專利名稱：一種用生物組織培養法制備苤藍的方法
技術領域：
本發明涉及一種植物組培方法，屬于生物技術領域，具體地說是一種用生物組織培養法制備苤藍的方法。
背景技術：
苯藍{Brassica oleraces var.carlorapa),又名球莖甘藍、擘藍等。據營養學家分析，每500g苯藍中含蛋白質5.9g、糖llg、粗纖維4.lg、灰分3.3g、.丐81mg、磷122mg、鐵1.lmg、胡蘿卜素微量、硫胺素0.19mg、核黃素0.07mg、尼克酸1.5mg、維生素C 152mg。苤藍維生素含量十分豐富，尤其是鮮品絞汁服用，對胃病有治療作；其所含的維生素C等招牌營養素，有止痛生肌的作用，能促進胃與十二指腸潰瘍的愈合；其所含大量水分和膳食纖維，可寬腸通便，防治便秘，排除毒素；苤藍還含有豐富的維生素E，有增強人體免疫功能的作用；所含微量元素鑰，能抑制亞硝酸胺的合成，因而具有一定的防癌抗癌作用。最近有報道苤藍提取物具有抗菌和抗氧化的作用，目前，苤藍的種苗繁育有播種育苗和扦插育苗兩種方法。但是，苤藍未熟抽薹問題嚴重，往往造成重大損失或嚴重影響商品質量，所以目前并未實現大規模的人工栽培。組織培養是植物細胞組織培養是指在離體條件下利用人工培養基對植物器官、組織、細胞、原生質體等進行培養，使其長成完整的植株。由于組織培養法繁殖作物的突出特點是快速，因此，對一些繁殖系數低、不能用種子繁殖的“名、優、特、新、奇”作物品種的繁殖意義更大。組織培養技術在藥用植物上已經得到了大量應用，它具有外植體來源廣泛、繁殖系數高等優點，在短時間內便可獲得大量優質種苗。所以組織培養及再生體系的建立對于緩解苤藍資源開發利用與保護之間的矛盾有著重要意義。到目前為止，國內外關于苤藍組織培養方面的研究鮮見報道，本技術通過對培養基組分、激素配比及環境因子的確定，建立了苤藍完整的再生體系，為苤藍的大規?？旆奔捌溥z傳轉化研究奠定了基礎。

發明內容
本發明的目的在于提供一種用生物組織培養法制備苤藍的方法，是以苤藍葉片為外植體，經過消毒處理后，接種于誘導愈傷培養基上，待愈傷形成后，再接入分化培養基，誘導芽的形成，之后接入生根培養基，幼苗的根生長到一定程度時，進行煉苗與移栽即可；由于苤藍未熟抽薹問題嚴重，往往造成重大損失或嚴重影響商品質量，采用本發明植物組織培養法外植體來源廣泛、繁殖系數高短時間內便可獲得大量優質種苗，解決傳統種植方法出現的早抽薹現象。為實現上述目的，本發明所述一種用生物組織培養法制備苤藍的方法，其特征在于:
一、將新鮮苤藍葉片用洗潔精仔細擦洗表 面，流動水沖洗10min，75%乙醇消毒30s，0.1 0.2%升汞消毒5 12min并加2 4滴吐溫80，再用含有0.2%的Na2S2O3無菌水清洗3 5遍；
二、將消毒后的苤藍葉片切成小塊作為外植體，接種于基礎培養基MS+3%蔗糖+NAA
0.05 3.0mg/L+6-BA0.01 2.0mg/L+2.4-D 0.01 2.0mg/L 進行愈傷誘導，同時添加水解酪蛋白100mg/L+0.2%聚丙三醇棕櫚酸酯作為抗褐化劑；
三、愈傷形成后，轉入增殖培養基，增殖培養基為基礎培養基MS+NAA0.05 3.0mg/L+IBA 0.05 3.0mg/L+6-BA 0.01 2.0mg/L,或基礎培養基 B5+TDZ 0.005 2.0mg/L+GA3 0.05 1.0mg/L誘導芽形成及叢芽的增殖；
四、生根培養基選用基礎培養基B5+0.05 3.0mg/L ΝΑΑ+0.05 3.0mg/L IBA ；
五、當幼苗的根長到2 3cm，幼苗形體已顯健壯時，將幼苗取出，在清水中洗凈附著在根上的培養基，將洗凈的幼苗排好，用清水噴濕，然后分別以石英砂:草炭土:腐殖質為基質，在溫度20 25°C，濕度60 80%的條件下煉苗5 30天，煉苗后，將幼苗移栽入大田即可。所述苤藍的葉片切塊大小為0.8 1.2cm2 ；
所述苤藍葉片在9 20°C，1500 2500Lux，20 60天愈傷誘導率40 60%，可利用愈傷為20 30% ；
