Bacmid，所得質(zhì)粒命名為Bacmid-(IFNY-Fc)質(zhì)粒。未正確構(gòu)建BacmidDNA的PCR擴(kuò)增僅在300bp出現(xiàn)一條帶。2.桿狀病毒 BmNPV-(IFN Y-Fe)的構(gòu)建按照Applichem公司的產(chǎn)品說(shuō)明配置I X TC-100昆蟲(chóng)培養(yǎng)基，用2M NaOH調(diào)節(jié)pH至6.2，使用0.22 μ M的微孔濾膜過(guò)濾除菌后的培養(yǎng)基補(bǔ)加10%的胎牛血清，26°C下培養(yǎng)家蠶BmN細(xì)胞。將正確Bacmid-(IFN Y-Fe)利用 Invitrogen 公司的 Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞。分別向300 μ L無(wú)血清的TC-100培養(yǎng)基中加入5 μ gBacmid-(IFN y -Fe)質(zhì)粒和18 μ L的Lipofectamine2000，室溫孵育5min。將兩者輕輕混勻后室溫靜置20min后滴加到4mL的無(wú)血清TC-100培養(yǎng)基中混勻，轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞。于26°C恒溫培養(yǎng)5h之后更換含10%胎牛血清的TC-100培養(yǎng)基，在26°C繼續(xù)恒溫培養(yǎng)4-5d。收集病毒感染后BmN細(xì)胞培養(yǎng)液，離心取上清即獲重組桿狀病毒，記為BmNPV-(IFNY-Fc)病毒，該重組桿狀病毒為Pl代重組桿狀病毒。將Pl代重組桿狀病毒BmNPV-(IFNY-Fc)感染正常生長(zhǎng)的單層家蠶BmN細(xì)胞，26°C培養(yǎng)5d后收集培養(yǎng)基上清液，獲得P2代重組桿狀病毒BmNPV- (IFN Y -Fe)。取P2代病毒感染單層家蠶BmN細(xì)胞，26°C恒溫培養(yǎng)，感染72h后BmN細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，收取病毒感染的BmN細(xì)胞培養(yǎng)基上清，獲得P3代重組桿狀病毒BmNPV- (IFN y -Fe)，4°C避光保存?zhèn)溆谩?shí)施例四、豬IFNy-Fc融合蛋白在家蠶BmN細(xì)朐中的表汰將P3代重組桿狀病毒BmNPV-(IFNy-Fc)感染正常生長(zhǎng)的單層家蠶BmN細(xì)胞，在26°C培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)。未感染病毒之前正常的BmN細(xì)胞，細(xì)胞呈圓梭狀貼壁生長(zhǎng)(如圖ΙΟ-a所示)；而B(niǎo)mN細(xì)胞感染P3代重組桿狀病毒BmNPV-(IFN Y-Fe)之后，細(xì)胞逐漸停止生長(zhǎng)，細(xì)胞變圓，細(xì)胞核膨大，72h后BmN細(xì)胞失去貼壁性能而懸浮于培養(yǎng)基中(如圖10-b所示)。經(jīng)病毒感染的BmN細(xì)胞的培養(yǎng)液中表達(dá)了大量本發(fā)明的豬IFNy-Fc融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，收集并離心培養(yǎng)基上清，即獲得P4代重組桿狀病毒BmNPV-(IFNy-Fc)。實(shí)施例五、豬IFNy-Fc融合蛋白在家蠶幼蟲(chóng)中的表汰本實(shí)驗(yàn)所用的家蠶高表達(dá)品種為青松皓月，按呂鴻聲主編的《中國(guó)養(yǎng)蠶學(xué)》(上海科學(xué)技術(shù)出版社，1991)的常規(guī) 方法進(jìn)行飼養(yǎng)。桑葉飼養(yǎng)家蠶到五齡，將蠶體表面用75%的乙醇消毒，用微量注射器分別吸取P4代重組桿狀病毒BmNPV- (IFN Y -Fe)，按每頭1.0 X IO6即5 μ L接種液中含2.0X IO7的pfu/ml的BmNPV-(IFN Y -Fe)重組病毒的量在蠶體腹節(jié)倒數(shù)第2和第3節(jié)間膜處穿刺接種重組病毒，26°C按常規(guī)桑葉飼養(yǎng)家蠶。4-5d后收集發(fā)病家蠶幼蟲(chóng)的蠶血淋巴，_20°C冰箱凍存?zhèn)溆谩?br> _9] 實(shí)施例六、表達(dá)豬IFNy-Fc融合蛋白的鑒定利用TIANGEN公司的病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒分別提取實(shí)施四例中P4代重組桿狀病毒BmNPV-(IFN Y -Fe)的基因組DNA及實(shí)施例五中的家蠶幼蟲(chóng)蠶血淋巴的基因組DNA，分別以其為模板進(jìn)行PCR基因擴(kuò)增鑒定。PCR所用引物為實(shí)施例二中所述的正向引物I和反向引物I。PCR 條件如下:94°C熱變性 4min ;94°C變性 45s，52°C退火 30s，72°C延伸 lmin，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸IOmin后于4°C保溫。