一種山參發根及其培育方法
【專利摘要】本發明公開了一種山參發根及其培育方法，以山參根、莖及葉片等為外植體，用活化了的發根農桿菌進行轉化，使發根農桿菌Ri質粒上的T-DNA上的致發根基因整合到山參外植體細胞核DNA中，表達形成毛狀根，每一個發根即為一個單克隆。經過多次繼代培養及反復篩選，逐步建立起山參發根懸浮培養無性系。提供了一種新的山參資源，能夠工業集約化生產，不需要占用耕地，不受天氣、病蟲害等自然界條件的影響，實現了山參有效藥用成分生產化室內。
【專利說明】一種山參發根及其培育方法
【技術領域】
[0001] 本發明公開了一種山參發根及其培育方法，開辟了一個山參開發利用的新途徑， 為山參發根生產天然藥物提供了可能，屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]發根農桿菌A4具有轉移其Ri質粒上的基因，能誘導藥用植物產生發狀根， 該發根能在液體培養基內快速生長，并表達藥用植物的有效藥用成分。山參(Mountain PanaxGinseng C.A.Meyer)根內含有人參皂苷較多，有些特殊人參皂苷僅在山參中存在，具抗癌作用，用量極微就有很好的療效。
[0003]目前，國內主要是從山參參根內提取人參皂苷供藥用。但天然資源受氣候的影響，季節性強，病蟲害等也會嚴重影響山參的產量和質量；擴大山參的種植，必定與糧爭地， 而我國的土地資源十分有限；而且，山參入藥需15年以上的時間，其根頭小，單產低，嚴重制約山參在生產上的應用。近30年來，隨著生物技術的發展，利用發根農桿菌誘導藥用植物產生發根，并利用發根來生產藥用植物有效成分研究得越來越深入，這是因為其有以下優點:第一，天然山參資源有限；第二，山參中有無法替代的、特效的、高經濟價值的藥用成分，第三，可以實現山參中有效藥用成分的室內可控生產。
[0004]目前國內外均未見轉化山參發根成功的報道。
[0005]
【發明內容】

本發明提供一種山參發根，解決了人工種植山參生長周期長、繁殖速度慢，遺傳上不夠穩定等不利因素，實現了室內生產山參。
[0006]本發明還公開了上述山參發根的培育方法，以山參根、莖及葉片等為外植體，用活化了的發根農桿菌進行轉化，使發根農桿菌Ri質粒上的T-DNA上的致發根基因整合到山參外植體細胞核DNA中，表達形成毛狀根。
[0007]本發明提供的山參發根，又稱之為發根(hairy root);其特征在于:
以山參根、莖及葉片等為外植體，用活化了的發根農桿菌進行轉化，使發根農桿菌Ri 質粒上的T-DNA上的致發根基因整合到山參外植體細胞核DNA中，表達形成毛狀根，每一個發根即為一個單克隆。經過多次繼代培養及反復篩選，逐步建立起山參發根懸浮培養無性系。
[0008]本發明公開的山參發根的制備方法，其技術解決方案如下:
以山參根、莖及葉片等為外植體，用活化了的發根農桿菌進行轉化，使發根農桿菌Ri 質粒上的T-DNA上的致發根基因整合到山參外植體細胞核DNA中，表達形成毛狀根。每一根山參發根即為一個單克隆，經過繼代培養和多次篩選，逐步建立起山參懸浮培養無性系。
[0009]具體步驟如下:
1、外植體的預培養:
取山參新鮮、健康的根或莖或葉片，洗凈；用0.1%的升汞滅菌lOmin，無菌水漂洗4次， 每次不少于Imin,然后吸干表面水分；再于超凈臺上將外植體切成0.5cmX 1.0cm大小,轉移到已滅菌的1/2MS固體培養基上(每瓶5片)；于黑暗條件下預培養2~7d。
[0010]2、發根農桿菌的制備:
挑取發根農桿菌單菌落，接種于5mL液體YEB內，28°C黑暗條件下振蕩培養過夜，于次日接種到50ml液體YEB中繼培養4~6h后備用。
