專利名稱：一種真空滲透輔助農桿菌介導甘蔗遺傳轉化的方法
技術領域：
本發明屬于植物生物技術領域，尤其是甘蔗愈傷組織遺傳轉化方法。
背景技術：
甘蔗是我國最為重要的糖料作物，2011/2012榨季，我國蔗糖產量為1151萬噸，蔗糖產量占到全國食糖總產的91%，可見甘蔗產業在保障全國食糖供應體系中具有至關重要的地位。但是，甘蔗種植過程中經常出現病蟲害頻繁發生、季節性干旱以及低溫冷害等問題，造成生產損失嚴重，蔗農和制糖 企業收入受損，導致我國制糖產業國際競爭力下降。因此，生產上迫切需要提高品種的產量和抗逆境脅迫能力，培育高產、高糖、高抗和高經濟收益的優良品種。甘蔗栽培種是由甘蔗屬熱帶種、細莖野生種、印度種、中國種等多個物種間的種間雜交形成的復合體，染色體數量多，基因組結構復雜。甘蔗栽培種對光周期反應敏感，一般只能在低緯度地區才能開花，而且不同基因型的開花時間相差較大，一些重要種質材料經常由于花期不育等問題難以配置雜交組合。因此，甘蔗常規雜交育種難度大，周期長，選育一個品種往往需要10年左右的時間。而且，由于甘蔗基因組大且復雜，沒有純合體，無法針對某個單一性狀進行定向回交，新選育的種質往往由于單一性狀的缺陷無法推廣應用。基因工程是定向、快速改良植物性狀的方法，通過轉基因技術在提高植物抗病蟲以及干旱、寒害等逆境脅迫方面已經有了許多成功報道。由于甘蔗是營養繁殖，Ttl代轉基因植株就可以穩定目標基因性狀，與水稻、玉米等其他作物相比，甘蔗轉基因減少了外源基因自交、純合的選育過程，更容易獲得既保持供體植株原有主要目標性狀，又對某個單一性狀進行改良的效果。因此應用轉基因技術定向改良甘蔗周期短，效果好，是甘蔗遺傳改良的重要途徑。目前甘蔗的遺傳轉化技術主要是采用基因槍法和農桿菌介導法。基因槍法雖然操作簡單，但是外源基因插入拷貝數多，易產生嵌合體，遺傳穩定性差。與基因槍轉化方法相t匕，農桿菌介導轉化方法外源基因插入的拷貝數低，對受體傷害小，設備簡單。自1998年報道農桿菌介導甘蔗遺傳轉化成功以來，農桿菌介導法在甘蔗上的應用已有多個報道。但是，目前農桿菌介導甘蔗遺傳轉化上的應用仍存在一些不足，轉化效率一般都在3%以下，轉化成本高、時間長。農桿菌介導甘蔗遺傳效率低的主要原因之一是在農桿菌菌株和甘蔗愈傷細胞侵染過程中工程菌株和愈傷細胞不能充分接觸，另外在侵染后為了將共培養后的愈傷組織上攜帶的農桿菌去除干凈，對愈傷組織要進行水洗、干燥等處理，處理過程中一方面損失了一部分轉化成功的愈傷細胞，另外對愈傷細胞的生長也有傷害，導致后期獲得轉基因植株量減少。

發明內容
本發明目的在于提供一種真空滲透輔助根癌農桿菌介導轉化甘蔗的方法，其克服現有技術的不足，提高甘蔗農桿菌遺傳轉化效率。一種真空滲透輔助農桿菌介導甘蔗心葉愈傷組織遺傳轉化的方法，包括以下步驟:
(1)甘蔗心葉胚性愈傷組織的誘導及增殖；
(2)含有目標基因的根癌農桿菌的活化與培養；
(3)真空滲透輔助農桿菌侵染甘蔗胚性愈傷組織；
(4)抗性材料的篩選與出苗；
(5)抗性材料鑒定。步驟(I)所述甘蔗心葉胚性愈傷組織的誘導及增殖方法是:
(1.0)取甘蔗莖尖生長點以上不大于6cm的幼嫩心葉作為外植體，無菌條件下，將消毒好的外植體切成0.5 2.5mm的圓盤片；
(1.1)將步驟(1.0)的外植體接種于愈傷誘導培養基上，置于26 28°C的黑暗條件下培養，挑選生長狀況良好的胚性愈傷組織繼代一次；
