專利名稱：一種獲得產(chǎn)莨菪堿和東莨菪堿的木本曼陀羅毛狀根的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、生理學(xué)、育種學(xué)以及基因工程等領(lǐng)域，涉及一種利用轉(zhuǎn)基因 技術(shù)獲得產(chǎn)莨菪堿和東莨菪堿的木本曼陀羅毛狀根的方法，具體涉及發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化 木本曼陀羅并獲得產(chǎn)莨菪堿和東莨菪堿的木本曼陀羅毛狀根的具體程序。本發(fā)明還提供利 用基因工程技術(shù)獲得的高產(chǎn)莨菪堿和東莨菪堿的木本曼陀羅毛狀根及其培養(yǎng)的子代。
背景技術(shù)：
植物次生代謝產(chǎn)物具有十分重要的經(jīng)濟(jì)學(xué)功能，在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人們的日常生活中具 有廣闊的應(yīng)用前景，其中在天然藥物開發(fā)中的地位尤為引人矚目，然而至今仍沒(méi)有找到有 效的或成熟的合成方法。相對(duì)于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)具有生長(zhǎng)迅速、、合成次生代謝物質(zhì)能力強(qiáng)且遺傳穩(wěn)定性穩(wěn)定、向培養(yǎng)液釋放部分代謝產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)。由于Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 的毛狀根生長(zhǎng)快，易于培養(yǎng)，有效成分高，具有表達(dá)完整的代謝通路，為藥用植物次生代 謝產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)提供了廣闊前景。目前，雖然國(guó)內(nèi)外采用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化藥用植物獲得生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的毛狀根 的相關(guān)研究較多，但對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化木本曼陀羅獲得產(chǎn)莨菪堿和東莨菪堿毛狀根的研究仍是空 白。木本曼陀羅屬于茄科曼陀羅屬多年生藥用喬木植物。該屬植物約16多種，多分布于熱 帶和亞熱帶地區(qū)，溫帶則較少，我國(guó)有4種，南北各省均有分布，野生或栽培。該植物主 要藥用成分為莨菪堿和東茛菪堿等托品垸類生物堿，現(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)其具有擴(kuò)瞳、解痙、 麻醉、止痛和抑制腺體分泌等作用，且主要作為副交感神經(jīng)系統(tǒng)的抗膽堿藥，臨床治療麻 痹癥、運(yùn)動(dòng)癥、腸胃痙攣性絞痛和三叉神經(jīng)痛等，效果甚好。隨著國(guó)際上對(duì)莨菪堿和東莨 菪堿研究的持續(xù)升溫和認(rèn)識(shí)的逐步深入，認(rèn)為莨菪堿和東莨菪堿具有重要的藥用價(jià)值和開 發(fā)利用前景。然而目前獲得木本曼陀羅的主要技術(shù)是野生取材和人工栽培，但存在自然繁 殖不便、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、野生資源漸危、農(nóng)藥殘留超標(biāo)和有效成分低等弊端，使得該方式商 業(yè)前景尚不明朗。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一目的就是提供一種轉(zhuǎn)基因技術(shù)遺傳轉(zhuǎn)化木本曼陀羅獲得產(chǎn)莨菪堿和東莨 菪堿毛狀根的方法，該方法將發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的T-DNA導(dǎo)入木本曼陀羅中，獲得木本曼陀羅毛狀根；本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述方法轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，這種經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì) 胞發(fā)育為毛狀根。在實(shí)例中該宿主細(xì)胞是木本曼陀羅。 本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種獲得產(chǎn)莨菪堿和東莨菪堿木本曼陀羅毛狀根的方法和利用該方法獲得的產(chǎn)茛菪堿 和東莨菪堿的木本曼陀羅毛狀根，該毛狀根是一種采用本發(fā)明所述方法創(chuàng)造的新生命體。 