專利名稱：一種鑒定植物遠緣雜交種中外源染色體和染色體片段的方法
技術領域：
本發明涉及植物染色體涂染技術的建立及其在植物遠緣雜交種中外源染色體和染色體片段鑒定中的應用。具體地，本發明涉及一種利用染色體涂染技術鑒定植物遠緣雜交種外源染色體和染色體片段的方法。
背景技術：
小麥(Triticum aestirum L.) (2n = 6x = AABBDD)是世界上重要的糧食作物之一，其種植面積和產量均居于谷類作物首位。在我國，小麥僅次于水稻，在農業上占有十分重要的地位。中國小麥品種的遺傳基礎較為狹窄，在很大程度上限制了小麥產量的提高和品質的改良。小麥的近緣種是一個巨大的、彌足珍貴的基因資源庫，遺傳變異非常豐富，具 有許多栽培小麥所不具有的優良特性，如抗病、抗逆、耐瘠薄，高營養、高蛋白和大穗多花多粒等。因此，運用遠緣雜交、染色體工程的方法，將近緣種中的優良基因導入普通小麥基因組中，利用細胞分子生物學鑒定技術發掘、標記和利用近緣種染色體上潛在的抗病基因、營養高效基因、適應性和豐產性的基因，創制遠緣雜交新種質基因資源，可進一步拓寬小麥的遺傳基礎，提高其生產潛力，培育出多抗、營養高效、廣適、穩產型的小麥新品種，以保障我國的糧食安全。黑麥(Secale cereal L. ) (2n = 2x = 14)是最早也是最成功地用于改良小麥的近緣物種之一。黑麥具有許多普通小麥所不及的優良性狀，如抗病蟲性(銹病、白粉病、蚜蟲等)、抗逆性(耐寒、耐旱、耐瘠薄、耐鹽堿、耐干熱風等)、抗倒伏、分蘗力強且含有較高的賴氨酸等^2]。特別是黑麥IRS染色體片段上攜帶有抗葉銹病(Lr26)、抗條銹病(Yr9)、抗桿銹病(Srfl)、抗白粉病(Ρι·ο8)及抗飛虱(Gb2)等大量的抗性基因。據報道，黑麥的IR、2R、3R、6R染色體上分布的一些抗病基因已被導入小麥中[3]。中間偃麥草(Agropyromintermedium) (2n = 6x = 42)具有BYDV(Bailey yellowdwarf virus，大麥黃矮病)抗性，同時它具有許多可供小麥利用的優良農藝性狀，對桿銹、條銹、葉銹、白粉病和腥黑穗病免疫，高抗根腐病、叢矮病，抗葉枯病，并具有根莖再生能力，耐鹽能力強，是小麥育種的理想抗性來源之一。小冰麥異附加系TAI-27是將中間偃麥草(又稱天藍冰草)的兩個染色體組14對染色體，分別附加到普通小麥中建立起來的兩套小冰麥異附加系中的附加系之一 [4]，經人工接種鑒定，表現為高抗大麥黃矮病[5]，表明已將中間偃麥草的BYDV抗性基因轉移到了 TAI-27中，為小麥的抗性育種提供了優質的抗源[4]。長 ill 麥草(Elytrigia elongate = Thinopyrum elongatum = Agropyronelongatum) (2n = IOx = 70)具有抗病、抗逆、高蛋白等多種優良性狀,是小麥遺傳改良中應用最為廣泛的近緣野生種之一。中國科學院院士李振聲等發現長穗偃麥草有很好的抗銹性，于是以長穗偃麥草為主系統開展遠緣雜交研究。經過20多年的努力，成功地將長穗偃麥草的染色體組、染色體、染色體片段導入普通小麥中，創制了八倍體小偃麥(小偃68、小偃693、小偃784、小偃7430、小偃763)、附加系(小偃759)、代換系(小偃藍粒)和易位系(小偃96)等小偃麥新種質，育成了小偃4號、小偃5號、小偃6號、小偃54和小偃81等高產、抗病的優質小麥品種[6-7]。通過遠緣雜交將外源染色體或染色體片段成功導入到普通小麥背景后，需要對其進行準確的鑒定，才能有效地加以利用。目前已運用C分帶、生化標記、分子標記、基因組原位雜交(Genome in situ hybridization,GISH)、多色基因組原位雜交(multicolor GISH)等方法來分析和鑒定小麥背景中的外源遺傳物質。