專利名稱：一種同時測定轉Bt基因抗蟲棉種子發(fā)芽率、抗蟲性純度的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及轉基因植物檢測，涉及一種同時測定轉基因抗蟲棉種子發(fā)芽率、抗蟲性純度的方法，更具體的說是一種測定轉Bt基因抗蟲棉種子發(fā)芽率的同時，通過噴灑一定濃度的抗生素溶液檢測抗蟲性純度的方法。
背景技術：
轉Bt基因抗蟲棉已在生產(chǎn)上被廣泛應用，并有效地控制了棉鈴蟲的危害。然而抗蟲棉的抗蟲性純度直接影響著棉花的產(chǎn)量和品質，因此在棉花生產(chǎn)和經(jīng)營中進行棉花種子的抗蟲性檢測是必不可少的環(huán)節(jié)。早在1998年中國農業(yè)大學的王保民等就已經(jīng)開始利用雙抗夾心ELISA檢測方法對抗蟲棉Bt殺蟲晶體蛋白進行檢測研究，并取得了初步效果。王坤波等(2000年)在苗床對轉Bt基因抗蟲棉子葉用卡那霉素溶液涂抹或浸潤的方法進行了抗蟲性研究，馬麗華等(2000年)對轉Bt基因抗蟲棉子葉用卡那霉素溶液涂抹或浸潤的方法進行了田間抗蟲性研究，都取得了很好的效果。目前對轉Bt基因抗蟲棉的抗蟲性純度的常用測定方法主要有卡那霉素抗性基因田間種植檢測法和試紙條法。卡那霉素抗性基因田間種植檢測法主要是采取葉片涂抹的方法，在大田播種出苗后，用硫酸卡那霉素溶液涂抹子葉或真葉來檢測種子的抗蟲性，這種田間種植檢測的方法需要在大田種植，對于棉花種子的經(jīng)營者來說，通常需要延緩一個種植季節(jié)出售；而試紙條法則是通過檢測毒蛋白來檢測棉花中的抗蟲性，快速、簡便易行，但費用高，每百粒棉種僅試紙成本就得600-700元，因此該方法可作小范圍急用使用，大規(guī)模生產(chǎn)經(jīng)營的棉種企業(yè)或種植戶不常使用。另外，檢測轉Bt基因抗蟲棉的抗蟲性純度的方法還有PCR檢測、Southern和Northern雜交、卡那霉素抗性室內基因鑒定、Gus基因檢測、ELISA快速定量檢測等，這些方法檢測時間短，但需專業(yè)技術人員來操作，是科研單位實驗室常用的方法。上述無論哪種檢測方法都只能檢測棉花種子的抗蟲性，而對于棉花種子生產(chǎn)和銷售者來說，在進行種子抗蟲性檢測的同時還往往需要另外再通過目測法、沙床培養(yǎng)法、毛巾培養(yǎng)法、恒溫箱培養(yǎng)法等進行種子的發(fā)芽率的檢測。

發(fā)明內容
為了避免上述現(xiàn)有檢測技術的缺陷，本發(fā)明在適宜抗生素選擇壓力下，利用轉Bt基因植株帶有的新霉素磷酸轉移酶(npt II )基因作標記所編碼的產(chǎn)物可使卡那霉素等氨基糖苷類抗生素失活而能夠正常生長，而非轉Bt基因植株因不含有npt II基因作標記而不能夠正常生長的機制，發(fā)明了一種同時測定轉Bt基因抗蟲棉種子發(fā)芽率、抗蟲性純度的方法。本發(fā)明提供了一種同時測定轉Bt基因抗蟲棉種子發(fā)芽率、抗蟲性純度的方法，包括如下步驟:
1、配制0.4%-0.6%硫酸卡那霉素水溶液；2、濕沙準備:選擇干凈河沙與水按6-8:1比例拌勻備用；3、播種:將步驟2準備的濕沙均勻鋪到直徑50cm的塑料盆底部，厚度2_4cm ;在濕沙上均勻擺放待檢測的棉花種子100粒，種子間距不小于1.5cm ;然后再在種子上面覆上厚3-4cm步驟2準備的濕沙，壓實；塑料盆頂上蓋一層塑料薄膜；4、培養(yǎng):將步驟3中播好種子的塑料盆擺放在安裝日光燈的室內，光照時間12小時/天，室內溫度20°C -30°C ;第3天揭掉塑料薄膜，在濕沙表面均勻噴灑300mL步驟I中制備的硫酸卡那霉素水溶液;第5天開始每隔2-3天給濕沙噴水，防止?jié)裆潮砻孀兏桑坏?天統(tǒng)計發(fā)芽率，第13-15天觀察抗蟲性。苗勢壯、葉色深綠的為抗蟲株；苗勢弱、子葉有黃斑或子葉全部變黃的為非抗蟲植株。步驟I中配制的是0.4%的硫酸卡那霉素水溶液。 步驟2中選擇干凈河沙與水按7:1比例拌勻備用。步驟3中將步驟2所述的濕沙均勻鋪到直徑50cm的塑料盆底部，厚度3cm ;在濕沙上均勻擺放待檢測的棉花種子100粒，種子間距為1.5cm ;然后再在種子上面再覆上厚3cm步驟2所述的濕沙，壓實；用一層塑料薄膜封住盆口。步驟4中所述的室內溫度為26V。本發(fā)明的有益效果在于:1、操作簡單易行:設備簡單，一般人員都能操作；2、費用低，檢測100粒棉種所用試劑費用約為試紙條法的1.5% ;3、本發(fā)明在檢測轉Bt基因棉花種子發(fā)芽率的同時可以檢測棉花種子的抗蟲性純度；4、本方法的檢測準確度達到100%。下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
具體實施例方式實施例中所用硫酸卡那霉素粉劑(純度100%)購于上海生工生物工程技術服務有限公司，所用轉Bt基因抗蟲棉品種冀1316和非抗蟲棉品種冀棉25的種子均由本所提供。實施例1:噴灑0.4%的硫酸卡那霉素水溶液測定轉Bt基因抗蟲棉種子發(fā)芽率的同時測定抗蟲性純度1,0.4%硫酸卡那霉素水溶液的配制:稱取硫酸卡那霉素粉末試劑4g、蒸餾水1L，配制成0.4%的硫酸卡那霉素水溶液；2、濕沙的準備:選擇干凈河沙與水按7:1比例拌勻備用，濕沙以手攥能成團，松開后微散為宜；3、播種:將步驟2準備的濕沙均勻鋪到直徑50cm的塑料盆底部，厚度3cm ;在不同所料盆的濕沙上均勻擺放轉Bt基因抗蟲棉冀1316種子和非抗蟲棉品種冀棉25的種子各100粒，種子間距1.5cm ;然后再在種子上面覆上厚3cm步驟2準備的濕沙，壓實；用一層塑料薄膜封住盆口；4、培養(yǎng):將步驟3中播好種子的塑料盆擺放在安裝日光燈的室內，光照時間12小時/天，室內溫度26°C ;第3天揭掉塑料薄膜，在濕沙表面均勻噴灑300mL步驟I中制備的硫酸卡那霉素水溶液，以噴灑蒸餾水為對照；第5天開始每隔2天給濕沙噴水，防止?jié)裆潮砻孀兏?第7天開始觀察發(fā)芽率，第14天觀察抗蟲性。
統(tǒng)計處理組和對照組的種子的發(fā)芽率。結果處理組和對照組中的轉Bt基因抗蟲棉冀1316種子有89粒種子發(fā)芽長成植株，非轉Bt基因抗蟲棉冀棉25種子中有86粒種子發(fā)芽長成植株，說明轉Bt基因抗蟲棉冀1316種子發(fā)芽率為89%，非轉Bt基因抗蟲棉冀棉25種子發(fā)芽率為86%。觀察處理組和對照組抗蟲性，發(fā)現(xiàn)轉Bt基因抗蟲棉冀1316種子所有出苗長成的植株均苗勢壯、葉色深綠，初步判斷冀1316種子抗蟲性純度為100%。而非轉Bt基因抗蟲棉冀棉25種子噴灑了硫酸卡那霉素水溶液的所有植株苗勢弱、子葉有黃斑或全部變黃，說明冀棉25對硫酸卡那霉素水溶液敏感，不抗蟲，噴灑蒸餾水的冀棉25種子所有出苗長成的植株均苗勢壯、葉色深綠。