一種不結球白菜與蘿卜遠緣雜交新種質創制方法
【專利摘要】本發明公開了一種不結球白菜與蘿卜遠緣雜交新種質創制方法。該育種方法是以同源四倍體不結球白菜為母本，以同源四倍體蘿卜為父本，進行人工有性雜交育種，利用重復授粉以及離體胚挽救技術，獲得同源四倍體不結球白菜與同源四倍體蘿卜遠緣雜交新種質。本發明首次采用同源四倍體不結球白菜與同源四倍體蘿卜有性雜交育種途徑以及離體胚挽救技術，獲得遠緣雜交新種質，與傳統二倍體間雜交獲得合子胚再進行倍性加倍相比，無需進行染色體加倍操作，能顯著縮短育種時間，且雜種F1能穩定遺傳。本發明創制的新種質具有不結球白菜與蘿卜遺傳物質，具有更廣泛的遺傳多樣性。
【專利說明】一種不結球白菜與蘿卜遠緣雜交新種質創制方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于農作物育種領域，涉及一種不結球白菜與蘿卜遠緣雜交新種質創制方法。
【背景技術】
[0002]不結球白菜(Brassicacampestris ssp.chinensis Makino)是十字花科蕓薹屬植物，是人們喜愛的大眾化蔬菜，在南方廣泛種植，北方也大量引種栽培，有關部門常將其作為衡量蔬菜供應情況的 主要標志近年來，日本、美國及東南亞和歐洲一些國家也廣泛引種，已逐漸成為世界性蔬菜[I]。蘿卜(Raphanus sativus L.)為十字花科蘿卜屬植物，是我國最大的蔬菜作物之一，亦是世界性蔬菜，具有較高的食用價值和醫用價值[2]。在我國，十字花科植物是一個遺傳類型極其豐富、變異極其廣泛的巨大基因庫，育種學家們以豐富的種質資源為材料，采用有性雜交的方法創造出了一大批新種質、新品種，并在不結球白菜生產上發揮了重要作用。
[0003]近年來，生物技術的融入，對提高雜交育種的目的性和縮短育種周期等方面起到了促進作用，對常規育種是一種改進和提高。隨著育種工作的深入，植物種內的遺傳資源利用日益枯竭，同時也發現某些優良性狀的基因庫貧乏，采用種內資源進行常規育種難以取得很大突破，采用遠緣雜交技術結合現代生物技術利用與綜合現有栽培種、野生種的優良性狀，已成為種質創新的一條有效途徑，日益受到育種者的重視。在不結球白菜遠緣雜交育種方面，未見相關報道。
[0004]傳統遠緣雜交方法為遠緣物種二倍體間雜交獲得合子胚，再通過人工誘導染色體加倍等方法獲得新種質，育種時間延長，且染色體加倍過程中易發生不穩定變異。

【發明內容】

[0005]本發明目的在于針對上述傳統遠緣雜交育種方法時間長、雜種F1易發生不穩定變異問題，提供一種不結球白菜與蘿卜遠緣雜交新種質創制方法。
[0006]本發明的目的可通過如下技術方案實現:
[0007]—種不結球白菜與蘿卜遠緣雜交新種質創制方法，包含以下步驟:
[0008](I)授粉方法:在盛花期，以同源四倍體白菜為母本，同源四倍體蘿卜為父本，于開花前一天套硫酸紙袋，次日開始采用重復授粉法進行人工授粉并套袋；
[0009](2)子房預處理并消毒:取授粉后10天的子房，保濕并置于4°C冰箱中處理24h，然后進行消毒；
[0010](3)子房培養:將消毒后的子房接到子房培養培養基中培養；所述的子房培養培養基為:MS+0.5g/L水解酪蛋白+0.8%瓊脂，pH為5.8 ;
[0011](4)幼胚分離及挽救培養:取培養15天后的子房，剝取幼胚，并接入胚挽救培養基，所述的胚挽救培養基為:MS+5%椰汁+0.5g/L水解酪蛋白+0.8%瓊脂，pH為5.8 ;
[0012](5)分化培養:因大多數幼胚不能直接發育成植株，待幼胚長至子葉形胚時，切取子葉，接入分化培養基誘導不定芽分化，所述的分化培養基為:MS+2mg/L6-BA+0.lmg/LNAA+5% 椰汁 +0.8% 瓊脂，pH 為 5.8 ;
[0013](6)繼代培養:將誘導后的不定芽叢芽切成單個芽接入繼代培養基進行繼代培養，，所述的繼代培養基為:MS+0.2mg/L6-BA+0.02mg/L ΝΑΑ+0.8%瓊脂，pH 為 5.8 ;
[0014](7)生根培養:繼代2周后選取生長健壯的外植體，接入生根培養基誘導生根，所述的生根培養基為:l/2MS+0.2mg/LNAA+0.8%瓊脂，pH為5.8 ;