該方法步驟如下-(1) 采用任何可能的手段獲得無(wú)菌的木本曼陀羅；(2) 采用任何轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)移發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒的T-DNA到木本曼陀羅細(xì)胞、組 織、器官、植株中；(3) 在特定的條件下篩選和鑒定毛狀根；(4) 在適合的條件下培養(yǎng)木本曼陀羅毛狀根，用于生產(chǎn)莨菪堿和東莨菪堿； 用上述方法獲得的生命體，它是可生產(chǎn)莨菪堿和東莨菪堿的木本曼陀羅毛狀根。 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"生命體"指木本曼陀羅的細(xì)胞、組織、器官、植株。 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"任何轉(zhuǎn)基因方法"包括發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化、基因槍法介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化、花粉管通道介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、生殖細(xì)胞浸泡法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"在特定的條件下篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子"是指用在離體培養(yǎng)的條件下 根據(jù)毛狀根的特殊形態(tài)學(xué)特征初步鑒定轉(zhuǎn)化子；可以使用PCR、 Southern雜交、Northern 雜交和Western印跡等方法來(lái)鑒定轉(zhuǎn)化子。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"在適合的條件下培養(yǎng)木本曼陀羅毛狀根"是指對(duì)經(jīng)過(guò)鑒定的木本 曼陀羅毛狀根離體培養(yǎng)，并檢測(cè)莨菪堿和東莨菪堿的含量，篩選莨菪堿和東莨菪堿含量提 高的優(yōu)良轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)，獲得其后代。在本發(fā)明中，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的T-DNA導(dǎo)入木本曼陀羅細(xì)胞獲 得轉(zhuǎn)化毛狀根，通過(guò)篩選優(yōu)良無(wú)性系，獲得莨菪堿和東莨菪堿及其相關(guān)黃酮類化合物含量 相對(duì)較高而穩(wěn)定的毛狀根無(wú)性系，為莨菪堿和東莨菪堿的生產(chǎn)提供一種新型優(yōu)質(zhì)的可持續(xù) 使用的藥源。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而 不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件， 例如《分子克隆》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。 實(shí)施例1木本曼陀羅無(wú)菌外植體的獲得方法利用外植體建立木本曼陀羅無(wú)菌外植體采集木本曼陀羅的當(dāng)年生幼嫩葉片，0.1%洗衣粉浸泡30分鐘，自來(lái)水沖洗數(shù)次；然后 用75% (V/V)乙醇浸泡30秒，無(wú)菌水沖洗3次；再用0.1% (M/V)升汞(HgCl2)溶液浸 泡9分鐘，無(wú)菌水沖洗5次；接著用無(wú)菌紙吸干表面水分，并將其切成0.5x0.5厘米塊狀后接 種在添加無(wú)菌叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基盛于150mL三角瓶中，于121。C滅菌20分鐘)， 該培養(yǎng)基配方為MS + 6-BA3.0mg七"+ NAA0.2mg'I/1， 30g丄"蔗糖，pH值為5.8，再添 加8.5g七"的瓊脂粉。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)木本曼陀羅的葉片，培養(yǎng)條件為25'C, 12h-d'1 光照，光照強(qiáng)度為55//11101.111-2.3-1。 35天后，即可選擇初代培養(yǎng)成功的芽叢切割成單芽， 繼續(xù)轉(zhuǎn)入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS + 6-BA3.0mg丄"+ NAA0.2 mg丄"中繼代培養(yǎng)，至芽苗長(zhǎng)到3 5 厘米時(shí)，轉(zhuǎn)入l/2MS + IBA1.0mg七"的生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，20天后即可誘導(dǎo)出不定根， 繼續(xù)培養(yǎng)獲得無(wú)菌的木本曼陀羅無(wú)菌幼苗，待其枝葉著生完全后可用于遺傳轉(zhuǎn)化。