所述愈傷出芽在9 20°C，1500 3000Lux，20 60天，出芽率20 40% ；
所述叢芽增殖繁殖比1: 15 25 ;
所述單苗高23cm，47片葉在19 24°C，2000 3000Lux，830天生長出58條根長I 2cm白根，生根率90 100% ；
所述基質石英砂:草炭土:腐殖質為1:1:1。
本發明所述的一種用生物組織培養法制備苤藍的方法，其有益效果在于:在本發明中，分別選用聚丙三醇棕櫚酸酯和Na2S2O3作抗褐化劑，有效的解決了苤藍在生長過程中易未熟抽薹，造成重大損失或嚴重影響商品質量的問題，以及愈傷誘導過程中的褐化現象，在出芽培養時使用NAA+IBA+6-BA或TDZ+GA3的組合使出芽和擴繁率有所提高，并且煉苗采用石英砂+腐殖植+草炭土為基質，不僅通氣、保水性好，又有充足的營養，充分滿足苤藍幼苗生長需求，使成活率達到95%。
具體實施例方式以下實施例為本發明作進一步出闡述。實施例1
一、將苤藍新鮮葉片用洗潔精仔細擦洗表面，流動水沖洗10min，75%乙醇消毒30s，
0.2%升汞消毒5min并加2滴吐溫80，再用含有0.2%的Na2S2O3無菌水清洗3遍；
二、將消毒后的苤藍其葉片切成0.Scm2的小塊作為外植體，接種于培養基上進行愈傷誘導，培養基成分為 MS+3% 蔗糖 +NAA1.0mg/L+6-BAl.0mg/L+2.4-D 0.01mg/L 的組合，同時添加水解酪蛋白100mg/L+0.2%聚丙三醇棕櫚酸酯作為抗褐化劑；苤藍葉片在9°C，1500Lux,60天愈傷誘導率40%，可利用愈傷為20% ；
三、愈傷形成后，轉入增殖培養基，增殖培養基成分為MS+NAA1.0mg/L+IBA 1.0mg/L+6-BA 0.05mg/L，誘導芽形成及叢芽的增殖，叢芽增殖繁殖比1:25，愈傷出芽在9°C，1500Lux，60 天， 出芽率 20% ；四、待芽形成苗后，轉入生根培養基中，生根培養基選用1/2MS培養基+0.005mg/11^六，單苗高2011，4片葉在19°C，2000Lux，8天生長出5條根長I 2cm白根，生根率90%;
五、當幼苗的根長到Icm時，幼苗長出4片葉形體己顯健壯時，將幼苗取出，在清水中洗凈附著在根上的培養基(嚴格洗凈，防止爛根)，將洗凈的幼苗排好，用清水噴濕，然后分別石英砂:草炭土:腐殖質為1:1:1基質，在溫度20°C，濕度60%的條件下煉苗10天，煉苗后，將幼苗移栽入大田即可。實施例2
一、將苤藍新鮮葉片用洗衣粉仔細擦洗表面，流動水沖洗10min，75%乙醇消毒30s，
0.1%升汞消毒7min并加3滴吐溫80，再用含有0.2%的Na2S2O3無菌水清洗4遍；
二、將消毒后的苤藍其葉片切成1.0m2的小塊作為外植體，接種于培養基上進行愈傷誘導，培養基成分為 MS+3% 蔗糖 +NAA 0.05mg / L+6-BA 1.0mg/L+2.4-D 0.05mg/L 的組合，同時添加水解酪蛋白100mg/L+0.2%聚丙三醇棕櫚酸酯作為抗褐化劑，苤藍葉片在12°C，1800Lux,40天愈傷誘導率45%，利用愈傷23% ；
三、愈傷形成后，轉入增殖培養基，增殖培養基成分為B5+NAA0.05mg/L+IBA 1.0mg/L+6-BA 0.05mg/L，誘導芽形成及叢芽的增殖，叢芽增殖繁殖比1:18，愈傷出芽在12°C，1800Lux，40 天，出芽率 22% ；
四、待芽形成苗后，轉入生根培養基中，生根培養基選用1/2MS培養基+1.0mg/LIBA,單苗高3cm，5片葉在19°C，2000Lux，15天生長出6條根長I 2cm白根，生根率92% ；
五、當幼苗的根長到2cm，幼苗長出5片葉形體己顯健壯時，將幼苗取出，在清水中洗凈附著在根上的培養基(嚴格洗凈，防止爛根)，將洗凈的幼苗排好，用清水噴濕，然后分別以石英砂:草炭土:腐殖質為1:1:1為基質，在溫度22°C，濕度70%的條件下煉苗8天，煉苗后，將幼苗移栽入大田即可。實施例3
一、將苤藍新鮮葉片用洗潔精仔細擦洗表面，流動水沖洗10min，75%乙醇消毒30s，