(1.2)挑步驟(1.1)的生長狀況良好的繼代后胚性愈傷組織轉接入新的愈傷誘導培養基上，進行活化培養；
愈傷誘導培養基是:MS + 2-4 D (I 4)mg/L +蔗糖30g/ L +瓊脂(7 9)g/ L。步驟(2)所述含有目標基因的根癌農桿菌的活化與培養方法是:
(2.0)挑取含有fer 基因的根癌農桿菌菌株EHA105的單菌落；
(2.1)將步驟(2.0)的單菌落接入含Rif 50mg/L和Kan 50mg/L的Iml YEP液體培養基中，在溫度為26 28°C、震蕩速度為200 rpm的條件下，培養3 4小時；
(2.2)取步驟(2.1)的菌液150 300 μ L，涂布于YEP固體培養基(含Rif 50 mg/L和Kan 50mg/L)上，在溫度26 28°C下暗培養24 48小時，收集YEP固體培養基上的菌體；
(2.3)將所收集的菌體轉入100 200 ml含AS 150 μ mol/L的MS液體培養基，160 200 rpm振蕩培養5 6小時，菌液的OD66tl值達到0.3 0.6為轉化工程菌液；
將制備好的轉化工程菌液分裝到三角瓶中備用。步驟(3)所述真空滲透輔助農桿菌侵染甘蔗胚性愈傷組織方法是:
(3.1)將步驟(I)活化培養3 7天后的胚性愈傷組織，放置于超凈工作臺內無菌干燥濾紙上，使表面干燥，將處理好的胚性愈傷組織轉入步驟(2.3)中裝有制備好的轉化工程菌液的三角瓶中，胚性愈傷組織和轉化工程菌液在溫度為22 28°C、震蕩速度為80 100rpm條件下共培養5 15分鐘,后放在0.02、.06 Mpa的真空壓力條件下輔助農桿菌侵染2 4分鐘，重復2 3次重復；
(3.2)步驟(3.1)菌侵染后的愈傷組織轉入覆蓋濾紙的共培養固體培養基(MS + AS150 μ mol/L)上，在溫度為21°C 24°C下暗培養2 5天；
(3.3)將步驟(3.2)中的愈傷組織轉接入恢復培養基(MS + 2,4-D (2^3) mg/L +Timentin (50^100) mg/L +蔗糖30g/L)上，在溫度為26 28 1:下暗培養5 7天。步驟(4)所述抗性材料的篩選與出苗的方法是:
(4.1)將經步驟(3.3)恢復培養后的愈傷組織轉接入篩選培養基(MS + 2，4-D(2 3)mg/L + Timentin (50 200) mg/L + PPT (1^3) mg/L + 鹿糖 30g/L), 2 周后，挑選抗性愈傷組織進行繼續篩選培養；
(4.2)分化培養，將經步驟(4.1) 2代篩選培養后的抗性愈傷組織轉接到分化培養基(MS + 6-BA (2 3)mg/L + NAA ( 0.Γθ.3)mg/L + Timentin (50 100) mg/L + PPT(Γ3) mg/L +蔗糖30g/L)上，在溫度為26 28 1:下、光強為15001ux、每天光照時間16小時的條件進行光照培養，分化出苗，獲得抗性植株；
(4.3)抗性植株培養，將步驟(4.2)的生長到2 4厘米的抗性植株轉入篩選培養基(MS + NAA (2 3)mg/L + Timentin (50 100)mg/L + PPT (I 3) mg/L + 鹿糖 30g/L)上，15天后抗性苗生根；