取10 μ L反應(yīng)產(chǎn)物1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)以家蠶BmN細(xì)胞和家蠶幼蟲(chóng)蠶血淋巴為模板PCR的產(chǎn)物條帶出現(xiàn)在1200bp和1400bp中間，與預(yù)期大小相符(如圖11所示)。證明在家蠶BmN細(xì)胞和家蠶幼蟲(chóng)已含有可表達(dá)本發(fā)明的豬IFNy-Fc融合蛋白的第二優(yōu)化基因。向?qū)嵤├闹泻iIFN 融合蛋白的重組BmN細(xì)胞培養(yǎng)基上清及實(shí)施例五中的家蠶幼蟲(chóng)蠶血淋巴中加入2父505凝膠加樣緩沖液，1001:加熱51^11，室溫高速離心31^11。取上清于5%的濃縮膠和12%的分離膠中進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳是在濃縮膠的電壓為80V，到達(dá)分離膠之后提升電壓到120V，在溴酚藍(lán)遷移到分離膠底部時(shí)停止電泳。使用IOOmA, I小時(shí)的方法進(jìn)行半干法轉(zhuǎn)膜蛋白質(zhì)樣品從PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上固定；使用5%脫脂奶粉/TBST37°C封閉Ih ;使用1:1000稀釋的鼠抗IFN Y 一抗抗體37°C孵育Ih后，加入1:10000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗37°C孵育Ih ;加入魯米諾和穩(wěn)定型過(guò)氧化物溶液顯色后放入凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行熒光發(fā)光檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證豬IFNy-Fc融合蛋白的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)在家蠶BmN細(xì)胞和家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)的豬IFNy-Fc融合蛋白在45kD左右處都出現(xiàn)抗IFN Y抗體的特異性目的條帶(如圖12所示)，證明在家蠶BmN細(xì)胞和家蠶幼蟲(chóng)已正確表達(dá)了豬IFNy-Fc融合蛋白。經(jīng)測(cè)定BmN細(xì)胞中表達(dá)總蛋白濃度約為4.43029mg/ml ;蠶血總蛋白濃度為15.8556mg /ml。蠶血中目標(biāo)蛋白(豬IFN Y-Fe融合蛋白)占總蛋白的百分比為7.91%，即目標(biāo)蛋白(豬IFN Y -Fe融合蛋白)濃度為1.2541mg/ml。實(shí)施例七、豬IFNy-Fc融合蛋白生物學(xué)活性測(cè)定豬水泡性口炎病毒(VSV，其TCID50為5X 107/100 μ L，廣東省農(nóng)科院獸醫(yī)研究所提供)可感染豬腎細(xì)胞(ΡΚ-15，廣東省農(nóng)科院獸醫(yī)研究所提供)，本發(fā)明利用豬Y干擾素的抗病毒機(jī)制檢測(cè)在豬腎細(xì)胞在豬Y干擾素存在條件下對(duì)豬水泡性口炎病毒的防御作用，通過(guò)檢測(cè)ΡΚ-15細(xì)胞的病變情況得到豬Y干擾素對(duì)ΡΚ-15細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)曲線，從而測(cè)定本發(fā)明的豬IFNy-Fc融合蛋白的生物學(xué)活性。1.陽(yáng)性對(duì)照品溶液制備:取豬干擾素陽(yáng)性對(duì)照品(豬基因工程重組細(xì)胞因子:IFN-LLS-2，購(gòu)自香港曼普動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)品有限公司。測(cè)定其效價(jià)為5 X 104U/mL)，按說(shuō)明書復(fù)溶后，用含有6%胎牛血清的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液(Gibico產(chǎn)品)按10倍一級(jí)逐級(jí)稀釋。2.豬IFNy-Fc融合蛋白樣品溶液制備:將實(shí)施例四含豬IFNy-Fc融合蛋白的BmN細(xì)胞的培養(yǎng)液上清和實(shí)施例五中含豬IFNy-Fc融合蛋白的家蠶蠶血淋巴，并用細(xì)胞培養(yǎng)液(含有6%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液)做10倍梯度稀釋，分別得到總蛋白濃度為1.6mg/mL、1.6X 10 img/mL、1.6X 10 2mg/mL、1.6X 10 3mg/mL、1.6X 10 4mg/mL、1.6X 10 5mg/mL 的含豬IFNy-Fc融合蛋白溶液。