實施例2:噴灑0.45%的硫酸卡那霉素水溶液測定轉Bt基因抗蟲棉種子發(fā)芽率的同時測定抗蟲性純度按實施例1步驟I中的方法配制0.45%硫酸卡那霉素水溶液，步驟3中在塑料盆底部均勻鋪上2cm厚的濕沙，步驟4中培養(yǎng)溫度為30°C并第15天觀察抗蟲性，其余步驟與實施例1相同。統(tǒng)計處理組和對照組的種子的發(fā)芽率。結果處理組和對照組中的轉Bt基因抗蟲棉冀1316種子有88粒種子發(fā)芽長成植株，非轉Bt基因抗蟲棉冀棉25種子中有86粒種子發(fā)芽長成植株，說明轉Bt基因抗蟲棉冀1316種子發(fā)芽率為88%，非轉Bt基因抗蟲棉冀棉25種子發(fā)芽率為86%。觀察處理組和對照組抗蟲性，發(fā)現(xiàn)轉Bt基因抗蟲棉冀1316種子所有出苗長成的植株均苗勢壯、葉色深綠，初步判斷冀1316種子抗蟲性純度為100%。而非轉Bt基因抗蟲棉冀棉25種子噴灑了硫酸卡那霉素水溶液的所有植株苗勢弱、子葉有黃斑或全部變黃，說明冀棉25對硫酸卡那霉素水溶液敏感，不抗蟲，噴灑蒸餾水的冀棉25種子所有出苗長成的植株均苗勢壯、葉色深綠。實施例3:噴灑0.5%的硫酸卡那霉素水溶液測定轉Bt基因抗蟲棉種子發(fā)芽率的同時測定抗蟲性純度按實施例1步驟I中的方法配制0.5%硫酸卡那霉素水溶液，步驟2中選擇干凈河沙與水按8:1比例拌勻備用，步驟3中在塑料盆底部均勻鋪上4cm厚的濕沙，步驟4中培養(yǎng)溫度為20°C并第15天觀察抗蟲性，其余步驟與實施例1相同。統(tǒng)計處理組和對照組的種子的發(fā)芽率。結果處理組和對照組中的轉Bt基因抗蟲棉冀1316種子有89粒種子發(fā)芽長成植株，非轉Bt基因抗蟲棉冀棉25種子中有85粒種子發(fā)芽長成植株，說明轉Bt基因抗蟲棉冀1316種子發(fā)芽率為89%，非轉Bt基因抗蟲棉冀棉25種子發(fā)芽率為85%。觀察處理組和對照組抗蟲性，發(fā)現(xiàn)轉Bt基因抗蟲棉冀1316種子所有出苗長成的植株均苗勢壯、葉色深綠，初步判斷冀1316種子抗蟲性純度為100%。而非轉Bt基因抗蟲棉冀棉25種子噴灑了硫酸卡那霉素水溶液的所有植株苗勢弱、子葉有黃斑或全部變黃，說明冀棉25對硫酸卡那霉素水溶液敏感，不抗蟲，噴灑蒸餾水的冀棉25種子所有出苗長成的植株均苗勢壯、葉色深綠。實施例4:噴灑0.55%的硫酸卡那霉素水溶液測定轉Bt基因抗蟲棉種子發(fā)芽率同時測定抗蟲性純度按實施例1步驟I中的方法配制0.55%硫酸卡那霉素水溶液，步驟2中選擇干凈河沙與水按6:1比例拌勻備用，步驟3 中在塑料盆底部均勻鋪上3cm后的濕沙，步驟4中培養(yǎng)溫度為25°C并第13天觀察抗蟲性，其余步驟與實施例1相同。
統(tǒng)計處理組和對照組的種子的發(fā)芽率。結果處理組和對照組中的轉Bt基因抗蟲棉冀1316種子有89粒種子發(fā)芽長成植株，非轉Bt基因抗蟲棉冀棉25種子中有86粒種子發(fā)芽長成植株，說明轉Bt基因抗蟲棉冀1316種子發(fā)芽率為89%，非轉Bt基因抗蟲棉冀棉25種子發(fā)芽率為86%。觀察處理組和對照組抗蟲性，發(fā)現(xiàn)轉Bt基因抗蟲棉冀1316種子所有出苗長成的植株均苗勢壯、葉色深綠，初步判斷冀1316種子抗蟲性純度為100%。而非轉Bt基因抗蟲棉冀棉25種子噴灑了硫酸卡那霉素水溶液的所有植株苗勢弱、子葉有黃斑或全部變黃，說明冀棉25對硫酸卡那霉素水溶液敏感，不抗蟲，噴灑蒸餾水的冀棉25種子所有出苗長成的植株均苗勢壯、葉色深綠。