一種通過幼胚離體挽救獲得朱頂紅‘蘋果’雜交種的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及組培技術領域，具體涉及一種通過幼胚離體挽救獲得朱頂紅‘蘋果’雜交種的方法。
【背景技術】
[0002]朱頂紅(Hippeastrum Herb.)是石蒜科朱頂紅屬的多年生球根花奔植物，其花大色艷且冬春時節開花，盛開時花朵與濃綠的葉子相映成輝，觀賞價值極高。朱頂紅既是理想的年宵盆栽花卉及高檔切花材料，也能在露地園林花境配置中起到很好的美化景觀效果。然而朱頂紅野生種主要分布于南美洲、巴西等熱帶、亞熱帶地區，我國沒有朱頂紅野生資源的分布。因此，我國朱頂紅市場過分依賴進口，品種沒有自主知識產權，在生產和銷售上受至IJ限制。
[0003]蘋果(H.Apple Blossom)為單瓣大花型品種，花色為粉紅色與純白色相間并具有一定的香氣，其花朵品質維持特性極優，且株形適中、植株的適應性和抗病性強，該品種綜合了朱頂紅育種目標中的多個重要的優良性狀，可以成為優秀的朱頂紅雜交母本品種。但是前人對其多年的雜交授粉研究發現:‘蘋果’屬于雌性不育品種，即作為母本時其雜交胚會發生敗育從而不能結實(葉露，2007 ;呂文濤等，2010 ;石豐瑞等，2014)，這極大地阻礙了人們對其進行雜交育種的研究工作。因此，急需一套完善的人工胚挽救技術以獲得‘蘋果’的優良雜交種質資源，但在此之前還沒有關于其雜交幼胚挽救及雜交種質的獲得方法，更沒有成功的實例。

【發明內容】

[0004]本發明的目的正是為了克服上述技術的不足，而提供一種通過幼胚離體挽救獲得朱頂紅‘蘋果’雜交種的方法。
[0005]本發明的目的是通過如下技術方案來完成的。這種通過幼胚離體挽救獲得朱頂紅‘蘋果’雜交種的方法，該方法主要包括如下步驟:
[0006]1)、培養基的配制:
[0007](1)基本培養基:MS培養基，其中蔗糖20?30g/L，瓊脂5?9g/L，pH = 5.8 ；
[0008](2)胚挽救培養基:MS+6-BA 0.1 ?0.5mg/L+NAA0.01 ?0.05mg/L+ 谷氨酰胺200?600mg/L+水解酪蛋白200?800mg/L+0.1?0.4g/L活性炭；
[0009](3)壯苗生根培養基:MS+6-BA 0.01 ?0.03mg/L+NAA0.05 ?0.3mg/L ；
[0010]2)、雜交授粉及外植體的選取:以‘蘋果’做為母本進行雜交授粉，于雜交幼胚敗育前摘取子房做為外植體；
[0011]3)、外植體消毒及接種:將步驟2)中的子房進行消毒處理后于無菌條件下接種于胚挽救培養基上進行離體培養，至種子成熟并萌發成幼苗；
[0012]4)、壯苗生根培養:將步驟3)獲得的幼苗轉至壯苗生根培養基上進行生根壯苗培養;
[0013]5)、煉苗移栽:將步驟4)中的生根壯苗從培養基中取出并洗掉根部的培養基，然后將其移栽至裝有基質的營養缽中進行煉苗，1周后可移至田間種植從而獲得‘蘋果’的雜交后代植株。
[0014]進一步地，本發明在所述步驟2)中，雜交授粉是將父本花粉輕涂到母本‘蘋果’開裂的柱頭上后進行套袋，在授粉后2?3周左右摘取未成熟子房做為外植體。
[0015]進一步地，本發明在所述步驟3)中，消毒處理是以整個的未成熟子房為外植體材料，先用洗潔精溶液浸泡20min后再用自來水清洗，然后將其置于錐形瓶中進行消毒處理，依次在體積比為70%的酒精溶液和有效氯濃度為1 %的次氯酸鈉溶液中分別浸泡3min和6min，期間搖晃數次，最后用無菌水沖洗3?5遍，每遍lmin。
[0016]進一步地，本發明在所述步驟3)中，所述的胚挽救是將消毒后的子房沿腹縫線切開后，再將子房橫切成2?3段后接種到胚挽救培養基上，使部分胚柄和子房壁組織與培養基相接觸進行離體培養，培養6?9周后幼胚可發育成種子并萌發長成幼苗。