[0011]3、山參葉片與發根農桿菌共培養轉化:將經過預培養的山參外植體浸入已培養好的發根農桿菌菌液中，感染5~10 min，然后，用無菌濾紙將菌液吸凈；再接種于含抗生素 1/2MS固體培養基上，約經過30cT50d培養生出發根。
[0012]4、發根培養:
去菌培養:切割下由外植體上長出的發根，置于含抗生素(頭孢噻吩30(T500mg/L) 1/2MS固體培養基上，進行去菌培養，每:T5d轉繼代I次，進行3飛次；
擴大培養:將無菌的發根1.0g移入盛有50mL 1/2MS液體培養基的IOOmL三角瓶內，于黑暗條件下，室溫22°C~25°C，llOrpm，懸浮培養。
[0013]山參發根無性系的建立:經:T5代的懸浮培養，按發根克隆的來源分別建立不同的無性系。
[0014]此外，利用本發明的山參發根產生的愈傷組織，還可篩選出細胞懸浮培養無性系。
[0015]本發明與山參栽培根相比的積極效果在于:
提供了一種新的山參資源，能夠工業集約化生產，不需要占用耕地，不受天氣、病蟲害等自然界條件的影響，實現了山參有效藥用成分生產化室內；解決了人工種植山參的生長周期長，需15年以上才能采收I次，并且受氣候及病蟲害影響大導致質量不穩定的問題；同時也克服山參繁殖速度慢，遺傳上不夠穩定等不利因素。山參發根可以周年不斷地提供山參資源，并能保證質量的穩定，由于山參發根是在人工控制下的無菌培養，生長周期短(約 40d)，因此處理工藝成本較低。
[0016]本發明山參發根具有生物學特征如下:
1、發根生長形態和農桿堿的鑒定:轉化的山參發根無向地性，隨機交叉‘無序’生長，多 ‘根毛’，多分枝，生長快，具有典型的轉化發根特征。農桿堿的鑒定表明Ri質粒的T-DNA的確整合到山參細胞核DNA上，因為發根農桿菌所含冠癭堿合成酶基因只能在真核生物中表達。
[0017]2、生長曲線:為一典型的S形曲線。培養30d可增殖20倍(參見圖4)。
[0018]3、山參發根培養基的篩選:對常用的多種培養基進行比較的基礎上，對基培養基進行了優化篩選。認為:1/2MS液體培養基對其生長有利。pH5.(T6.0。
[0019]4、pH對山參發根生長的影響:在pH5.(T6.0的范圍內，山參發根生長良好。
[0020]5、蔗糖濃度對山參發根生長的影響:在發根培養中，蔗糖是作為碳源和能源，還可調節培養液滲透壓，以蔗糖含量為2.(T4.0%為宜。
[0021]6、外源激素對山參發根生長的影響:本山參發根在無激素培養液內可自行生長。
[0022]7、山參發根次生代謝物質:HPLC分析表明，發根中人參皂苷與原植物中所含人參阜苷相同，含量相近。
[0023]8、光對山參發根生長的影響:在室內自然光下，光對山參發根生長表現較強的抑制作用，其生物量僅為黑暗培養條件下的1/3。【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是實施例1轉化山參發根培養的實物照片。
[0025]圖2是實施例2轉化山參發根培養的實物照片。
[0026]圖3是實施例3轉化山參發根培養的實物照片。
[0027]圖4為山參發根生長曲線。
[0028]【具體實施方式】 實施例1
取山參新鮮健康的根洗凈；用0.1%的升汞滅菌lOmin，無菌水漂洗4次，每次不少于Imin,然后吸干表面水分；再于超凈臺上將葉片切成0.5cmX 1.0cm大小，于黑暗條件下預培養疒7d。將經過預培養的山參外植體浸入已培養好的發根農桿菌菌液中，感染5~10 min0再接種于含抗生素1/2MS固體培養基上(蔗糖含量為2%)，22°C~25°C下，約經過30d至50d培養生出發根。切割下長出的發根，置于含抗生素頭孢噻吩300mg/L的1/2MS固體培養基上，進行去菌培養。在黑暗條件下，室溫22~25°C，IlOrpm，將無菌的發根經3飛代的懸浮培養，可獲得不同的發根無性系(參見圖1轉化山參發根培養的實物照片)。
