一種解淀粉芽孢桿菌的培養方法及用途
【專利摘要】本發明提供一種解淀粉芽孢桿菌的培養方法，解淀粉芽孢桿菌的培養方法包括如下步驟：①固體平板培養；②液體搖瓶培養；③種子液的制備；④發酵液的制備；⑤發酵液濃縮；⑥濃縮液噴霧干燥；⑦200億活孢子/克解淀粉芽孢桿菌可濕性粉劑的制備。解淀粉芽孢桿菌用于防治煙草、番茄和辣椒等作物的青枯病，應用于農業對人畜安全性高、環境相容性好、有害生物不易產生抗藥性，污染較小。
【專利說明】一種解淀粉芽孢桿菌的培養方法及用途

【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物領域，具體涉及一種解淀粉芽孢桿菌的培養方法及用途。

【背景技術】
[0002]青枯病是由青枯雷爾氏菌，又稱茄料雷爾菌引起的世界范圍的細菌性土傳病害。病原菌極易從根系、莖部傷口侵人植株，進而危害整個維管系統引起植株萎蔫枯死。該病原菌有著廣泛的寄主范圍及地理分布，可侵染50多個種的300多種植物，包括許多具有重要經濟價值的栽培植物，其中煙草、馬鈴薯、花生、番茄、玉米、甘薯、茄子、辣椒、香蕉、草墓、桑、木麻黃、油橄欖、聚合草惟及一些貴重藥材和花卉等植物受害最為嚴重，給作物生產帶來巨大經濟損失。特別是煙草，我國是煙草種植和消費大國，也是最重要的經濟植物之一。
[0003]長期以來，煙草青枯病等作物的細菌性病害防治均以農用鏈霉素等抗生素類農藥為主，這類農藥防效不穩定，見效慢且難以達到理想的防效，更重要的是，隨著人類安全認識的不斷提升，我國已從2008年始禁止各種抗生素類和劇毒用于人和動物，高毒類農藥應用于農業生產，從而造成了防治煙草等作物細菌性病害農藥的嚴重缺乏。在微生物防治逐漸成為植物病害防治研究熱點的今天，研究開發和利用微生物農藥來防治煙草等作物的細菌性病害無疑是最佳出路。


【發明內容】

[0004]本發明要解決的技術問題是提供一種能用于防治煙草青枯病的解淀粉芽孢桿菌的培養方法。
[0005]為了解決上述技術問題，本發明提供一種解淀粉芽孢桿菌，其保藏名稱為:Baeillus amgloliquefaciens。
[0006]本發明從秦嶺烤煙葉面上分離得到一株優勢芽孢桿菌作為試驗菌種，對其進行了16SrRNA、atPA基因序列分析，鑒定結果表明，該細菌屬于解淀粉芽孢桿菌，其分類命名為Bacillus amgloliquefaciens。
[0007]進一步的，解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amgloliquefaciens)的形態學和生理化性質特征為:菌體呈桿狀，革蘭氏陽性，芽孢橢園形，中生或端生，不膨大，大小為
0.7-0.8 μ m，長2-3 μ m.。常規生理生化實驗表明，是好氧菌，接觸酶，氧化酶，VP試驗呈陽性，在7%的NaCl中生長，PH5.7生長，水解淀粉，還原硝酸鹽成亞硝酸鹽。
[0008]本發明提供了上述解淀粉芽孢桿菌的培養方法，包括如下步驟:
(I)固體平板培養:用接種環蘸取解淀粉芽孢桿菌在NA固體培養基上劃線接種，于30°C培養72小時，得到菌種I，所述菌種I能在4°C以下保存三個月。
[0009](2)液體搖瓶培養:取一環菌種I接入裝有液體NA培養基的三角瓶內，于30°C、200r/min培養24小時，得到菌種II。
[0010](3)種子液的制備:根據種子量需要量，選用合適的三角瓶，按照0.05%-0.5%的比例向裝有液體NA培養基的三角瓶中接入菌種II，于30°C、200r/min培養24小時或更長時間，種子液的孢子數達到0.6X 19左右，即為種子液。
[0011](4)發酵液的制備:選用50L發酵罐，經空消后加入自制培養基，裝料系數為0.6，裝料30L，用蒸汽在121°C條件下實消0.5小時后，控制發酵溫度30土 1°C，通氣20-40L /min，轉速150-200r/min，接種量0.05%_1%，發酵40-48小時，發酵液孢子量為2 X 19個活孢子/ml時放罐，得解淀粉芽孢桿菌發酵液。
[0012]其中所述自制培養基的組分及其重量百分比為:酵母粉1%_3%，玉米粉1%_5%，葡萄糖0.8%-3%，氯化鈣0.1%-1%，豆柏粉1% -4%，消泡劑0.1-0.3%，其余為水。
[0013](5)發酵液濃縮:選用陶瓷膜過濾濃縮，膜孔徑0.05-0.2 μ m，膜面積0.2-0.5 m2，將上述發酵液27kg進行膜過濾，得濃縮液7.0kgo
[0014](6)濃縮液噴霧干燥:選用每小時脫水量為3kg的離心噴霧干燥塔，將濃縮液7.0kg進行噴霧干燥，進風溫度120-220°C，出風溫度60-90°C，約三小時后可得干粉370克，即為解淀粉枯草芽孢桿菌母藥，其孢子量為2X 111個活孢子/克。
[0015](7)200億活孢子/克解淀粉芽孢桿菌可濕性粉的制備:將上述解淀粉芽孢桿菌母藥和各種助劑進行混合，經氣流粉碎后得到200億活孢子/克解淀粉芽桿菌可濕性粉劑產品O
[0016]本發明的有益效果是:解淀粉芽孢桿菌，能產生芽孢，具有極強的抗逆性，應用于農業對人畜安全性高、環境相容性好、有害生物不易產生抗藥性，污染較小。