[0017]進一步地，本發明在所述步驟3)中，接種后先于25±2°C的黑暗條件下培養24?72小時，再進行光照培養，所述光照培養的溫度為25±2°C、光照強度為30?60 μ mol.m_2.s_l、光照時間為8?12小時/天。
[0018]進一步地，本發明在所述步驟4)中，所述光照培養的溫度為25±2°C、光照強度為30?60 μ mol.m_2.s_l、光照時間為8?12小時/天。
[0019]本發明的優點是:本發明以雌性不育的朱頂紅‘蘋果’做為母本進行雜交授粉，在幼胚敗育前將其取出進行人工離體挽救培養，使雜交幼胚得以發育成正常種子，從而獲得多種‘蘋果’的雜交種后代。該方法有效地提高了雜種成活率并縮短了 ‘蘋果’雜交后代的培育周期，為其育種工作的開展提高了有利的技術保障。該方法可操作性強，簡單實用，胚搶救的效果顯著，可以廣泛應用于朱頂紅雜交幼胚的挽救，對朱頂紅的種質資源創新具有積極意義。
【具體實施方式】
[0020]下面通過【具體實施方式】對本發明作進一步闡述，實施例將幫助更好地理解本發明，但本發明并不僅僅局限于下述實施例。
[0021]實施例1:
[0022]本發明的目的是提供一種通過幼胚離體挽救獲得朱頂紅‘蘋果’雜交種的方法，其步驟如下:
[0023]1)、培養基的配制:
[0024](1)基本培養基:MS培養基，其中蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH = 5.8 ；
[0025](2)胚挽救培養基:MS+6-BA (λ 1 ?(λ 5mg/L+NAA0.01 ?(λ 05mg/L+ 谷氨酰胺200?600mg/L+水解酪蛋白200?800mg/L+0.1?0.4g/L活性炭；
[0026](3)壯苗生根培養基:MS+6-BA 0.01 ?0.03mg/L+NAA0.05 ?0.3mg/L ；
[0027]2)、雜交授粉及外植體的選取:以‘蘋果’做為母本，將父本花粉輕涂到‘蘋果’開裂的柱頭上進行雜交授粉并套袋，在授粉后2?3周左右摘取未成熟子房；
[0028]3)、外植體消毒及接種:以整個的未成熟子房為外植體材料，先用洗潔精溶液浸泡20min后再用自來水清洗，然后將其置于錐形瓶中進行消毒處理，依次在體積比為70%的酒精溶液和有效氯濃度為1 %的次氯酸鈉溶液中分別浸泡3min和6min，期間搖晃數次，最后用無菌水沖洗3?5遍，每遍lmin ;將消毒后的子房沿腹縫線切開后，再將子房橫切成2?3段后接種到胚挽救培養基上，使部分胚柄和子房壁組織與培養基相接觸進行離體培養，培養6?9周后幼胚可發育成種子并萌發長成幼苗；接種后先于25±2°C的黑暗條件下培養24?72小時，再進行光照培養，所述光照培養的溫度為25±2°C、光照強度為30?60 μ mol.m_2.s_l、光照時間為8?12小時/天。
[0029]4)、壯苗生根培養:將步驟3)獲得的幼苗轉至壯苗生根培養基上進行生根壯苗培養；光照培養的溫度為25±2°C、光照強度為30?60 μ mol.m-2.s_l、光照時間為8?12
小時/天。
[0030]5)、煉苗移栽:將步驟4)中的生根壯苗從培養基中取出并洗掉根部的培養基，然后將其移栽至裝有基質的營養缽中進行煉苗，1周后可移至田間種植從而獲得‘蘋果’的雜交后代植株。
[0031]實施例2:
[0032]本發明的目的是提供一種通過幼胚離體挽救獲得朱頂紅‘蘋果’雜交種的方法，其步驟如下:
[0033]1)、培養基的配制:
[0034](1)基本培養基:MS培養基，其中蔗糖20?30g/L，瓊脂5?9g/L，pH = 5.8 ；
[0035](2)胚挽救培養基:MS+6-BA 0.lmg/L+NAA 0.