新型溶菌酶制劑及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種新型溶菌酶口服制劑的制備，即通過合成溶菌酶二聚體蛋白并以此制備溶菌酶二聚體海藻酸鈉微球，與谷芽或其湯劑或其吸附劑混合制得。該制劑明顯促進溶菌酶蛋白的腸道吸收效率，作為新型飼料添加劑，可取代抗生素增強豬等哺乳類養殖動物的生產性能和非特異性免疫功能。
【專利說明】新型溶菌酶制劑及其制備方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及一種新型溶菌酶口服制劑的制備，其特征表現在溶菌酶二聚體海藻酸鈉微球和谷芽或其湯劑或其吸附劑混合組成，二者缺一不可；該制劑明顯促進溶菌酶蛋白的腸道吸收效率，作為新型飼料添加劑，可取代抗生素增強豬等哺乳類養殖動物的生產性能和非特異性免疫功能。
【背景技術】
[0002]溶菌酶(Lysozyme)是一種蛋白質類的生物酶，具有抗菌、抗病毒、免疫調節以及止血、消腫、加快組織修復等功能，是一種重要的非特異性免疫因子，在醫藥領域中有著廣泛的應用。溶菌酶二聚體是溶菌酶經合成后的二聚體形式，近年發現除保留單體的所有優點(抗菌、抗病毒、無毒副作用)(W089/11294)外，還有較強的免疫調制作用，雙向功能性調節免疫系統平衡，體現在細胞因子網絡水平上調制TNF\IL-2\IL-6\INF等的合成，活化吞噬細胞以及相關免疫反應，特別有利于治療和預防高水平TNF引致的疾病(W094/01127)以及免疫缺陷或免疫抑制引致的疾病(W096/21463)。如:治療和預防膿毒癥和敗血性休克(特別是感染性創傷)、急性消化道和呼吸道疾病、流感引發的肺炎引致的急性細菌或病毒性感染、少精癥、牛乳房炎、病毒和細菌性皮膚病和生殖器官疾病；增強精子活力、促進牛卵母細胞成熟和受精；明顯抑制以下病毒的繁殖:牛痘，HSV-1，犬細小病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，以及流感病毒等。溶菌酶二聚體治療豬病最有效。對下列疾病幾乎100%有效:產后無乳(MMA綜合征)，痢疾，化膿性子宮炎，流感，大腸桿菌病，特別是對豬腹瀉的治愈率達到94?98%(US88/01785)。
[0003]溶菌酶二聚體對上述疾病的治療和預防作用有一基本前提，即它是在體內以血藥濃度的形式發揮生理功能?，F有口服溶菌酶藥物或飼料添加劑主要在胃腸道起作用，其藥靶主要為直接作用于胃腸道致病菌，或者是作為體外用藥，體內吸收入血的效率非常低，藥理用途十分有限。體內注射可直接提高溶菌酶的血藥濃度，但對于開發非治療性的預防制齊U，對于開發預防疾病性質的新型飼料添加劑沒有實際應用價值。因此，研究和開發溶菌酶二聚體的口服制劑或經口服用的飼料添加劑，對于養殖動物預防疾病、提高非特異性免疫功能、保持健康活力，特別在抗生素的濫用、耐藥等問題非常突出的今天，尤其具有重要的現實意義和巨大的潛在經濟價值。
[0004]蛋白質是生物大分子，穩定性差，經口服用必須經受整個消化系統的嚴酷理化環境，體內吸收效率低下，生物利用度極低。蛋白類大分子要順利吸收入血必須克服二道天然屏障:一是胃腸道中酸、堿以及眾多消化酶的分解和降解作用；二是腸道的吸收屏障，極性的蛋白質大分子通常不能完整吸收入血。針對這二道屏障已有多種技術實現蛋白質的完整吸收入血。其一是發展蛋白類大分子載體，其中海藻酸鈉微球因其天然高分子多糖的特點，具有良好的生物相容性和可生物降解性，可達到蛋白類大分子良好的負載、保護、控釋、以及在回結腸定位釋放等目標，特別適用作蛋白質的運載系統。其二是發展增強腸道對蛋白類大分子的吸收促進劑。研究中的腸道吸收促進劑包括小分子化合物和聚合物等，如中鏈脂肪酸鈉鹽、膽酸鹽類、一氧化氮供體等小分子類吸收促進劑，聚合物類吸收促進劑有交聯聚丙烯酸酯等，其中多數腸道吸收促進劑的作用與其細胞毒性高度相關，所以尋找無毒而有效的腸道吸收促進劑是研究人員關注的焦點。為達到蛋白類大分子完整吸收的目標以上二個環節缺一不可。