[0029]實施例2
取山參新鮮健康的莖洗凈；用0.1%的升汞滅菌lOmin，無菌水漂洗4次，每次不少于Imin,然后吸干表面水分；再于超凈臺上將葉片切成0.5cmX 1.0cm大小，于黑暗條件下預培養疒7d。將經過預培養的山參外植體浸入已培養好的發根農桿菌菌液中，感染5~10 min0再接種于含抗生素1/2MS固體培養基上(蔗糖含量為3%)，22°C~25°C下，約經過30d至50d培養生出發根。切割下長出的發根，置于含抗生素頭孢噻吩400mg/L的1/2MS固體培養基上，進行去菌培養。在黑暗條件下`，室溫22~25°C，IlOrpm，將無菌的發根經3飛代的懸浮培養，可獲得不同的發根無性系(參見圖2)。
[0030]實施例3
取山參新鮮健康的葉片洗凈；用0.1%的升汞滅菌lOmin，無菌水漂洗4次，每次不少于Imin,然后吸干表面水分；再于超凈臺上將葉片切成0.5cmX 1.0cm大小，于黑暗條件下預培養疒7d。將經過預培養的山參外植體浸入已培養好的發根農桿菌菌液中，感染5~10 min0再接種于含抗生素1/2MS固體培養基上(蔗糖含量為4%)，22°C~25°C下，約經過30d至50d培養生出發根。切割下長出的發根，置于含抗生素頭孢噻吩500mg/L的1/2MS固體培養基上，進行去菌培養。在黑暗條件下，室溫22~25°C，IlOrpm，將無菌的發根經3飛代的懸浮培養，可獲得不同的發根無性系(參見圖3)。
【權利要求】
1.一種山參發根的制備方法，其特征在于:以山參根、莖及葉片等為外植體，用活化了的發根農桿菌進行轉化，使發根農桿菌Ri 質粒上的T-DNA上的致發根基因整合到山參外植體細胞核DNA中，表達形成毛狀根；每一根山參發根即為一個單克隆，經過繼代培養和多次篩選，逐步建立起山參懸浮培養無性系。
2.—種山參發根的制備方法，包括以下步驟:1)外植體的預培養:取山參新鮮、健康的根或莖或葉片，洗凈；用0.1%的升汞滅菌lOmin，無菌水漂洗4次， 每次不少于Imin,然后吸干表面水分；再于超凈臺上將外植體切成0.5cmXl.0cm大小,轉移到已滅菌的1/2MS固體培養基上；于黑暗條件下預培養2~7d ；2)發根農桿菌的制備:挑取發根農桿菌單菌落，接種于5mL液體YEB內，28°C黑暗條件下振蕩培養過夜，于次日接種到50ml液體YEB中繼培養4~6h后備用；3)山參葉片與發根農桿菌共培養轉化:將經過預培養的山參外植體浸入已培養好的發根農桿菌菌液中，感染5~10 min，然后，用無菌濾紙將菌液吸凈；再接種于含抗生素1/2MS 固體培養基上，約經過30cT50d培養生出發根；4)發根培養:去菌培養:切割下由外植體上長出的發根，置于含抗生素(頭孢噻吩30(T500mg/L)的 1/2MS固體培養基上，進行去菌培養，每:T5d轉繼代I次，進行3飛次；擴大培養:將無菌的發根1.(`^移入盛有501!^ 1/2MS液體培養基的IOOmL三角瓶內，于黑暗條件下，室溫22°C~25°C，llOrpm，懸浮培養；山參發根無性系的建立:經3飛代的懸浮培養，按發根克隆的來源分別建立不同的無性系。
【文檔編號】A01H5/06GK103555758SQ201310498167
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月22日 優先權日:2013年10月22日
【發明者】李昌禹, 王英平, 盧淑波, 艾軍, 鄭培和, 雷秀娟 申請人:中國農業科學院特產研究所