C分帶方法對沒有特異性帶型或帶紋少、顏色淺、片段小的染色體不太理想，同時C分帶對環境條件非常敏感，使用不同的試劑、選擇不同的材料往往會得出不同的結果。生化標記數目比較少，有些同工酶基因在進化過程中已喪失活性，這給外源染色質的鑒定帶來了困難。PCR分子標記具有方便快速的優點，但在一些染色體區域的遺傳標記只對跟蹤特定的染色體或片段有效。基因組原位雜交技術利用基因滲入的不同物種基因組作為探針，對于鑒定小麥異源雙二倍體中的外源染色質是一種非常有用的技術[8]。例如，用生物素標記的簇毛麥染色體DNA作為探針，以普通小麥染色體組DNA進行封阻，利用GISH技術可以成功檢測導入小麥中的簇毛麥染色質， 而且清楚地顯示出易位染色體斷裂點的確切位置[9];同樣，GISH技術可以成功地檢測小麥遺傳背景中的長穗偃麥草染色體或易位的片段[1°]。使用多個不同基因組作為探針，多色基因組原位雜交為同時鑒定多倍體中兩個或多個基因組提供了另外一種可能。例如，GISH及多色-GISH技術被成功應用于鑒定小麥與中間偃麥草雜交獲得的五個雙二倍體系的細胞遺傳學組成;同樣，GISH和多色-GISH技術也被成功應用于鑒定小麥-長穗偃麥草附加、代換和易位系的分子細胞學特征[12]。但基因組原位雜交有一定的局限性，如單純用GISH無法確定外源染色體或染色體片段屬于哪個同源群、代換系所取代的特定染色體、易位系所發生的位置和斷點。此外，當外源染色體與小麥染色體親緣關系較近時，難以得到比較理想的雜交效果O相比而言，染色體涂染技術(chromosome painting)可以更好的鑒定雜交種中的外源染色體。染色體涂染技術即將整條染色體、某條染色體臂(長臂或短臂)或者染色體某個片段的DNA制備成探針，然后用熒光標記原位雜交的方法，將探針雜交到中期分裂相染色體上，利用熒光顯微鏡觀察熒光素在染色體上的信號分布，從而分析和研究染色體的重組和畸變[13]。在人類和動物中，染色體涂染技術較為成熟，此技術具有很高的特異性和分辨力，可用來檢測人類和動物的染色體畸變[14]、性別鑒定[15]、顯微克隆[16]等。以微分離的染色體或染色體片段 D0P-PCR(Degenerate-Oligonucleotide-Primed PCR)擴增產物為探針，許多學者對小麥(Triticum aestivum)[17]、蠶豆(Vicia faba)[18]、大麥(Horeum vulgare)[18]、云杉(Picea abies)[18]、矮牽牛(Petunia hybrida)[19]、黑麥(Secalecereale) [2°]等中期分裂相染色體也進行了染色體涂染實驗，但是結果表明不管有沒有封阻，在所有染色體上均出現相同的雜交信號。Schubert等認為這可能由于與哺乳動物染色體相比，植物染色體之間發生經常性的轉座、易位事件導致植物不同染色體基因組序列之間存在廣泛的一致性_。不過，利用一些含有特殊序列的植物特異染色體DOP-PCR擴增產物作為探針，進行染色體涂染實驗，卻獲得了成功。比如，利用微分離矮牽牛(Petuniahybrid)B染色體作為探針，對矮牽牛中期分裂相染色體進行涂染，結果表明B染色體上的雜交信號要比A組染色體雜交信號亮度強得多[21]。同樣，利用微分離的酸模(Rumexacetosa) Y染色體DOP-PCR擴增產物為探針進行熒光原位雜交(FISH)，Y染色體由于含有特殊的重復序列，其很容易與常染色體區分開來[22]。但是，染色體涂染技術對于植物的常染色體(即，A染色體)的檢測一直沒有獲得成功。