實(shí)施例2發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化木本曼陀羅獲得毛狀根1、 發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1。使用前自超低溫冰箱取出，接種于50ml YEB液體培養(yǎng)基中(添 加利福平終濃度為40mg'I/1)， 28°C， 200rpm振蕩培養(yǎng)兩次，復(fù)蘇菌體。2、 第二次活化培養(yǎng)結(jié)束兩小時(shí)前加入乙酰丁香酮，使其終濃度達(dá)到100/mioH;1也即 菌液OD6oo達(dá)0.3時(shí)，加入乙酰丁香酮，繼續(xù)28。C， 200rpm振蕩培養(yǎng)，菌液OD6oo達(dá)0.5 時(shí)，可用于轉(zhuǎn)化。3、 室溫下4000rpm離心10分鐘，棄上清，菌體用等體積MS液體培養(yǎng)基(含100;mU)H;1 乙酰丁香酮)懸浮，在28。C， 200rp振蕩培養(yǎng)30分鐘，使菌液濃度達(dá)到的0D柳K).6左右， 成為轉(zhuǎn)化液，此時(shí)可用于木本曼陀羅的遺傳轉(zhuǎn)化；1、 2、 3個(gè)步驟稱為活化發(fā)根農(nóng)桿菌。4、 取無(wú)菌木本曼陀羅幼嫩真葉，將其切成lxlcm左右，用無(wú)菌解剖針戳一些圓形傷 口 ，放入上述轉(zhuǎn)化液中，浸染10~13分鐘后取出，用無(wú)菌衛(wèi)生紙吸干，接種于添加100/miol-I/1 乙酰丁香酮的MS固體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)2 3天，培養(yǎng)條件為25°C，無(wú)光照。該步驟稱發(fā) 根農(nóng)桿菌與木本曼陀羅的共培養(yǎng)。5、 共培養(yǎng)結(jié)束后，在無(wú)菌吸水紙上吸千外植體上多余水分，轉(zhuǎn)移至無(wú)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物 的MS固體除菌培養(yǎng)基(添加500 mg七"頭孢菌素以達(dá)到除菌的目的)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件 為25°C，黑暗條件下培養(yǎng)。14天后，在木本曼陀羅受傷的部位開始出現(xiàn)毛狀根。該步驟 稱為木本曼陀羅的除菌培養(yǎng)。6、 外植體每隔3天轉(zhuǎn)入新鮮的同樣的培養(yǎng)基中，待轉(zhuǎn)化外植體上誘導(dǎo)出的毛狀根長(zhǎng) 到5cm左右時(shí)，分別切下單條的毛狀根，接種在無(wú)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物的1/2 MS固體培養(yǎng)基 上(添加500mg丄'1頭孢菌素以達(dá)到除菌的目的)繼代培養(yǎng)；在無(wú)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物的1/2MS 固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的木本曼陀羅毛狀根表現(xiàn)出毛狀根特有的形態(tài)學(xué)特征生長(zhǎng)十分迅速、分枝很多、生長(zhǎng)失去向地性。以后每15 20天繼代培養(yǎng)一次，繼代5次后，農(nóng)桿菌可以去 除桿菌；然后僅在1/2 MS固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)方可。該步驟為木本曼陀羅毛狀根的獲得 與繼代培養(yǎng)。實(shí)施例3木本曼陀羅毛狀根的分子檢測(cè)1、木本曼陀羅毛狀根基因組DNA的提取，方法如下(1) 取200mg液體培養(yǎng)兩周的毛狀根，過(guò)濾后用lOmL蒸餾水洗滌，充分吸干，液 氮速凍，研磨成粉。(2) 1.5 mLEppendorf管中，加500 抽提buffer (3%巰基乙醇)，充分震蕩65"水 浴50分鐘，每5分鐘顛倒混勻。(3) 4°C、 12,000rpm,離心10分鐘。(4) 吸上清，加500 /zL酚氯仿異戊醇(25:24:1)，輕輕混勻，靜置5分鐘鐘至分層。(5) 室溫，12,000rpm，離心10分鐘。(6) 吸上清約350;/L，加等體積的氯仿異戊醇(24:1),輕輕混勾，靜置5分鐘至分層。(7) 室溫，12,000 rpm,離心10分鐘。(8) 吸上清約250/zL，加2倍體積的無(wú)水乙醇(一2(TC預(yù)冷)，充分混勻，室溫放置 10分鐘見有絮狀DNA析出。(9) 室溫，12，000rpm,離心10分鐘。(10) 棄上清，沉淀用75%的乙醇洗2次，稍離心，吸凈殘余乙醇，室溫放置10分鐘，使乙醇揮發(fā)完全。(11) 力n 1 ^LRNAase， 50;/LTE,混勻，37。C水浴30—40分鐘。