實施例5:噴灑0.6%的硫酸卡那霉素水溶液測定轉Bt基因抗蟲棉種子發(fā)芽率同時測定抗蟲性純度按實施例1步驟I中的方法配制0.6%硫酸卡那霉素水溶液，步驟2中選擇干凈河沙與水按6:1比例拌勻備用，步驟4中培養(yǎng)溫度為22°C并第13天觀察抗蟲性，其余步驟與實施例1相同。統(tǒng)計處理組和對照組的種子的發(fā)芽率。結果處理組和對照組中的轉Bt基因抗蟲棉冀1316種子有88粒種子發(fā)芽長成植株，非轉Bt基因抗蟲棉冀棉25種子中有85粒種子發(fā)芽長成植株，說明轉Bt基因抗蟲棉冀1316種子發(fā)芽率為88%，非轉Bt基因抗蟲棉冀棉25種子發(fā)芽率為85%。觀察處理組和對照組抗蟲性，發(fā)現(xiàn)轉Bt基因抗蟲棉冀1316種子所有出苗長成的植株均苗勢壯、葉色深綠，初步判斷冀1316種子抗蟲性純度為100%。而非轉Bt基因抗蟲棉冀棉25種子噴灑了硫酸卡那霉素水溶液的所有植株苗勢弱、子葉有黃斑或全部變黃，說明冀棉25對硫酸卡那霉素水溶液敏感，不抗蟲，噴灑蒸餾水的冀棉25種子所有出苗長成的植株均苗勢壯、葉色深綠。實施例6:本發(fā)明方法準確度測定試驗將轉Bt基因抗蟲棉品種冀131`6、非抗蟲棉品種冀棉25種子分成四份，于2012年4月29日-2012年6月10日分別同時利用卡那霉素抗性基因田間種植檢測法、室內培養(yǎng)基檢測法和本發(fā)明方法進行抗蟲性純度試驗，利用恒溫箱發(fā)芽率檢測法和本發(fā)明方法進行發(fā)芽率比較試驗，試驗在河北省農林科學院棉花研究所小安舍實驗站進行田間試驗和室內試驗。1.利用卡那霉素抗性基因田間種植法進行棉花種子的抗蟲性純度試驗試驗設2個處理，4月29號分別播種轉Bt基因抗蟲棉品種冀1316和非抗蟲棉品種冀棉25 ;每處理3次重復；每重復小區(qū)面積20m2，隨機區(qū)組排列。在5月25日晴朗天氣情況下，用毛筆蘸取0.2%的硫酸卡那霉素水溶液均勻涂抹棉株頂部倒數(shù)第2片真葉，每次重復隨機涂抹100株，7天后統(tǒng)計葉片黃斑株；抗蟲純度=(涂抹株數(shù)一黃斑株數(shù))/涂抹株數(shù)X 100%。結果見表I。表I卡那霉素抗性基因田間種植檢測法抗蟲性檢測試驗結果
^n f,Ιμ lM2 3 抗也純度 I
11 1 葉片黃斑株數(shù)葉片黃斑株數(shù)葉片黃斑株數(shù) (％)冀1316000100
冀 ||25100100100 ~~0~ |
2.利用室內培養(yǎng)基檢測法進行棉花種子的抗蟲性純度試驗在培養(yǎng)室中進行，配制培養(yǎng)基時每升水加瓊脂8g，調pH至6.5-6.8，消毒(120°C，30分鐘)；將培養(yǎng)基保溫至45°C左右，加入1.5_2g硫酸卡那霉素(硫酸卡那霉素可先用少量水溶解)，混勻，倒入已滅菌的250mL三角瓶中，每瓶20mL。將種子加入3%雙氧水，置于超凈工作臺上,消毒2h，隨后用滅菌水沖水2次，第3次再用滅菌水浸泡2h ;每瓶接種25粒，每100粒為I個重復，冀1316和冀棉25分別設3次重復；接種后的種子置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，溫度為30°C，濕度為70%-90%，光照為150001x ;培養(yǎng)4天后，統(tǒng)計黃葉、綠葉、未萌發(fā)和死亡種子數(shù)；抗蟲純度=綠葉數(shù)/ (接種數(shù)一未萌發(fā)數(shù)一死亡數(shù))X 100%。結果見表2。表2室內培養(yǎng)基抗蟲性檢測試驗結果: SSii MU2 Φ:$￡3 I 抗蟲純度 品種 ----------—