3.在96孔板上每孔加入不同濃度的豬IFN Y-Fe融合蛋白溶液50 μ L，再加入新鮮傳代的PK-15細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度約為1.8X 106-2.2X IO6個(gè)/mL)50 μ L，在37°C、5% CO2條件下孵育約24h后，ΡΚ-15細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至單層。吸去含豬IFNy-Fc融合蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入100 μ L含100個(gè)TCID50的VSV病毒稀釋液(用含2%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液)。同時(shí)設(shè)立病毒對(duì)照孔(只加同樣劑量的病毒，不加干擾素)和細(xì)胞對(duì)照孔(只加細(xì)胞培養(yǎng)液，不加干擾素)。37°C,5% CO2條件下培養(yǎng)24h后，待病毒對(duì)照孔的細(xì)胞病變90% —100%時(shí)觀察結(jié)果。以引起半數(shù)孔的細(xì)胞病變的干擾素的量為一個(gè)單位(記為“U”)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，陰性對(duì)照病毒組中的細(xì)胞均發(fā)生明顯病變，空白細(xì)胞對(duì)照組中細(xì)胞生長(zhǎng)正常。以引起半數(shù)孔的細(xì)胞病變的干擾素的量為一個(gè)單位(記為“U”)，通過(guò)顯微鏡觀察陽(yáng)性對(duì)照存在條件下PK-15細(xì)胞生長(zhǎng)未受VSV病毒影響的細(xì)胞數(shù)，確定陽(yáng)性對(duì)照干擾素的效價(jià)為3.2X104U/mL。顯微鏡觀察豬IFNy-Fc融合蛋白存在條件下PK-15細(xì)胞生長(zhǎng)未受VSV病毒影響的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算得到在BmN細(xì)胞中表達(dá)的豬IFN Y -Fe融合蛋白的效價(jià)為2X104U/mL，在家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)的豬IFNy-Fc融合蛋白的效價(jià)為6.4X 104U/mL，表明本發(fā)明中制備的豬IFNy-Fc融合蛋白具有顯著的抗病毒活性。
權(quán)利要求
1.種豬IFNy-Fc融合蛋白，其氨基酸序列包含有豬、干擾素蛋白序列的成熟肽部分，在豬Y干擾素蛋白序列C端的終止密碼子之前添加有Fe蛋白序列。
2.權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQID N0:4所示。
3.權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白還包括在豬Y干擾素蛋白序列的成熟肽部分之前添加的gp64信號(hào)肽序列。
4.種編碼權(quán)利要求3中所述的融合蛋白的基因，其堿基序列如SEQ ID NO:2或SEQID NO:3 所示。
5.種質(zhì)粒，所述質(zhì)粒具有權(quán)利要求4的基因。
6.權(quán)利要求5所述的質(zhì)粒,所述質(zhì)粒為Bacmid。
7.種病毒,所述病毒具有權(quán)利要求5或6中的質(zhì)粒。
8.權(quán)利要求7所述的病毒，所述病毒為BmNPV桿狀病毒。
9.種豬IFNy-Fc融合蛋白的表達(dá)方法，其特征在于，包含如下步驟: (1)將權(quán)利要求8中的桿狀病毒感染家蠶BmN細(xì)胞或穿刺接種1-5齡的家蠶幼蟲(chóng)； (2)感染的家蠶BmN細(xì)胞或者穿刺 接種的家蠶幼蟲(chóng)表達(dá)產(chǎn)生豬IFNy-Fc融合蛋白。
10.種含有如權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白的藥品或飼料。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種依據(jù)家蠶反應(yīng)系統(tǒng)優(yōu)化的豬IFNγ-Fc融合蛋白及其編碼基因和利用家蠶生物反應(yīng)器表達(dá)豬IFNγ-Fc融合蛋白的方法，屬于生物基因工程領(lǐng)域。豬干擾素γ作為一種非特異性廣譜抗病毒生物制劑在獸藥領(lǐng)域具有廣闊的藥用前景，但是與大多基因工程獸藥一樣，豬干擾素γ也存在著產(chǎn)量不足、價(jià)格昂貴、質(zhì)量參差不齊、作用時(shí)間較短等問(wèn)題。本發(fā)明利用家蠶表達(dá)體系對(duì)優(yōu)化后的豬IFNγ-Fc融合蛋白基因進(jìn)行表達(dá)，得到了表達(dá)效率較高活性較強(qiáng)的目的蛋白。此外，F(xiàn)c片段的添加延長(zhǎng)了豬干擾素γ的作用時(shí)間，增強(qiáng)了整體免疫調(diào)節(jié)作用，且便于后期純化，從而使采用基因工程方法大規(guī)模生產(chǎn)豬IFNγ-Fc融合蛋白制劑成為可能，也為開(kāi)發(fā)含有該融合蛋白的新型飼料創(chuàng)造了條件。
文檔編號(hào)A23K1/16GK103087200SQ20131003010
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月28日
發(fā)明者馬永, 錢林, 徐春林, 陳晨, 王耀方 申請(qǐng)人:江蘇眾紅生物工程創(chuàng)藥研究院有限公司, 常州京森生物醫(yī)藥研究所有限公司