(12) 加40;/L氯仿，輕輕混勻，靜置5分鐘至分層。(13) 室溫，12,000rpm,離心10分鐘。(14) 吸取上清(約35;/L)到新Eppendorf管中，一20。C保存，用于PCR檢測(cè)。 抽提緩沖液配方如下-畫mM Tris-HCl(pH8.0) 2.5%(V/V) 巰基乙醇 500mM NaCl 20mM EDTA 1.5%(W/V) SDS2、木本曼陀羅毛狀根中ra氾和w/C基因的PCR檢測(cè)誘發(fā)并維持毛狀根形態(tài)的和ro/C基因是來(lái)源于發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒上。基因檢 測(cè)的PCR引物ra氾(423 bp)的引物為/ra氾(5，-GCT CTT GCA GTG CTA GAT TT-3，)， /ro氾(5，-GAA GGT GCA AGC TAC CTC TC- 3，)； w/C (626 bp)的引物為#o/C (5'陽(yáng)TAA CATGGCTGAAGACGACC-3'), ato/C (5，-AAACTTGCACTC GCCATGCC-3，)。反應(yīng)體系均為(25 〃L): ddH20 18 〃L， 10 x PCR buffer 2.5 //L， 25歸ol/L MgCL2 2.0 /<L，10 mmoll/1 dNTP mix 0.25//L, 10 mmol/L primerl 0.25 //L， 10 mmol/L primer 20.25 pL， TagDNApolymerase 0.25//L (1.25U), Template基因組DNA 1.5 ;/L。PCR反應(yīng)程序94 °C 5min—35循環(huán)(94 °C for 40 sec—55 °C for 40 sec—72 。C forimin)—72°C 8min。陽(yáng)性對(duì)照為相應(yīng)的工程菌，木本曼陀羅的天然葉片作為陰性對(duì)照。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外檢測(cè)。的擴(kuò)增條帶大小為423 bp， ro/c為626bp。實(shí)施例4木本曼陀羅毛狀根中莨菪堿和東莨菪堿含量與野生根中的含量比較 1、莨菪堿和東莨菪堿對(duì)照品的HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線的剁作分別精密稱取2mg莨菪堿和東莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，用甲醇(色譜純)溶解過(guò)濾，配成 終濃度為lOOO/^'mL",分別稀釋成500//g'mi;1、 250〃g'ml/1、 lOO;zg'mL-1、 50〃g'mL"、 SS/^mlA lO/^mlA 5//g'ml/1。每一濃度進(jìn)樣三次記錄圖譜及色譜參數(shù)，分別以峰面積夠精細(xì)的調(diào)節(jié)表達(dá)至最佳值。本發(fā)明的表達(dá)單元或包含所述表達(dá)單元的表達(dá)盒還可以在微生物，特 別是棒桿菌菌種中，調(diào)節(jié)和增加多種生物合成產(chǎn)物(例如精細(xì)化學(xué)品、蛋白 質(zhì)，特別是M酸)的形成。因此，本發(fā)明涉及本發(fā)明的包含多啟動(dòng)子的表i4單元在調(diào)節(jié)產(chǎn)物生物 合成中的用途。這里，將涉及產(chǎn)物生物合成調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的基因置于這樣的 表達(dá)單元控制之下。所述產(chǎn)物生物合成依賴于所選擇的包含多啟動(dòng)子的表 達(dá)單元轉(zhuǎn)錄速率的影響。或者，可以在微生物中將涉及產(chǎn)物生物合成蛋白 質(zhì)的基因作為本發(fā)明的表達(dá)盒的組分表達(dá)，并且由此可以通過(guò)表達(dá)的蛋白 質(zhì)調(diào)節(jié)所述產(chǎn)物生物合成。如果多啟動(dòng)子的活性弱于內(nèi)源啟動(dòng)子，還可以 使用多啟動(dòng)子以減弱特定的不需要的生物合成途徑。還可以通過(guò)一個(gè)或多個(gè)組成所述多啟動(dòng)子的單個(gè)啟動(dòng)子的特異性突變來(lái)調(diào)節(jié)本發(fā)明包含多啟動(dòng)子表達(dá)單元的轉(zhuǎn)錄速率。可以通過(guò)替換RNA聚 合酶全酶結(jié)合位點(diǎn)(對(duì)技術(shù)人員也稱為-10區(qū)和-35區(qū))的結(jié)合位點(diǎn)之中的 核苷酸獲得增加的或降低的啟動(dòng)子活性。