[0015](8)馴化移栽:外植體誘導形成根系后開瓶煉苗48_72h，洗凈根部栽入培養土中培養2周，前期遮蔭處理，當植株長到4-5片葉后移栽到大田；所述的培養土為蛭石、泥炭土及珍珠巖以1:2:1的體積比混合而成；
[0016](9)形態學鑒定:從匕出苗到成熟，對其主要形態特征進行觀察；
[0017](10)細胞學鑒定:按照鄭金雙[3]的方法，對F1進行染色體計數；
[0018](11) SSR分子鑒定:利用SEQ ID N0.1及SEQ ID N0.2所示的一對SSR引物對F1進行SSR共顯性分子標記鑒定；
[0019](12)雜種F1育性鑒定:在盛花期，對雜種F1進行單株套袋自交，統計平均結實率。
[0020]其中，所述的人工授粉每天授粉一次，重復三次。 [0021]所述的子房消毒是將選取的子房用75%的酒精消毒30s，然后用質量比為0.1%的HgCl2消毒IOmin,最后用無菌水沖洗3次待用。
[0022]有益效果:
[0023]本發明首次通過同源四倍體不結球白菜與同源四倍體蘿卜有性雜交育種途徑以及離體胚挽救技術，獲得遠緣雜交新種質，得率達到了 4%，與傳統二倍體間雜交獲得合子胚再進行染色體倍性加倍相比，無需進行染色體加倍操作，能顯著縮短育種時間，且雜種F1能穩定遺傳。本發明創制的新種質具有不結球白菜與蘿卜遺傳物質，具有更廣泛的遺傳多樣性。獲得的新種質經過形態學、細胞學和SSR共顯性分子標記技術證實均為屬間雜種。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1遠緣雜種F1鑒定。(a)花期F1表型；(b)不結球白菜葉片(左)、蘿卜葉片(右)、雜種F1葉片(中);(c)不結球白菜角果(上)、蘿卜角果(中)、雜種F1角果(下Md)雄蕊、雌蕊，不結球白菜(左)、蘿卜(右)、雜種F1 (中)；(e)花，不結球白菜(左)、蘿卜(右)、雜種F1 (中);
(f)引物Nal4D09SSR 共顯性，Marker (Μ)、不結球白菜(P1X 蘿卜(P2)、雜種 F1 (1,2,3,4)
(g)雜種F1染色體計數(2n=4X=38)。標尺:1cm。
[0025]圖2遠緣雜種F1與親本表型。同源四倍體不結球白菜(左)、同源四倍體蘿卜(右)、雜種F1 (中)。
【具體實施方式】
[0026]實施例不結球白菜與蘿卜遠緣雜交新種質創制方法，包括:
[0027]基本培養基為MS培養基；以下培養基于121°C，1.1Mpa條件下滅菌15分鐘。
[0028]①子房培養培養基(I ):MS+0.5g/L水解酪蛋白+0.8%瓊脂，pH為5.8 ;
[0029]②胚挽救培養基(II):MS+5%椰汁+0.5g/L水解酪蛋白+0.8%瓊脂，pH為5.8 ;
[0030]③分化培養基(III):MS+2mg/L6-BA+0.lmg/L NAA+5% 椰汁 +0.8 % 瓊脂，pH 為 5.8 ;[0031 ]④繼代培養基(IV):MS+0.2mg/L6-BA+0.02mg/L ΝΑΑ+0.8 %瓊脂，pH 為 5.8 ;
[0032]⑤生根培養基(V): 1/2MS+0.2mg/LNAA+0.8 % 瓊脂，pH 為 5.8。
[0033](I)授粉方法:在盛花期，以同源四倍體不結球白菜[4] (2n=4X=40)為母本，同源四倍體蘿卜[5] (2n=4X=36)為父本，于開花前一天套硫酸紙袋，次日開始采用重復授粉法進行人工授粉(每天授粉一次，重復三次)并套袋；
[0034](2)子房預處理及消毒:取授粉后10天的子房，保濕并置于4°C冰箱中處理24h ；選取的子房用75%的酒精消毒30s,然后用質量比為0.1%的HgCl2消毒IOmin,最后用無菌水沖洗3次待用；
[0035](3)子房培養:將消毒后的子房接到子房培養培養基(I )中培養；
[0036](4)幼胚分離及挽救培養:取培養15天后的子房，剝取幼胚，并接入胚挽救培養基
(II);
[0037](5)分化培養:因大多數幼胚不能直接發育成植株，待幼胚長至子葉形胚時，切取子葉，接入分化培養基(III)誘導不定芽分化；
[0038](6)繼代培養:將誘導后的不定芽叢芽切成單個芽接入繼代培養基(IV)進行繼代
培養；
[0039](7)生根培養:繼代2周后選取生長健壯的外植體，接入生根培養基(V)誘導生根；