【具體實施方式】
[0017]下面結合具體的實施例來進一步闡述本發明。
[0018]實施例1:解淀粉芽孢桿菌的培養方法 1.1解淀粉芽孢桿菌種子液的獲得:
1.1.1解淀粉芽孢桿菌菌種活化:用接種環挑取
三環解淀粉芽孢桿菌凍干菌種于250ml三角瓶中，采用NA培養基，30°C培養18h。
[0019]NA培養基配方:蛋白胨10克，牛肉膏3克，Nacl5克，瓊脂 15 克，蒸餾水 1000ml, PH 值 7.3。
[0020]1.1.2劃線法固體平板培養:在NA培養基平板上30 V培養，培養72-120小時，長出單菌落。
[0021]1.1.3試管斜面培養:NA試管斜面，挑取上述單菌落接于試管斜面，30°C培養72-96小時，直到孢子散落。
[0022]從上述試管斜面中選用較好的菌種，用無菌水將試管斜面種子沖洗，接于裝有NA培養基的750mL三角瓶中，于30°C、搖床轉速200r/min培養24-26小時，菌體含量達到0.6 X 19個/mL左右時，即可作為種子液。
[0023]1.2解淀粉芽孢桿菌發酵液的制備:
解淀粉芽孢桿菌發酵培養基:酵母粉2.8%，玉米淀粉1.4%，葡萄糖1.0%，氯化鈣0.3%，豆柏粉3.0%，消泡劑0.14%，其余為水，調節PH 8.1~8.3。
[0024]50升全自動控制不銹鋼發酵罐進行消毒:用蒸汽121°C消毒 I小時。
[0025]向發酵罐裝料:裝料系數為0.6，加入酵母粉840克，玉米淀粉420克，葡萄糖300克，氯化鈣90克，豆柏粉900克，消泡劑42克，加入自來水22升，通入蒸汽，于1211:消毒1.0小時，體積達30升，查無雜菌。
[0026]發酵最佳參數:發酵溫度30± I°C，初始PH值為8.1~8.3，通
氣量為1: 1，攪拌轉速200r/min，接種量為1%，升溫至30°C，發酵46-48小時，孢子量為0.6X 1VmL時，即到終點，得26.5公斤的發酵液。
[0027]1.3發酵液的濃縮:
將26.5kg的發酵液裝入膜分離裝置的料液槽，采用孔徑為0.1 μ m的陶瓷膜，膜面積為
0.25 Hi2，開啟循環泵進行分離，循環3小時后得到7.0kg濃縮液。
[0028]1.4濃縮液噴霧干燥:
采用脫水量為3kg/h的離心式噴霧干燥塔，進風溫度140
V，出風溫度70°C，將7.0kg解淀粉芽孢桿菌濃縮液進行噴霧干燥，經三小時得375g解淀粉芽孢桿菌母粉，經檢測孢子量為3.4X 111活孢子/克的解淀粉芽孢桿菌母藥。
[0029]實施例2:解淀粉芽孢桿菌室內抑菌試驗
選擇的病原菌有:煙草青枯病菌、辣椒瘡痂菌、柑桔瘡痂病菌、白菜軟腐病菌、水稻白葉枯病菌、辣椒根腐病菌、馬鈴薯環腐病菌、獼猴桃潰瘍病菌、菜豆細菌性疫病菌、黃瓜細菌性角斑病菌。
[0030]選用質量體積比為100mg/L，10mg/L, lmg/L的解淀粉芽孢桿菌分別對上述病原菌進行抑菌試驗，試驗結果如下表1:
解淀粉芽孢桿菌的抑菌譜表1