(4.4)生根培養，將步驟(4.3)的抗性苗轉到生根培養基進行生根培養，生根培養基為:MS + NAA (I 3)mg/L + Timentin (50 200)mg/L + PPT (I 3) mg/L + 蔗糖 50g/L,待根長3 5cm時，將瓶苗在溫室中煉苗5 7天；
(4.5)將步驟(4.4)的瓶苗假植于苗圃基質中，獲得抗性植株。步驟(5)所述抗性植株鑒定的方法是:
將獲得的抗性植株采用CTAB法提取DNA，用目標基因的特異引物進行PCR擴增，以pCAMBIA 3301質粒作為陽性對照，對抗性植株進行PCR檢測；
取PCR陽性轉基因植株葉片，提取RNA，根據目標基因特異引物進行RT-PCR分析；
取PCR陽性轉基因植株葉片，用SDS方法大量提取DNA，進行southern blot分析。本發明具有如下突出的實質性特點和顯著進步:本發明采用的真空滲透輔助農桿菌介導甘蔗遺傳轉化方法，在真空的情況下可促使農桿菌通過愈傷組織細胞間的空隙進入到深層的細胞，而且會在細胞的表面引起小傷口，致使植物分泌一些酚類物質以激活Ti質粒中T-DNA的剪切和轉移，本發明完善了農桿菌介導的甘蔗遺傳轉化體系，與普通農桿菌介導法相比，本發明顯著提高 了甘蔗的遺傳轉化率。


圖1是本發明的操作流程圖。
具體實施例方式通過以下實施例對本發明作進一步詳細說明；
參考圖1，一種真空滲透輔助農桿菌介導甘蔗心葉愈傷組織遺傳轉化的方法，包括如下步驟:
(1)甘蔗心葉胚性愈傷組織的誘導及增殖；
(2)含有目標基因的根癌農桿菌的活化與培養；
(3)真空滲透輔助農桿菌侵染甘蔗胚性愈傷組織；
(4)抗性材料的篩選與出苗；
(5)抗性植株鑒定。實施例1:
步驟(I)的甘蔗心葉胚性愈傷組織的誘導及增殖:
(1.0)以甘蔗品種粵糖00— 236為轉化受體材料，晴天，取健康甘蔗梢部剝去外層葉鞘后，經0.1%升汞溶液滅菌15 20min，用無菌水沖洗3 4次，取甘蔗莖尖頂部生長點3 5cm的幼嫩心葉作為脫毒組培用外植體。在無菌條件下，將外植體切成厚約I 2_的圓盤片，(1.1)將步驟(1.0)的外植體接種于愈傷誘導培養基(MS + 2,4-D (2^3) mg/L +蔗糖30g/ L +瓊脂8 g/ L)上，再置于26 28°C的黑暗條件下培養15天后得到胚性愈傷組織，挑選淡黃色、分散性好的胚性愈傷組織繼代培養一次，
(1.2)選取淡黃色，分散性好的繼代后胚性愈傷組織轉接入新的愈傷誘導培養基(同
1.1)上，進行活化培養。步驟(2)的含有目標基因的根癌農桿菌的活化與培養:
(2.0)挑取含有fer基因的根癌農桿菌菌株EHA105的單菌落；
(2.1)將步驟(2.0)的單菌落接入含Rif 50mg/L和Kan 50mg/L的Iml YEP液體培養基中，27 °C, 200 rpm培養條件下振蕩培養3 4小時；
(2.2)取步驟(2.1)的菌液150 300 μ L，涂布于YEP固體培養基(含Rif 50mg/L和Kan 50mg/L)上，27 V下暗培養36小時，收集YEP固體培養基上的菌體；
(2.3)將所收集的菌體轉入100 200 ml含AS 150 μ mol/L的MS液體培養基中，160 200 rpm振蕩培養5 6小時，菌液的OD66tl值達到0.3 0.6為轉化工程菌液，將制備好的轉化工程菌液分裝到三角瓶中備用。步驟(3)的真空滲透輔助農桿菌侵染甘蔗胚性愈傷組織:
(3.1)取步驟(1.2)活化培養3天的胚性愈傷組織，放置于超凈工作臺內無菌干燥濾紙上，吹風30分鐘左右至表面干燥，將處理好的胚性愈傷組織轉入步驟(2)中裝有制備好的轉化工程菌液的三角瓶中，80 rpm，22 28°C培養條件下共培養5 15分鐘；后放置于已進行無菌處理的容器中，打開三角瓶的封口膜，給予0.05 Mpa的真空壓力下輔助農桿菌侵染3分鐘，重復2次；
(3.2)將步驟(3.1)輔助農桿菌侵染的愈傷組織轉入覆蓋濾紙的共培養固體培養基(MS + AS 150 μ mol/L)上，在溫度為22°C下暗培養72小時；
(3.3)將步驟(3.2)中的愈傷組織轉接入恢復培養基(MS+ 2,4-D 3.0 mg/L +Timentin 80mg/L + 鹿糖 30g/L)上，27 °C,暗培養 7 天。步驟(4)所述抗性材料的篩選與分化出苗:
(4.1)篩選培養，將經步驟(3.3)恢復培養后的愈傷組織轉接入篩選培養基(MS +2，4-D 3.0 mg/L + Timentin 100 mg/L + PPT 2 mg/L + 鹿糖 30g/L ),2 周后，挑選抗性愈傷組織進行繼續篩選培養；
(4.2)分化培養，將經2代篩選培養后的抗性愈傷組織轉接到分化培養基(MS +6-BA 2.0 mg/L + NM 0.1 mg/L + Timentin 100 mg/L + PPT 2 mg/L + 鹿糖30g/L)上，在溫度為27°C下、光強為15001UX、每天光照時間16小時的條件進行光照培養，分化出苗，獲得抗性植株；
(4.3)抗性植株培養，將步驟(4.2)的生長到2 4厘米的抗性植株轉入篩選培養基(MS + NAA 2.0 mg/L + Timentin 100mg/L + PPT 2 mg/L + 鹿糖 30g/L)上，15 天后抗性苗生根；
(4.4)生根培養，將步驟(4.3)的抗性苗轉到生根培養基進行生根培養，生根培養基為:MS + NAA 2.0 mg/L + Timentin 100mg/L + PPT 2 mg/L + 蔗糖 50g/L，待根長 3 5cm時，將瓶苗在溫室中煉苗5 7天；
(4.5)將步驟(4.4)的瓶苗假植于苗圃基質中，獲得抗性植株，苗圃基質的中蛭石、珍珠巖和泥炭土的比例為1: 1:3。步驟(5 )抗性材料的PCR鑒定:
將獲得的抗性植株采用CTAB法提取DNA，用Bar基因的特異引物進行PCR擴增，以pCAMBIA 3301質粒作為陽性對照，對抗性植株進行PCR檢測；
取PCR陽性轉基因植株葉片，提取RNA，根據目標基因特異引物進行RT-PCR分析；
取PCR陽性轉基因植株葉片，用SDS方法大量提取DNA，進行southern blot分析。轉基因植株的抗除草劑鑒定:以除草劑Basta 40mg/L溶液涂抹轉基因植株和對照植株的頂部I 3葉片，3 5天后觀察除草劑效果，結果表明，通過本本實施的步驟I 4獲得的抗性植株具 有抗除草劑Basta 40mg/L性能。實施例2:
本實施例的各步驟與實施例1相同，本實施例與實施例1的區別在于:
步驟(3)的真空滲透輔助農桿菌侵染甘蔗胚性愈傷組織:
(3.1)取步驟(1.2)活化培養3天的胚性愈傷組織，放置于超凈工作臺內無菌干燥濾紙上，吹風30分鐘左右至表面干燥，將處理好的胚性愈傷組織轉入步驟(2)中裝有制備好的轉化工程菌液的三角瓶中，80 rpm，22 28°C培養條件下共培養5 15分鐘；后放置于已進行無菌處理的容器中，打開三角瓶的封口膜，給予0.04 Mpa的真空壓力下輔助農桿菌侵染2分鐘，重復3次；