[0040](8)馴化移栽:外植體誘導形成根系后開瓶煉苗48_72h，洗凈根部栽入培養土(V(蛭石)=V (泥炭土):V (珍珠巖)=1:2:1)中培養2周，前期遮蔭處理，當植株長到4-5片葉后移栽到大田。
[0041](9)形態學鑒定:從匕出苗到成熟，對其主要形態特征進行觀察并拍照，結果發現:F1在株型、生長習性、葉柄顏色方面與不結球白菜一致，但葉柄形狀、角果形狀、葉脈顏色、花瓣顏色方面與蘿卜一致(圖1a~e)。
[0042](10)細胞學鑒定:按照鄭金雙[3]的方法，對F1進行染色體計數(圖lg)。經鑒定匕染色體數為38 (2n=20+18)，為同源四倍體不結球白菜(2n=4x=40)與同源四倍體蘿卜(2n=4x=36)的遠緣雜交種。
[0043](Il)SSR (simple sequence repeat)分子鑒定:按照單曉政[6]等的方法,利用SEQ ID N0.1及SEQ ID N0.2所示的一對SSR引物Nal4D09對F1進行SSR共顯性分子標記鑒定(圖1f)。
[0044]經過形態學、細胞學和SSR共顯性分子標記技術證實均為屬間雜種。
[0045](12)雜種F1育性鑒定:在盛花期，對雜種F1進行單株套袋自交，平均結實率為1.2%。
[0046] 表1不結球白菜與蘿卜遠緣雜交子房培養結果。
[0047]
【權利要求】
1.一種不結球白菜與蘿卜遠緣雜交新種質創制方法，其特征在于包含以下步驟: (1)授粉方法:在盛花期，以同源四倍體白菜為母本，同源四倍體蘿卜為父本，于開花前一天套硫酸紙袋，次日開始采用重復授粉法進行人工授粉并套袋； (2)子房預處理并消毒:取授粉后10天的子房，保濕并置于4°C冰箱中處理24h，然后進行消毒； (3)子房培養:將消毒后的子房接到子房培養培養基中培養；所述的子房培養培養基為:MS+0.5g/L水解酪蛋白+0.8%瓊脂，pH為5.8 ; (4)幼胚分離及挽救培養:取培養15天后的子房，剝取幼胚，并接入胚挽救培養基，所述的胚挽救培養基為:MS+5%椰汁+0.5g/L水解酪蛋白+0.8%瓊脂，pH為5.8 ; (5)分化培養:因大多數幼胚不能直接發育成植株，待幼胚長至子葉形胚時，切取子葉，接入分化培養基誘導不定芽分化，所述的分化培養基為:MS+2mg/L6-BA+0.lmg/L NAA+5%椰汁+0.8%瓊脂，pH為5.8 ; (6)繼代培養:將誘導后的不定芽叢芽切成單個芽接入繼代培養基進行繼代培養，，所述的繼代培養基為:MS+0.2mg/L6-BA+0.02mg/L ΝΑΑ+0.8%瓊脂，pH 為 5.8 ; (7)生根培養:繼代2周后選取生長健壯的外植體，接入生根培養基誘導生根，所述的生根培養基為:l/2MS+0.2mg/LNAA+0.8%瓊脂，pH 為 5.8 ; (8)馴化移栽:外植體誘導形成根系后開瓶煉苗48-72h，洗凈根部栽入培養土中培養2周，前期遮蔭處理，當植株長到4-5片葉后移栽到大田；所述的培養土為蛭石、泥炭土及珍珠巖以1:2:1的體積比混合而成； (9)形態學鑒定=WF1出苗到成熟，對其主要形態特征進行觀察； (10)細胞學鑒定:對F1進行染色體計數； (11)SSR分子鑒定:利用SEQID N0.1及SEQ ID N0.2所示的一對SSR引物對F1進行SSR共顯性分子標記鑒定； (12)雜種F1育性鑒定:在盛花期，對雜種F1進行單株套袋自交，統計平均結實率。
2.根據權利要求1所述的一種不結球白菜與蘿卜遠緣雜交新種質創制方法，其特征在于所述的胚挽救培養基為:MS+5%椰汁+0.5g/L水解酪蛋白+0.8%瓊脂，pH為5.8。
3.根據權利要求1所述的一種不結球白菜與蘿卜遠緣雜交新種質創制方法，其特征在于所述的分化培養基為:MS+2mg/L6-BA+0.lmg/L NAA+5%椰汁+0.8%瓊脂，pH為5.8。
4.根據權利要求1所述的一種不結球白菜與蘿卜遠緣雜交新種質創制方法，其特征在于所述的生根培養基為:l/2MS+0.2mg/LNAA+0.8%瓊脂，pH為5.8。
【文檔編號】A01H4/00GK103947536SQ201310643390
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2013年12月3日 優先權日:2013年12月3日
【發明者】張蜀寧, 李英, 孫成振, 鄭金雙, 王雅美, 侯喜林 申請人:南京農業大學