專利名稱：歐洲鵝耳櫪的組培快繁方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種歐洲鵝耳櫪的組培快繁方法，屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
歐洲鵝耳櫪(Carpinus be tulus )又名西洋千金榆，落葉喬木，屬于樺木科(Betulaceae)鵝耳櫪屬iCarpinusL.),主要分布在歐洲、伊朗、土耳其。其枝葉濃密,株型緊湊、葉型秀麗，秋色葉金黃，果穗奇特，頗為美觀，是道路、城市綠地和四旁綠化的良好樹(shù)種。另外，其多分枝，極耐修剪，可以通過(guò)人工整形形成各種造型，用以豐富植物景觀，如在早期的英國(guó)和美國(guó)花園中常修剪成綠籬。又因其抗寒性強(qiáng)，抗風(fēng)力強(qiáng)，適應(yīng)性廣，少病蟲(chóng)害，為我國(guó)東部沿海城市園林綠化及荒山造林的理想樹(shù)種。歐洲鵝耳櫪幼葉含有抗癌物質(zhì)正受到越來(lái)越多的研究，其材質(zhì)也相當(dāng)堅(jiān)硬可以制造地板、樂(lè)器、車削及各種工具的手柄等，也可以制造成高質(zhì)量的木炭。故要加快歐洲鵝耳櫪引種與應(yīng)用的步伐，使之能廣泛地在我國(guó)的工業(yè)、城市林業(yè)、園林綠化及荒山造林中得以推廣應(yīng)用，市場(chǎng)前景十分廣闊。目前，歐洲鵝耳櫪主要通過(guò)種子繁殖，但種子成熟后，外部會(huì)形成堅(jiān)硬的外殼，影響種子的發(fā)芽率，致使發(fā)芽率較低。通過(guò)層積處理可以促進(jìn)種子的發(fā)芽，但層積的時(shí)間較長(zhǎng)，且經(jīng)過(guò)層積處理種子的發(fā)芽率仍然較低。歐洲鵝耳櫪扦插很難生根，黃化和燙漂、綁扎處理能提高其扦插生根率，但生根率仍然較低。歐洲鵝耳櫪的組培快繁研究在過(guò)去鮮有報(bào)道，僅個(gè)別學(xué)者利用莖段和頂芽作為外植體對(duì)歐洲鵝耳櫪進(jìn)行離體快速繁殖獲得了完整植株，但為歐洲鵝耳櫪的工廠化育苗奠定了一定的理論基礎(chǔ)，不過(guò)離工廠化育苗還有一定的差距。

發(fā)明內(nèi)容
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本發(fā)明的主要目的是克服歐洲鵝耳櫪組織培養(yǎng)過(guò)程中，不定芽難以誘導(dǎo)、成活率和繁殖系數(shù)低的不足，提供一種歐洲鵝耳櫪的組織培養(yǎng)快速繁殖方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案:一種歐洲鵝耳櫪的組培快繁方法，其特征是該方法包括如下工藝步驟:
1)選擇生長(zhǎng)飽滿的莖尖，表面消毒后接種在含0.5^10.0mg/L 6-芐基氨基嘌呤的WPM基本培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)基中還包含6.5g/L瓊脂粉和30.0g/L蔗糖；
2)待不定芽長(zhǎng)出后，剪取1.5 2.0cm莖尖在附加0.f 2.0mg/L的6-芐基氨基嘌呤，0.Γ2.0mg/L的激動(dòng)素，(T0.5mg/L的吲哚丁酸植物激素MS基本培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)；
3)剪取生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)3 4cm的單苗進(jìn)行生根培養(yǎng)，基本培養(yǎng)基大量元素減少1/2，其他元素保持不變，簡(jiǎn)稱1/2基本培養(yǎng)基；附加(Tl.0 mg/L吲哚丁酸，(Tl.0mg/的萘乙酸；培養(yǎng)溫度為25±2°C，pH 5.8 6.0，光照12h/天，光照強(qiáng)度為2000 Ix ；
4)當(dāng)單苗根長(zhǎng)到3飛cm時(shí)，將生根試管苗的瓶口封口膜打開(kāi)，在培養(yǎng)室散射光下進(jìn)行開(kāi)口煉苗，使試管苗逐漸與外界接觸，在I周內(nèi)將周圍環(huán)境濕度保持在70% 80%，逐步提高小苗適應(yīng)外界環(huán)境的能力；5天后取出試管苗洗凈根部的培養(yǎng)物質(zhì)，移栽到育苗基質(zhì)中生長(zhǎng)，基質(zhì)由珍珠巖、泥炭土、園土的重量比為2:2:1組成，充分混合后用多菌靈消毒。本發(fā)明的有益效果:解決了歐洲鵝耳櫪組培過(guò)程中新芽不易啟動(dòng)、成活率和繁殖系數(shù)低的問(wèn)題，通過(guò)培養(yǎng)基組分的調(diào)整，誘導(dǎo)了歐洲鵝耳櫪產(chǎn)生大量不定芽和較高的生根率，移栽后成活率高達(dá)85%，提供了一種歐洲鵝耳櫪的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，對(duì)于歐洲鵝耳櫪的工廠化育苗具有重要意義。