倉錄葉數(shù)成株數(shù)紐葉數(shù)成株數(shù)綠葉數(shù)成株數(shù) (%)
權利要求
1.一種同時測定轉Bt基因抗蟲棉種子發(fā)芽率、抗蟲性純度的方法，其特征在于包括如下步驟: ①配制0.4%-0.6%硫酸卡那霉素水溶液； ②濕沙準備:選擇干凈河沙與水按6-8:1比例拌勻備用； ③播種:將步驟②準備的濕沙均勻鋪到直徑50cm的塑料盆底部，厚度2-4cm;在濕沙上均勻擺放待檢測的棉花種子100粒，種子間距不小于1.5cm ;然后再在種子上面覆上厚3-4cm步驟②準備的濕沙，壓實；塑料盆頂上蓋一層塑料薄膜； ④培養(yǎng):將步驟③中播好種子的塑料盆擺放在安裝日光燈的室內，光照時間12小時/天，室內溫度20°C -30°C ;第3天揭掉塑料薄膜，在濕沙表面均勻噴灑300mL步驟①中制備的硫酸卡那霉素水溶液；第5天開始每隔2-3天給濕沙噴水，防止?jié)裆潮砻孀兏桑坏?天統(tǒng)計發(fā)芽率，第13-15天觀察抗蟲性；苗勢壯、葉色深綠的為抗蟲株；苗勢弱、子葉有黃斑或子葉全部變黃的為非抗蟲植株。
2.根據(jù)權利要求1所述的同時測定轉Bt基因抗蟲棉種子發(fā)芽率、抗蟲性純度的方法，其特征在于:步驟①中配制的是0.4%的硫酸卡那霉素水溶液。
3.根據(jù)權利要求1所述的同時測定轉Bt基因抗蟲棉種子發(fā)芽率、抗蟲性純度的方法，其特征在于:步驟②中選擇干凈河沙與水按7:1比例拌勻備用。
4.根據(jù)權利要求1所述的同時測定轉Bt基因抗蟲棉種子發(fā)芽率、抗蟲性純度的方法，其特征在于:步驟③中所述塑料盆底部濕沙的厚度為3cm，擺放待檢測棉花種子的間距為1.5cm，在種子上面覆蓋濕沙的厚度為3cm。
5.根據(jù)權利要求1所述的同時測定轉Bt基因抗蟲棉種子發(fā)芽率、 抗蟲性純度的方法，其特征在于:步驟④中所述的室內溫度為26°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同時測定轉Bt基因抗蟲棉種子發(fā)芽率、抗蟲性純度的方法，其特征在于包括如下步驟①配制0.4%-0.6%硫酸卡那霉素水溶液；②濕沙準備；③播種；④培養(yǎng)。本發(fā)明在適宜抗生素選擇壓力下，利用轉Bt基因植株帶有的新霉素磷酸轉移酶(nptⅡ)基因作標記所編碼的產(chǎn)物可使卡那霉素等氨基糖苷類抗生素失活而能夠正常生長，而非轉Bt基因植株因不含有nptⅡ基因作標記而不能夠正常生長的機制，在測定轉Bt基因抗蟲棉種子發(fā)芽率的同時可以檢測抗蟲性純度。本發(fā)明操作簡單易行，費用低，其檢測準確度達到100%。
文檔編號A01G7/00GK103109622SQ20131005882
公開日2013年5月22日 申請日期2013年2月25日 優(yōu)先權日2013年2月25日
發(fā)明者王凱輝, 郭寶生, 耿軍義, 劉素恩, 趙存鵬, 馬玉柱, 耿香利, 劉敏彥 申請人:河北省農林科學院棉花研究所