與植物基因組原位雜交(GISH)相比而言，植物染色體涂染實驗具有GISH所不具備的優點(I)植物染色體涂染實驗可以區分植物遠緣雜交種中外源染色體細微的結構變化，如缺失、重復、易位、倒位等，例如，本研究中對TAI-27附加染色體進行顯微分離及DOP-PCR擴增，以其作為探針對TAI-27中期分裂相染色體進行涂染實驗，結果表明在TAI-27中除了附加一對中間偃麥草染色體外，染色體涂染實驗還能鑒定出有一對染色體發生了置換，并且其中最小的一對染色體是由于末端缺失而造成的(這一結果是植物基因組原位雜交所顯示不出來的)；(2)利用植物染色體涂染實驗，可以對特定的染色體進行顯微分離，進而了解特定染色體含有的遺傳信息，如前面提到的B染色體、Y染色體，本研究所涉及到的含有很多特性基因的黑麥IR染色體、TAI-27附加中間偃麥草染色體、7ES/CS附加長穗偃麥草染色體(7E的短臂)，對其進行成功的顯微分離及DOP-PCR擴增，為了解其含有的遺傳信息以及為克隆抗性相關基因奠定了基礎
發明內容
本發明提供了一種利用染色體涂染技術鑒定植物遠緣雜交種中外源染色體和染色體片段的方法。具體地，本發明的方法包括下述步驟I)顯微分離待測植物中待檢測的染色體的單染色體或染色體片段；2)利用步驟I)分離的單染色體或染色體片段構建單染色體或染色體片段熒光探針；3)利用步驟2)構建的單染色體或染色體片段熒光探針對雜交種中期分裂相染色體進行熒光原位雜交；和4)分析步驟3)得到的熒光原位雜交結果，確定待測植物中待檢測的染色體的熒光信號分布。在本發明的一個實施方案中，步驟I)通過制備植物遠緣雜交種根尖中期分裂相，利用單染色體顯微分離技術分離待檢測的染色體的單染色體或染色體片段或與待檢測的染色體至少部分同源的單染色體或染色體片段。與待測外源染色體同源的染色體的確定可根據GISH結果進行鑒定，具體的講，利用待測外源染色體來源的基因組DNA構建熒光探針對遠源雜交種進行熒光原位雜交，在顯微鏡下，觀察熒光信號在染色體上分布情況，從而確定與待檢測的外源染色體至少部分同源的染色體。“至少部分同源”一般指至少20%同源，本領域技術人員可以根據實際應用容易地確定所需要的同源性。在本發明的一個實施方案中，步驟2)通過對步驟I)分離的單染色體或染色體片段進行DOP-PCR擴增，借助切口平移方法對所述分離的單染色體或染色體片段DOP-PCR擴增產物進行熒光探針構建。其中步驟2)對微分離的單染色體進行兩輪DOP-PCR擴增。本發明的方法適用于多種植物品種，例如，小麥、黑麥、中間偃麥草、長穗偃麥草、水稻、玉米等單子葉植物，同時也適用于棉花、大豆等雙子葉植物，優選適用于單子葉植物，更優選適用于禾本科植物。在本發明的一個具體實施方案中，本發明提供一種利用植物染色體涂染技術鑒定小麥遠緣雜交種中外源染色體的方法，其特征在于I)顯微分離小麥遠緣物種中待檢測的染色體的單染色體或染色體片段，如黑麥的IR染色體、7ES/CS附加的長穗偃麥草染色體、TAI-27中附加的中間偃麥草染色體等；2)利用步驟I)分離的單染色體或染色體片段構建單染色體或染色體片段熒光探針；3)利用步驟2)構建的單染色體或染色體片段熒光探針對雜交種中期分裂相染色體進行熒光原位雜交；和4)分析步驟3)得到的熒光原位雜交結果，確定待測植物中所述待檢測的染色體的突光信號分布。在本發明的一個具體實施方案中，所述待檢測的染色體和染色體片段選自黑麥IR 染色體、中間偃麥草-小麥附加系TAI-27附加染色體、長穗偃麥草-小麥附加系7ES/CS附加染色體。本發明的方法適用于檢測植物中的常染色體、特殊的B染色體和性染色體，特別地，本發明的方法首次成功地以高靈敏度檢測植物中的常染色體，克服了現有技術中植物常染色體檢測效果不理想的問題，是一種技術突破。