具體實(shí)施例方式一種歐洲鵝耳櫪的組培快繁方法，包括如下工藝步驟:
O選擇生長(zhǎng)飽滿的莖尖，表面消毒后放在含0.5 10.0mg/L 6-芐基氨基嘌呤(benzyIaminopurine,簡(jiǎn)稱BA)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),基本培養(yǎng)基是WPM (Woody Plant Medium,簡(jiǎn)稱 WPM)，主要包含以下成分:NH4NO3 400mg/L、Ca (NO3) 2.4Η20 556mg/L、CaCl2.2Η20 96mg/L、MgSO4.7Η20 370mg/L,KH2PO4 170mg/L,K2SO4 990mg/L,H3BO3 6.2mg/L、MnS04.Η20 17.7mg/L、ZnSO4.7H20 8.6mg/L、NaMoO4.2H20 0.25mg/L、CuSO4.5H20 0.25mg/L、FeSO4.7H20 27.8mg/UNa2-EDTA 37.3mg/L、肌醇 100mg/L、甘氨酸 2mg/L、煙酸 0.5mg/L、煙酸硫胺素 1.0mg/L、鹽酸吡哆醇0.5mg/L ;基本培養(yǎng)基還包含6.5g/L的瓊脂粉和30.0g/L蔗糖。2)待不定芽誘導(dǎo)長(zhǎng)出后，1.5 2.0cm莖尖進(jìn)行增殖培養(yǎng)，基本培養(yǎng)基是MS (Murashige and Skoog,簡(jiǎn)稱MS)；附加0.1 2.0mg/L 的6-節(jié)基氛基嘿呤(benzyIaminopurine,簡(jiǎn)稱 BA), 0.1 2.0mg/L 的激動(dòng)素(kinetin,簡(jiǎn)稱 KT), O 0.5mg/L 的口引哚丁酸(indole butyric acid,簡(jiǎn)稱IBA)植物激素；還包含6.0g/L的瓊脂粉和30.0g/L 的蔗糖；主要包含以下成分:=NH4NO3 1650mg/L、KNO3 1900mg/L、MgSO4.7H20 370mg/L、KH2PO4 170mg/L、CaCl2.2H20 440 mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4.4H20 22.3mg/L、ZnSO4.7H20 8.6mg/L、NaMoO4.2H20 0.25mg/L、CuSO4.5H20 0.025mg/L、CoCl2.6H200.025mg/L、FeSO4.7H20 27.8mg/L、Na2-EDTA 37.25mg/L、肌醇 100mg/L、甘氨酸 2mg/L、煙酸0.5mg/L、鹽酸批卩多醇0 .5mg/L、鹽酸硫胺素0.1 mg/L。3)剪取生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)3 4cm的單苗進(jìn)行生根培養(yǎng)，基本培養(yǎng)基為1/2WPM (WPM培養(yǎng)基大量元素減少1/2，其他元素保持不變，簡(jiǎn)稱1/2WPM)培養(yǎng)基，主要包含以下成分=NH4NO3200mg/L、Ca (NO3)2.4H20 278mg/L、CaCl2.2H20 48mg/L、MgSO4.7H20 185mg/L、KH2P04 85mg/UK2SO4 495mg/L, H3BO3 6.2mg/L、MnS04.H2O 17.7mg/L、ZnSO4.7H20 8.6mg/L、NaMoO4.2H200.25mg/L、CuSO4.5H20 0.25mg/L、FeSO4.7H20 27.8mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、肌醇 IOOmg/L、甘氨酸2mg/L、煙酸0.5mg/L、煙酸硫胺素1.0mg/L、鹽酸批P多醇0.5mg/L ;附加(Tl.0 mg/L 口引哚丁酸(indole butyric acid,簡(jiǎn)稱 ΙΒΑ),0 1.0mg/的萘乙酸(naphthylene aceticacid，簡(jiǎn)稱NAA);還包含6.5g/L瓊脂粉和15.0g/L的蔗糖，pH 5.8 6.0，光照12h/d，光照強(qiáng)度為2000 Ix0培養(yǎng)至60天時(shí)統(tǒng)計(jì)其增殖倍數(shù)、平均株高、生根率、平均根數(shù)和平均根長(zhǎng)。當(dāng)根長(zhǎng)到:T5cm時(shí)，將生根試管苗的瓶口封口膜打開(kāi)，在培養(yǎng)室散射光下進(jìn)行開(kāi)口煉苗，使試管苗逐漸與外界接觸，在I周內(nèi)將周圍環(huán)境濕度保持在709Γ80%，逐步提高小苗適應(yīng)外界環(huán)境的能力。5d后取出試管苗洗凈根部的培養(yǎng)物質(zhì)，移栽到育苗基質(zhì)中生長(zhǎng)，基質(zhì)由珍珠巖、泥炭土、園土 2:2:1組成，充分混合后用多菌靈消毒。選取生長(zhǎng)飽滿的莖 尖，表面消毒后接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；培養(yǎng)4周統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。