0.15%升汞消毒5min并加2滴吐溫80，再用含有0.2%的Na2S2O3無菌水清洗4遍；
二、將消毒后的苤藍其葉片切成1.2m2的小塊作為外植體，接種于培養基上進行愈傷誘導，培養基成分為 B5+3% 蔗糖 +NAA 2.0mg/L+6-BA 0.05mg/L+2.4-D 0.08mg/L 的組合，同時添加水解酪蛋白100mg/L+0.2%聚丙三醇棕櫚酸酯作為抗褐化劑，苤藍葉片在15°C，2000Lux，30天愈傷誘導率50%，可利用愈傷為25% ；
三、愈傷形成后，轉入增殖培養基，增殖培養基成分為B5+NAA2.0mg/L+IBA 2.0mg/L+6-BA 1.0mg/L，誘導芽形成及叢芽的增殖，叢芽增殖繁殖比1:20，愈傷出芽在15°C，2000Lux，40 天，出芽率 30% ；
四、待芽形成苗后，轉入生根培養基中，生根培養 基選用B5培養基+2.0mg/L IBA，單苗高2.5cm，6片葉在19°C，2000Lux，18天生長出7條根長I 2cm白根，生根率95% ；
五、當幼苗的根長到2cm，幼苗長出5片葉形體己顯健壯時，將幼苗取出，在清水中洗凈附著在根上的培養基(嚴格洗凈，防止爛根)，將洗凈的幼苗排好，用清水噴濕，然后分別以石英砂:草炭土:腐殖質為1:1:1為基質，在溫度25°C，濕度75%的條件下煉苗20天，煉苗后，將幼苗移栽入大田即可。
權利要求
1.一種用生物組織培養法制備苤藍的方法，其特征在于: ①將新鮮苤藍葉片用洗潔精仔細擦洗表面，流動水沖洗10min，75%乙醇消毒30s，0.1 0.2%升汞消毒5 12min并加2 4滴吐溫80，再用含有0.2%的Na2S2O3無菌水清洗3 5遍； ②將消毒后的苤藍葉片切成小塊作為外植體，接種于基礎培養基MS+3%蔗糖+NAA0.05 3.0mg/L+6-BA0.01 2.0mg/L+2.4-D 0.01 2.0mg/L 進行愈傷誘導，同時添加水解酪蛋白100mg/L+0.2%聚丙三醇棕櫚酸酯作為抗褐化劑； ③愈傷形成后，轉入增殖培養基，增殖培養基為基礎培養基MS+NAA0.05 3.0mg/L+IBA 0.05 3.0mg/L+6-BA 0.01 2.0mg/L,或基礎培養基 B5+TDZ 0.005 2.0mg/L+GA3 0.05 1.0mg/L誘導芽形成及叢芽的增殖； ④生根培養基選用基礎培養基B5+0.05 3.0mg/L ΝΑΑ+0.05 3.0mg/L IBA ； ⑤當幼苗的根長到2 3cm，幼苗形體已顯健壯時，將幼苗取出，在清水中洗凈附著在根上的培養基，將洗凈的幼苗排好，用清水噴濕，然后分別以石英砂:草炭土:腐殖質為基質，在溫度20 25°C，濕度60 80%的條件下煉苗5 30天，煉苗后，將幼苗移栽入營養土，視幼苗長勢移入大田即可。
2.如權利要求1所述一種用生物組織培養法制備苤藍的方法，其特征在于:所述苤藍的葉片切塊大小為0.8 1.2cm2。
3.如權利要求1所述一種用生物組織培養法制備苤藍的方法，其特征在于:所述苤藍葉片生長環境為9 20°C，1500 2500Lux。
4.如權利要求1所述一種用生物組織培養法制備苤藍的方法，其特征在于:所述基質石英砂:草炭土:腐殖質為1 :1:1。
全文摘要
本發明公開一種用生物組織培養法制備苤藍的方法，涉及一種植物組培方法，屬于生物技術領域。其特征在于是以苤藍葉片為外植體，經過消毒處理后，接種于誘導愈傷培養基上，待愈傷形成后，再接入分化培養基，誘導芽的形成，之后接入生根培養基，幼苗的根生長到一定程度時，進行煉苗與移栽。其有益效果在于在本發明中，分別選用聚丙三醇棕櫚酸酯和Na2S203作抗褐化劑，有效的解決了苤藍在生長過程中易未熟抽薹，造成重大損失或嚴重影響商品質量的問題。
文檔編號A01H4/00GK103141386SQ20131006416
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月1日 優先權日2013年3月1日
發明者康建國 申請人:康建國