【權利要求】
1.一種解淀粉芽孢桿菌，保藏名稱為:Bacillus amyloliquefaciens,其特征在于,解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amgloliquefaciens)的形態學和生理化性質特征為:菌體呈桿狀，革蘭氏陽性，芽孢橢園形，中生或端生，不膨大，大小為0.7-0.8 μ m，長2-3 μ m。常規生理生化實驗表明，是好氧菌，接觸酶，氧化酶，VP試驗呈陽性，在7%的NaCl中生長，PH5.7生長，水解淀粉，還原硝酸鹽成亞硝酸鹽； 進一步的，解淀粉芽孢桿菌的培養方法包括以下步驟:
(I)固體平板培養:用接種環蘸取解淀粉芽孢桿菌在NA固體培養基上劃線接種，于30°C培養72小時，得到菌種I。
(2)液體搖瓶培養:取一環菌種I接入裝有液體NA培養基的三角瓶內，于30°C、200r/min培養24小時，得到菌種II。
(3)種子液的制備:根據種子量需要量，選用合適的三角瓶，按照0.05%-0.5%的比例向裝有液體NA培養基的三角瓶中接入菌種II，于30°C、200r/min培養24小時或更長時間，種子液的孢子數達到0.6X 19左右，即為種子液。
(4)發酵液的制備:選用50L發酵罐，經空消后加入自制培養基，裝料系數為0.6，裝料30L，用蒸汽在121 °C條件下實消0.5-1小時后，控制發酵溫度30±1°C，通氣20-40L /min，轉速150-200r/min，接種量0.05%_1%，發酵40-48小時，發酵液孢子量為2 X 19個活孢子/ml時放罐，得解淀粉芽孢桿菌發酵液。
(5)發酵液濃縮:選用陶瓷膜過濾濃縮，膜孔徑0.05-0.2 μ m,膜面積0.2-0.5 Ilf，將上述發酵液27kg進行膜過濾，得濃縮液7.0kgo
(6)濃縮液噴霧干燥:選用每小時脫水量為3kg的離心噴霧干燥塔，將濃縮液7.0kg進行噴霧干燥，進風溫度120-220°C，出風溫度60-90°C，約三小時后可得干粉370克，即為解淀粉枯草芽孢桿菌母藥，其孢子量約為2X 111個活孢子/克。
(7)200億活孢子/克解淀粉芽孢桿菌可濕性粉的制備:將上述解淀粉芽孢桿菌母藥和各種助劑進行混合，經氣流粉碎后得到200億活孢子/克解淀粉芽桿菌可濕性粉劑產品O
2.根據權利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌，其特征在于:所述的自制培養基的組分及其重量百分比為:酵母粉1%_3%，玉米粉1%_5%，葡萄糖0.8%-3%，氯化鈣0.1%-1%，豆柏粉1%-4%，消泡劑0.1%-0.3%，其余為水，調節PH 8.1~8.3。
3.根據權利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌，其特征在于:所述的NA培養基配方:蛋白胨10克，牛肉膏3克，Nacl5克，瓊脂15克，蒸餾水1000ml，PH值7.3。
4.根據權利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌，其特征在于:所述菌種I能在4°C以下保存三個月。
5.根據權利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌，其特征在于:所述的解淀粉芽孢桿菌可以用于防治煙草、番茄和辣椒等作物的青枯病。
【文檔編號】A01N25/14GK104046576SQ201310083560
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月17日 優先權日:2013年3月17日
【發明者】張海華, 黃帶輝, 張小平 申請人:江西順泉生物科技有限公司