剪取1.5 2.0cm莖段接種于增殖培養(yǎng)基上，60天統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)。剪取生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)3 4cm的單苗接種于生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。培養(yǎng)50天統(tǒng)計(jì)生根率、平均根數(shù)和平均根長(zhǎng)。當(dāng)根長(zhǎng)到3 5cm時(shí)進(jìn)行煉苗移栽，30天后，調(diào)查其移栽成活率。實(shí)施例1
選取生長(zhǎng)飽滿的莖尖，表面消毒后接種在附加0.5mg/L BA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；基本培養(yǎng)基為WPM，基本培養(yǎng)基還包含6.5g/L瓊脂粉和30.0g/L的蔗糖。待不定芽長(zhǎng)出，剪取1.5 2.0cm莖段進(jìn)行增殖，基本培養(yǎng)基是MS ;附加的植物激素為0.lmg/L的BA、0.5mg/L的KT和0.0 lmg/L的IBA ;還包含6.0g/L的瓊脂粉和30.0g/L的蔗糖。60天統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)。剪取生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng):T4cm的單苗進(jìn)行生根培養(yǎng)，基本培養(yǎng)基為1/2WPM ;附加的植物激素為0.0 lmg/L的NAA,0.5mg/L的IBA ;還包含6.5g/L的瓊脂粉和15.0g/L的蔗糖，PH 5.8 6.0，光照12h/d，光照強(qiáng)度為2000 Ix0 60天后統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)、平均株高、生根率、平均根數(shù)和平均根長(zhǎng)。結(jié)果表明每個(gè)外植體平均分化2.86個(gè)不定芽，平均芽長(zhǎng)達(dá)3.25cm ;生根率達(dá)56.8%，平均根數(shù)達(dá)2.95，平均根長(zhǎng)達(dá)4.48cm。將生根試管苗的瓶口封口膜打開(kāi)，在培養(yǎng)室散射光下進(jìn)行開(kāi)口煉苗，使試管苗逐漸與外界接 觸，在I周內(nèi)將周圍環(huán)境濕度保持在70°/Γ80%，逐步提高小苗適應(yīng)外界環(huán)境的能力。5d后取出試管苗洗凈根部的培養(yǎng)物質(zhì)，移栽到育苗基質(zhì)中生長(zhǎng)，基質(zhì)由珍珠巖、泥炭土、園土 2:2:1組成，充分混合后用多菌靈消毒，成活率達(dá)70%。實(shí)施例2
選取生長(zhǎng)飽滿的莖尖，表面消毒后接種在附加2.0mg/L BA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；基本培養(yǎng)基為WPM，基本培養(yǎng)基還包含6.5g/L瓊脂粉和30.0g/L的蔗糖。待不定芽長(zhǎng)出，剪取1.5 2.0cm莖段進(jìn)行增殖，基本培養(yǎng)基是MS ;附加的植物激素為1.0mg/L的BA、2.0mg/L的KT和0.0 lmg/L的IBA ;還包含6.0g/L的瓊脂粉和30.0g/L的蔗糖。60天統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)。剪取生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)3 4cm的單苗進(jìn)行生根培養(yǎng)，基本培養(yǎng)基為1/2WPM ;附加的植物激素為0.5mg/L的NAA,0.5mg/L的IBA ;還包含6.5g/L的瓊脂粉和15.0g/L的蔗糖，PH 5.8 6.0，光照12h/d，光照強(qiáng)度為2000 Ix0 60天后統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)、平均株高、生根率、平均根數(shù)和平均根長(zhǎng)。結(jié)果表明每個(gè)外植體平均分化2.54個(gè)不定芽，平均芽長(zhǎng)達(dá)3.89cm ;生根率達(dá)65.8%，平均根數(shù)達(dá)2.35，平均根長(zhǎng)達(dá)3.08cm。將生根試管苗的瓶口封口膜打開(kāi)，在培養(yǎng)室散射光下進(jìn)行開(kāi)口煉苗，使試管苗逐漸與外界接觸，在I周內(nèi)將周圍環(huán)境濕度保持在70°/Γ80%，逐步提高小苗適應(yīng)外界環(huán)境的能力。5d后取出試管苗洗凈根部的培養(yǎng)物質(zhì)，移栽到育苗基質(zhì)中生長(zhǎng)，基質(zhì)由珍珠巖、泥炭土、園土 2:2:1組成，充分混合后用多菌靈消毒，成活率達(dá)65%。實(shí)施例3