[0005]谷芽是一種食物，也是一味中藥，主治消食化積，健脾開胃。我們在工作中首先發現谷芽還具有促進蛋白類大分子完整吸收的功能，因為其安全、有效、天然、價廉等特點，我們將其開發為一種有效的腸道吸收促進劑，再通過溶菌酶二聚體海藻酸鈉微球的制備，二者結合形成蛋白類大分子運載系統，在胃腸道中有效保護溶菌酶二聚體蛋白并成功促進其腸道吸收，大幅度提高生物利用度，切實賦予其實際應用價值，不僅可開發為豬等哺乳類養殖動物的新型飼料添加劑，也具有發展人用口服蛋白類藥物的潛在應用。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供一種新型溶菌酶口服制劑，它由溶菌酶二聚體海藻酸鈉微球和谷芽或其湯劑或其吸附劑以一定比例混合組成，能明顯促進溶菌酶蛋白的腸道吸收效率，作為新型飼料添加劑，可取代抗生素增強豬等哺乳類養殖動物的生產性能和非特異性免疫功能。
[0007]本發明的目標通過下述技術方案實現，該技術方案和實施例僅是對本發明的進一步說明，并不對本發明覆蓋的范圍作任何限制:
谷芽或其湯劑或其吸附劑的制備:
谷芽干粉:商品炒谷芽粉碎。
[0008]谷芽湯劑:商品炒谷芽按中藥常規方法煎制，1.0Kg煎制得1.0L藥液湯劑。
[0009]谷芽湯劑玉米淀粉吸附劑:上述湯劑用等重玉米淀粉吸附并干燥。
[0010]谷芽燒煮干燥粉:商品炒谷芽加水(1:1)燒煮0.5hr后干燥粉碎。
[0011 ](上述谷芽湯劑計量時均倒推至其干重)
溶菌酶二聚體的合成:
合成基本按Alorich Chemisry公司說明書進行并純化，純度為30%?95%。
[0012]溶菌酶二聚體海藻酸鈉微球的制備:
按常規方法如滴注法、噴霧法等制備，在氯化鈣溶液中成形和固定，加溫干燥。制備主要參數為:海藻酸鈉濃度1%?5% (W/V)，溶菌酶二聚體濃度0.1%?1.0%(W/V)，氯化鈣濃度3%?10%。制備所得載藥微球具有良好的分散性和穩定性，粒徑范圍I?IOOOym (水分約10%)，載藥量為0.5?5.0%。
[0013]小鼠動物實驗:
小鼠分作六組，其中四組實驗組(I?4)，一組對照組(5)，一組空白組(6)。
[0014]5只/組，組合飼料自由采食或灌胃(I次/天)。
[0015]鼠血清溶菌酶酶活測定:
按GBT25879進行。正常鼠血清中加入定量溶菌酶制作鼠血清溶菌酶酶活測定標準曲線(圖W。實驗鼠血清溶菌酶樣品酶活測定結果(圖1B)。
[0016]鼠血清溶菌酶濃度測定(ELISA):
采用常規間接競爭ELISA法定量測定。溶菌酶包被，溶菌酶梯度標準液(鼠血清溶菌酶樣品)和兔抗溶菌酶抗血清競爭結合，HRP-羊抗兔IgG反應，底物顯色并A49tl測定。
[0017]鼠血清溶菌酶濃度測定標準曲線(圖2A)。鼠血清溶菌酶樣品濃度測定結果(圖2B)。
[0018]斷奶仔豬實驗:
DLY斷奶仔豬(28日齡)設試驗組、對照組和抗生素組。試驗組日糧中添加溶菌酶二聚體飼料添加劑。自由采食，考察其對斷奶仔豬生產性能和免疫機能的影響。
[0019]實驗結果:
前期工作證明溶菌酶以原粉形式施喂基本檢測不出血藥濃度，腸道吸收極低。現小鼠動物實驗結果(圖A\B)表明，谷芽或其湯劑或其吸附劑與溶菌酶二聚體海藻酸鈉微球混合施喂，都能大幅提高溶菌酶的血藥濃度，實驗證明本專利谷芽與溶菌酶二聚體海藻酸鈉微球的組合對于增強溶菌酶腸道吸收、提高血藥濃度是有效的。同時，吸收入血的溶菌酶仍保留酶學活性，表明溶菌酶可以完整形式吸收入血，有利于其在體內發揮生物學功能。
[0020]斷奶仔豬實驗表明，飼糧中添加溶菌酶二聚體制劑可提高斷奶仔豬平均日增重，顯著增強腹腔巨噬細胞的吞噬活性及其吞噬指數，提高血液中中性粒細胞的吞噬率，從而提高斷奶仔豬免疫功能。所有實驗動物體況良好，未產生任何不良反應和影響。
[0021]結論:
本專利主張的谷芽與溶菌酶二聚體海藻酸鈉微球的組合對于增強溶菌酶腸道吸收、提高豬等哺乳類養殖動物的生產性能和免疫機能是有效并安全的，斷奶仔豬日糧中添加本制劑可以替代抗生素。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1A:鼠血清溶菌酶酶活測定標準曲線。
[0023]圖1B:鼠血清溶菌酶酶活(連續給藥23天)。
[0024]圖2A:鼠血清溶菌酶濃度測定標準曲線。
[0025]圖2B:鼠血清溶菌酶濃度(連續給藥23天)。
【具體實施方式】
[0026]下面通過具體的實施例進一步說明本發明是如何實現的:
實施例1、溶菌酶二聚體的合成:
實驗材料為蛋清溶菌酶，交聯劑DMS (Dimethyl suberimidate dihydrochloride),合成基本按Alorich Chemisry公司說明書進行。20K超濾膜裝置濃縮并透析，二聚體純度平均為42%。
[0027]實施例2、溶菌酶二聚體海藻酸鈉微球(Lys.D_SA_MS)的制備:
按高壓噴霧法常規制備，制備主要參數為:海藻酸鈉濃度2.0% (W/V),溶菌酶二聚體濃度0.1% (W/V)，氯化鈣濃度3%。制備所得載藥微球具有良好的分散性和穩定性，粒徑范圍150?300 μ m (烘干后水分約10%)，載藥量為2.5%。
[0028]實施例3、谷芽干粉組(實驗組I)
制作IOOOg常規飼料，其中加入Lys.D-SA-MS 7.6g，谷芽干粉50g，二者混合比例為1:
6.5，小鼠自由采食連續23天。 實施例4、谷芽燒煮干燥粉組(實驗組2)
制作IOOOg常規飼料，其中加入Lys.D-SA-MS 7.6g，谷芽燒煮干燥粉50g，二者混合比例為1:6.5，小鼠自由采食連續23天。
[0029]實施例5、谷芽湯劑玉米淀粉吸附劑組(實驗組3)
制作IOOOg常規飼料，其中加入Lys.D-SA-MS 7.6g，谷芽湯劑玉米淀粉吸附劑50g，二者混合比例為1:6.5，小鼠自由采食連續23天。
[0030]實施例6、谷芽湯劑組(實驗組4)
每只小鼠每天灌胃I次，劑量Lys.D-SA-MS 30mg，谷芽湯劑0.2ml (0.2g)，二者混合比例為1:6.7，連續灌胃23天。
[0031 ] 實施例7、對照組(對照組5 )
制作IOOOg常規飼料，其中僅加入Lys.D-SA-MS 7.6g，小鼠自由采食連續23天。
[0032]實施例8、空白組(空白組6)
常規飼料，小鼠自由采食連續23天。
[0033]實施例9、溶菌酶二聚體飼料添加劑對斷奶仔豬生產性能和免疫機能的影響 試驗組飼糧制備:
將90g Lys.D-SA-MS和1.5kg谷芽燒煮干燥粉與I噸常規飼糧混合。放大則按此比例。
[0034]對照組飼糧制備:
常規飼糧。
[0035]抗生素組飼糧制備:
常規飼糧添加國家規定允許添加的抗生素品種和限量。
[0036]斷奶仔豬實驗:
斷奶仔豬試驗組、對照組和抗生素組各為36頭，各組飼糧自由采食連續28天。測定斷奶仔豬生產性能指標和非特異性免疫指標。
【權利要求】
1.溶菌酶二聚體制劑能明顯促進溶菌酶蛋白的腸道吸收效率，作為新型飼料添加劑，可取代抗生素增強豬等哺乳類養殖動物的生產性能和非特異性免疫功能；其特征表現在溶菌酶二聚體海藻酸鈉微球和谷芽或其湯劑或其吸附劑的混合組成，二者缺一不可；混合比例為1:2?1:50 (W/W)(谷芽湯劑計量時則倒推至其干重)。
2.權利要求1中溶菌酶二聚體按文獻方法合成并純化，純度為30%?95%;溶菌酶二聚體海藻酸鈉微球按常規方法制備，其主要特征為:粒徑范圍I?1000 μ m (水分約10%)。
3.權利要求1中谷芽或其湯劑或其吸附劑是指:谷芽粉碎干粉、谷芽湯劑、谷芽湯劑玉米淀粉吸附劑、谷芽燒煮干燥粉等。
【文檔編號】A23K1/17GK103518978SQ201310497875
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月22日 優先權日:2013年10月22日
【發明者】陳宇光, 黃巖, 姚雪麗, 朱振華, 蘇潔, 戴小峰 申請人:上海大學