(3.2)將步驟(3.1)輔助農桿菌侵染的愈傷組織轉入覆蓋濾紙的共培養固體培養基(MS + AS 150 μ mol/L)上，在溫度為22°C下暗培養72小時；
(3.3)將步驟(3.2)中的愈傷組織轉接入恢復培養基(MS+ 2,4-D 3.0 mg/L +Timentin 100mg/L + 鹿糖 30g/L)上，27 °C,暗培養 7 天。轉基因植株的抗除草劑鑒定:以除草劑Basta 40mg/L溶液涂抹轉基因植株和對照植株的頂部I 3葉片，3 5天后觀察除草劑效果，結果表明，通過本實施的步驟I 4獲得的抗性植株具有抗除草劑Basta 40mg/L性能。
權利要求
1.一種真空滲透輔助農桿菌介導甘蔗心葉愈傷組織遺傳轉化的方法，包括如下步驟: (1)甘蔗心葉胚性愈傷組織的誘導及增殖； (2)含有目標基因的根癌農桿菌的活化與培養； (3)真空滲透輔助農桿菌侵染甘蔗胚性愈傷組織； (4)抗性材料的篩選與出苗； (5)抗性植株鑒定； 其特征在于: 步驟(1)所述甘蔗心葉胚性愈傷組織的誘導及增殖方法是: (1.0)取甘蔗莖尖生長點以上不大于6cm的幼嫩心葉作為外植體，無菌條件下，將消毒好的外植體切成0.5 2.5mm的圓盤片； (1.1)將步驟(1.0)的外植體接種于愈傷誘導培養基上，置于26 28°C的黑暗條件下培養，挑選生長狀況良好的胚性愈傷組織繼代一次； (1.2)挑步驟(1.1) 的生長狀況良好的繼代后胚性愈傷組織轉接入新的愈傷誘導培養基上，進行活化培養； 愈傷誘導培養基是:MS + 2，4-D (I 4) mg/L +蔗糖30g/ L +瓊脂(7 9) g/L ； 步驟(2)所述含有目標基因的根癌農桿菌的活化與培養方法是: (2.0)挑取含有fer基因的根癌農桿菌菌株EHA105的單菌落； (2.1)將步驟(2.0)的單菌落接入含Rif 50mg/L和Kan 50mg/L的Iml YEP液體培養基中，在溫度為26 28 °C、震蕩速度為200 rpm的條件下，培養3 4小時； (2.2)取步驟(2.1)的菌液 150 300 μ L，涂布于含 Rif 50mg/L 和 Kan 50mg/L的YEP固體培養基上，在溫度26 28 1:下暗培養24 48小時，收集YEP固體培養基上的菌體； (2.3)將所收集的菌體轉入100 200 ml含AS 150 μ mol/L的MS液體培養基，160 .200 rpm振蕩培養5 6小時，菌液的OD66tl值達到0.3 0.6為轉化工程菌液； 將制備好的轉化工程菌液分裝到三角瓶中備用； 步驟(3)所述真空滲透輔助農桿菌侵染甘蔗胚性愈傷組織方法是: (3.1)將步驟(1.2)活化培養3 7天后的胚性愈傷組織無菌干燥處理后轉入步驟(2)中裝有制備好的轉化工程菌液的三角瓶中，胚性愈傷組織和轉化工程菌液在溫度為.22 28°C，震蕩速度為80 100 rpm條件下共培養5 15分鐘；后在0.02 0.06Mpa無菌真空壓力條件下輔助農桿菌侵染2 4分鐘，重復2 3次； (3.2)步驟(3.1)菌侵染后的愈傷組織轉入覆蓋濾紙的共培養固體培養基上，在溫度為21 24°C下暗培養2 5天；共培養固體培養基是:MS + AS 150 μ mol/L ； (3.3)將步驟(3.2)中的愈傷組織轉接入恢復培養基上，在溫度為26 28 °C下暗培養 5 7 天，恢復培養基是:MS + 2, 4-D (2 3)mg/L + Timentin (50^100) mg/L + 蔗糖 30g/L ； 步驟(4)所述抗性材料的篩選與出苗的方法是: (4.1)篩選培養，將經步驟(3.3)恢復培養后的愈傷組織轉接入篩選培養基，2周后，挑選抗性愈傷組織于篩選培養基上進行繼續篩選培養；篩選培養基是:MS+ 2，4-D (2^3)mg/L + Timentin (50 200)mg/L + PPT (I 3)mg/L + 鹿糖 30g/L); (4.2)分化培養，將經步驟(4.1)2代篩選培養后的抗性愈傷組織轉接到分化培養基上，在溫度為26 28 1:下、光強為15001UX、每天光照時間16小時的條件進行分化培養，分化出苗，獲得抗性植株，分化培養基是:MS + 6-BA (2^3)mg/L + NAA (0.Γθ.3) mg/L+ Timentin (50 ^200) mg/L + PPT (I 3)mg/L + 鹿糖 30g/L ; (4.3)抗性植株培養，將步驟(4.2)中生長到2 4厘米的抗性植株轉入篩選培養基上，15天后抗性苗生根；篩選培養基是:MS + NAA (2 3) mg/L + Timentin (50 200)mg/L + PPT (I 3) mg/L + 鹿糖 30g/L ; (4.4)生根培養，將步驟(4.3)的抗性苗轉到生根培養基進行生根培養；生根培養基，待根長3 5cm時，將瓶苗在溫室中煉苗5 7天；生根培養基是:MS + NAA ( f 3) mg/L+ Timentin (50 200) mg/L + PPT (I 3) mg/L + 鹿糖 50g/L ; (4.5)將步驟(4.4)的瓶苗假植于苗圃基質中，獲得抗性植株； 步驟(5)所述抗性植株鑒定的方法是: 將獲得的抗性植株采用CTAB法提取DNA，用目標基因的特異引物進行PCR擴增，以pCAMBIA 3301質粒作為陽性對照，對抗性植株進行PCR檢測； 取PCR陽性轉基因植株葉片，提取RNA，根據目標基因特異引物進行RT-PCR分析； 取PCR陽性轉基因植株葉片，用SDS方法大量提取DNA，進行southern blot分析。
全文摘要
本發明涉及植物基因工程技術領域，提出一種真空滲透輔助農桿菌介導甘蔗遺傳轉化的方法，其包括步驟(1)甘蔗心葉胚性愈傷組織的誘導及增殖；(2)含有目標基因的根癌農桿菌的活化與培養；(3)真空滲透輔助農桿菌侵染甘蔗胚性愈傷組織；(4)抗性材料的篩選與出苗；(5)抗性材料鑒定。本發明采用的真空滲透輔助農桿菌介導甘蔗遺傳轉化方法，在真空的情況下可促使農桿菌通過愈傷組織細胞間的空隙進入到深層的細胞，而且會在細胞的表面引起小傷口，致使植物分泌一些酚類物質以激活Ti質粒中T-DNA的剪切和轉移，本發明完善了農桿菌介導的甘蔗遺傳轉化體系。與普通農桿菌介導法相比，本發明顯著提高了甘蔗的遺傳轉化率。
文檔編號A01H5/00GK103205459SQ20131008889
公開日2013年7月17日 申請日期2013年3月20日 優先權日2013年3月20日
發明者樊麗娜, 齊永文, 李奇偉, 鄧海華, 勞方業, 李昱, 羅青文, 周文靈, 何慧怡, 陳月桂 申請人:廣州甘蔗糖業研究所