選取生長(zhǎng)飽滿的莖尖，表面消毒后接種在附加1.0mg/L BA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；基本培養(yǎng)基為WPM，基本培養(yǎng)基還包含6.5g/L瓊脂粉和30.0g/L的蔗糖。待不定芽長(zhǎng)出，剪取1.5
2.0cm莖段進(jìn)行增殖，基本培養(yǎng)基是MS ;附加的植物激素為1.0 mg/L的BA、0.5mg/L的KT和
0.5mg/L的IBA ;還包含6.0g/L的瓊脂粉和30.0g/L的蔗糖。60天統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)。剪取生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)3 4cm的單苗進(jìn)行生根培養(yǎng)，基本培養(yǎng)基為1/2WPM ;附加的植物激素為0.0lmg/L的NAA ;還包含6.5g/L的瓊脂粉和15.0g/L的蔗糖，PH 5.8 6.0，光照12h/d，光照強(qiáng)度為2000 Ix0 60天后統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)、平均株高、生根率、平均根數(shù)和平均根長(zhǎng)。結(jié)果表明每個(gè)外植體平均分化4.06個(gè)不定芽，平均芽長(zhǎng)達(dá)3.87cm ;生根率達(dá)76.8%，平均根數(shù)達(dá)3.65，平均根長(zhǎng)達(dá)3.76cm。將生根試管苗的瓶口封口膜打開(kāi)，在培養(yǎng)室散射光下進(jìn)行開(kāi)口煉苗，使試管苗逐漸與外界接觸，在I周內(nèi)將周圍環(huán)境濕度保持在709Γ80%，逐步提高小苗適應(yīng)外界環(huán)境的能力。5d后取出試管苗洗凈根部的培養(yǎng)物質(zhì)，移栽到育苗基質(zhì)中生長(zhǎng)，基質(zhì)由珍珠巖、泥炭土、園土 2:2:1組成， 充分混合后用多菌靈消毒，移栽成活率高達(dá)85%。
權(quán)利要求
1.一種歐洲鵝耳櫪的組培快繁方法，其特征是該方法包括如下工藝步驟: 1)選擇生長(zhǎng)飽滿的莖尖，表面消毒后接種在含0.5^10.0mg/L 6-芐基氨基嘌呤的WPM基本培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)基中還包含6.5g/L瓊脂粉和30.0g/L蔗糖； 2)待不定芽長(zhǎng)出后，剪取1.5 2.0cm莖尖，在附加0.f 2.0mg/L的6-芐基氨基嘌呤，0.Γ2.0mg/L的激動(dòng)素，(T0.5mg/L的吲哚丁酸植物激素的MS基本培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng); 3)剪取生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng):T4cm的單苗進(jìn)行生根培養(yǎng)，WPM基本培養(yǎng)基大量元素減少1/2，其他元素保持不變，簡(jiǎn)稱1/2WPM基本培養(yǎng)基；附加(Tl.0 mg/L吲哚丁酸，(Tl.0mg/的萘乙酸；培養(yǎng)溫度為25±2°C，pH 5.8 6.0，光照12h/天，光照強(qiáng)度為2000 Ix ； 4)當(dāng)單苗根長(zhǎng)到3 5cm時(shí)，將生根試管苗的瓶口封口膜打開(kāi)，在培養(yǎng)室散射光下進(jìn)行開(kāi)口煉苗，使試管苗逐漸與外界接觸，在I周內(nèi)將周圍環(huán)境濕度保持在70°/Γ80%，逐步提高小苗適應(yīng)外界環(huán)境的能力；5天后取出試管苗洗凈根部的培養(yǎng)物質(zhì)，移栽到育苗基質(zhì)中生長(zhǎng)，基質(zhì)由珍珠巖、泥炭土、園土的重量比為2:2:1組成，充分混合后用多菌靈消毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的歐洲鵝耳櫪的組織培養(yǎng)方法，其特征是:步驟I)中的WPM基本培養(yǎng)基主要包含以下成分=NH4NO3 400mg/L、Ca(NO3)2.4H20 556mg/L、CaCl2.2H20 96mg/UMgSO4.7Η20 370mg/L,KH2PO4 170mg/L,K2SO4 990mg/L,H3BO3 6.2mg/L、MnS04.H2O 17.7mg/L、ZnSO4.7H20 8.6mg/L、NaMoO4.2H20 0.25mg/L、CuSO4.5H20 0.25mg/L、FeSO4.7H2027.8mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、肌醇 