還可以這樣進(jìn)一步地施加影響 通過(guò)核苷酸缺失或核苷酸插入減少或延長(zhǎng)在所述RNA聚合酶全酶結(jié)合位 點(diǎn)之間的距離；此外，通過(guò)將調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(技術(shù)人員稱為阻遏蛋白或激活蛋 白)的結(jié)合位點(diǎn)(技術(shù)人員也稱為操g因)置于與RNA聚合酶全酶結(jié)合位 點(diǎn)空間鄰近的位置，使這些調(diào)節(jié)物在與啟動(dòng)子序列結(jié)合后減弱或增強(qiáng)RNA 聚合酶全酶的結(jié)合和轉(zhuǎn)錄活性，或還使所述結(jié)合和轉(zhuǎn)錄活性受到新的調(diào)節(jié) 影響。也可以通過(guò)突變本發(fā)明包含多啟動(dòng)子的表達(dá)單元之中單個(gè)啟動(dòng)子Py 的介導(dǎo)核糖體結(jié)合的3，末端序列區(qū)影響翻譯活性。VI.生物合成產(chǎn)物和優(yōu)選的生產(chǎn)方法優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明制備的生物合成產(chǎn)物為精細(xì)化學(xué)品。 術(shù)語(yǔ)"精細(xì)化學(xué)品"為技術(shù)人員所熟知并且包括由生物產(chǎn)生且用于多 種工業(yè)領(lǐng)域中的^f匕合物，所述工業(yè)領(lǐng)域例如(但不限于)醫(yī)藥業(yè)、農(nóng)業(yè)、化 妝品業(yè)、食品業(yè)及飼料業(yè)。這些化合物包括有機(jī)酸(例如乳酸、琥珀酸、酒
權(quán)利要求
1.一種獲得產(chǎn)莨菪堿和東莨菪堿的木本曼陀羅毛狀根的方法，特征在于采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化木本曼陀羅的器官，其步驟如下(1)木本曼陀羅無(wú)菌外植體的獲得；(2)采用轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)移發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒的T-DNA到木本曼陀羅細(xì)胞、組織、器官、植株中；其中轉(zhuǎn)基因方法選擇發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化、基因槍法介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化、花粉管通道介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化或生殖細(xì)胞浸泡法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化；包括以下步驟；A、活化發(fā)根農(nóng)桿菌；B、發(fā)根農(nóng)桿菌浸染木本曼陀羅外植體；C、發(fā)根農(nóng)桿菌與木本曼陀羅外植體的共培養(yǎng)，步驟如下I、將侵染后的木本曼陀羅外植體接種在MS+AS 100μmol·L-1固體培養(yǎng)基上；II、置于溫度為25℃±1.0℃恒溫暗培養(yǎng)48h；D、外植體的除菌培養(yǎng)；(3)木本曼陀羅毛狀根的獲得與繼代培養(yǎng)；(4)木本曼陀羅毛狀根的分子檢測(cè)，方法如下A、提取木本曼陀羅毛狀根DNA；B、獲得含rolB和rolC引物的PCR反應(yīng)體系；C、PCR反應(yīng)擴(kuò)增毛狀根特有基因rolB和rolC；D、電泳檢測(cè)目標(biāo)條帶；(5)木本曼陀羅毛狀根中莨菪堿和東莨菪堿的含量檢測(cè)。
2. 用權(quán)利要求1所述方法獲得產(chǎn)莨菪堿和東莨菪堿的木本曼陀羅的毛狀根，其特征在 于其基因組中整合了來(lái)自于Ri質(zhì)粒的誘導(dǎo)毛狀根的基因。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用基因工程技術(shù)遺傳轉(zhuǎn)化木本曼陀羅，獲得生產(chǎn)莨菪堿和東莨菪堿的木本曼陀羅的毛狀根的方法。涉及發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化木本曼陀羅的方法，遺傳轉(zhuǎn)化獲得可生產(chǎn)莨菪堿和東莨菪堿的木本曼陀羅毛狀根，其過(guò)程是用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化木本曼陀羅，獲得了木本曼陀羅毛狀根，經(jīng)分子檢測(cè)確為遺傳轉(zhuǎn)化的毛狀根，HPLC檢測(cè)表明遺傳轉(zhuǎn)化獲得的木本曼陀羅毛狀根能夠生產(chǎn)莨菪堿和東莨菪堿。本方法可以為莨菪堿和東莨菪堿的生產(chǎn)提供一種可持續(xù)的新型藥源。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101230349SQ20081006937
公開日2008年7月30日 申請(qǐng)日期2008年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月20日
發(fā)明者敏 孫, 楊雪清, 桅 雷 申請(qǐng)人:西南大學(xué)