100mg/L、甘氨酸 2mg/L、煙酸 0.5mg/L、鹽酸硫胺素`1.0mg/L、鹽酸吡哆醇0.5mg/L ;步`驟2)中的MS基本培養(yǎng)基中還包含6.0g/L瓊脂粉和30.0g/L 的蔗糖；主要包含以下成分:NH4N03 1650mg/L、KN03 1 900mg/L、MgSO4.7H20 370mg/UKH2PO4 170mg/L、CaCl2.2H20 440 mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4.4H20 22.3mg/L、ZnSO4.7H20 8.6mg/L、NaMoO4.2H20 0.25mg/L、CuSO4.5H20 0.025mg/L、CoCl2.6H20`0.025mg/L、FeSO4.7H20 27.8mg/L、Na2-EDTA 37.25mg/L、肌醇 100mg/L、甘氨酸 2mg/L、煙酸0.5mg/L、鹽酸批P多醇0.5mg/L、鹽酸硫胺素0.1 mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的歐洲鵝耳櫪的組織培養(yǎng)方法，其特征是:步驟3)中的1/2WPM基本培養(yǎng)基，主要包含以下成分=NH4NO3 200mg/L、Ca(NO3)2.4H20 278mg/L、CaCl2.2H2048mg/L、MgSO4.7H20 185mg/L、KH2PO4 85mg/L、K2SO4 495mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4.H2O`17.7mg/L、ZnS04.7Η20 8.6mg/L,NaMoO4.2Η20 0.25mg/L、CuS04.5Η20 0.25mg/L、FeS04.7Η20`27.8mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、肌醇 100mg/L、甘氨酸 2mg/L、煙酸 0.5mg/L、煙酸硫胺素`1.0mg/L、鹽酸批卩多醇0.5mg/L ;附力口 0 1.0 mg/L卩引哚丁酸,(Tl.0mg/的萘乙酸；還包含`6.5g/L瓊脂粉和15.0g/L的蔗糖，PH 5.8 6.0，光照12h/d，光照強(qiáng)度為2000 Ix ;培養(yǎng)至60天時(shí)統(tǒng)計(jì)其增殖倍數(shù)、平均株高、生根率、平均根數(shù)和平均根長(zhǎng)；當(dāng)根長(zhǎng)到3飛cm時(shí)，將生根試管苗的瓶口封口膜打開(kāi)，在培養(yǎng)室散射光下進(jìn)行開(kāi)口煉苗，使試管苗逐漸與外界接觸，在I周內(nèi)將周圍環(huán)境濕度保持在70°/Γ80%，逐步提高小苗適應(yīng)外界環(huán)境的能力；5天后取出試管苗洗凈根部的培養(yǎng)物質(zhì)，移栽到育苗基質(zhì)中生長(zhǎng)，基質(zhì)由珍珠巖、泥炭土、園土 2:2:1組成，充分混合后用多菌靈消毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種歐洲鵝耳櫪的組培快繁方法，其特征是包括如下工藝選取生長(zhǎng)飽滿的莖尖，表面消毒后接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；培養(yǎng)4周統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。剪取1.5~2.0cm莖段接種于增殖培養(yǎng)基上，60天統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)。剪取生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)3~4cm的單苗接種于生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。培養(yǎng)50天統(tǒng)計(jì)生根率、平均根數(shù)和平均根長(zhǎng)。當(dāng)根長(zhǎng)到3~5cm時(shí)進(jìn)行煉苗移栽，30天后，調(diào)查其移栽成活率。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)能夠誘導(dǎo)歐洲鵝耳櫪試管苗快速增殖產(chǎn)生大量不定芽，成活率高達(dá)85%，為歐洲鵝耳櫪的工廠化育苗提供了一條有效的途徑。
文檔編號(hào)A01H4/00GK103181325SQ20131011056
公開(kāi)日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2013年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月1日
發(fā)明者祝遵崚, 金建邦, 徐惠群, 仲秀林 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué), 江蘇紫藤園藝綠化工程有限公司