具體地講，本發明的方法有以下幾點技術突破1)染色體制片技術的改進，本發明的方法采用了比較先進的染色體制片技術，對根尖預處理采用笑氣(N2O)而非傳統的化學試劑秋水仙素、八羥基喹啉、對二氯苯等化學試齊U，主要優點體現在無毒害、分散效果好；2)熒光探針構建及熒光原位雜交技術與同類方法相比較也體現了快捷、高效、信號強等特點；3)單染色體涂染技術的突破，與動物染色體涂染技術相比，植物染色體染色體涂染特別是植物常染色體涂染技術發展處于非常落后的階段，主要表現為信號不清晰、特異性差，很難達到實際應用的要求，而采用本發明的方法，熒光原位結果顯示熒光雜交信號非常清晰、特異性非常強，可以很好的應用到遠緣雜交種中外源染色體的鑒定，這對植物染色體涂染技術的發展具有很好的推動作用。雖然上述技術中的一種或幾種在相關的研究中得到了應用，但是綜合應用這樣幾種技術構成完整的實驗方案，并應用到植物遠緣雜交種中外源染色體或染色體片段的鑒定中未見到相關研究報道。本發明首次利用該套研究方案成功地以高靈敏度檢測遠緣雜交植物中的外源常染色體，克服了現有技術中植物常染色體檢測效果不理想的問題，是一種技術突破，體現了該研究方法具有較好的先進性、創新性和實用性。


從下面結合附圖的詳細描述中，本發明的上述特征和優點將更明顯，其中圖I.黑麥IR染色體的顯微分離及利用IR染色體探針在小麥-黑麥附加系1R/CS和小麥-黑麥易位系1RS/1BL鑒定黑麥來源的染色體和染色體片段A.黑麥IR染色體的顯微分離過程(左黑麥細胞中期分裂相，箭頭示IR染色體；右IR染色體被分離后的黑麥細胞中期分裂相)；B.黑麥IR染色體第二輪DOP-PCR擴增電泳圖(M =Marker ；CK 陰性對照；I :分離的IR單染色體擴增產物);C.利用IR單染色體熒光探針對1R/CS (左圖)、1RS/1BL(右圖)中期分裂相染色體進行熒光原位雜交結果(箭頭示熒光信號所在染色體，結果表明只有IR單染色體和IRS染色體片段上有熒光信號)。圖2. TAI-27附加中間偃麥草染色體的顯微分離及其對TAI-27附加中間偃麥草染色體的染色體涂染鑒定A.TAI-27附加中間偃麥草染色體的顯微分離過程(左細胞中期分裂相，箭頭示附加中間偃麥草染色體；右附加的小染色體被分離后的細胞中期分裂相)；B. TAI-27附加中間偃麥草染色體第二輪D0P-PCR擴增電泳圖(M =Marker ；CK :對照；1、2、3、4代表分離的附加單染色體)；C.左圖顯示以中間偃麥草基因組為探針進行的基因組原位雜交(GISH)結果，右圖顯示利用TAI-27附加中間偃麥草單染色體熒光探針對TAI-27中期分裂相染色體進行熒光原位雜交結果(箭頭示熒光信號所在染色體，與基因組原位雜交相比，染色體涂染結果 表明在TAI-27中，一對外源染色體替換了小麥的一對染色體，并且小麥附加了一對外源小染色體，這對小染色體的產生是由于附加的一對染色體端部發生斷裂而產生的)；D.利用TAI-27附加中間偃麥草染色體熒光探針對中間偃麥草中期分裂相染色體進行熒光原位雜交結果(結果顯示多數染色體近著絲粒區域均出現相似的熒光信號)。圖3. 7ES/CS附加長穗偃麥草染色體的顯微分離及其對7ES/CS附加長穗偃麥草染色體的染色體涂染鑒定A. 7ES/CS附加長穗偃麥草染色體的顯微分離過程(左細胞中期分裂相，箭頭示附加長穗偃麥草染色體；右附加的小染色體被分離后的細胞中期分裂相)；B. 7ES/CS附加長穗偃麥草染色體第二輪D0P-PCR擴增電泳圖(M =Marker ;1、2、3、4代表分離的附加單染色體)；C.利用7ES/CS附加長穗偃麥草染色體熒光探針對7ES/CS中期分裂相染色體進行熒光原位雜交結果(箭頭示熒光信號所在染色體，結果表明只有小麥附加的一對染色體上有突光信號)
具體實施例方式下面參考實施例和附圖詳細描述本發明。本領域的普通技術人員可以理解的是，下述實施例是舉例說明的目的，其不應以任何方式解釋為對本發明的限制。本發明的保護范圍由后附的權利要求所限定。另外，本領域技術人員還應該理解，除非另外具體說明，下述實施例中所用的試劑均為市售分析純級別的試劑。實施例I.黑麥IR染色體的顯微分離及對小麥-黑麥附加系1R/CS和小麥-黑麥易位系1RS/1BL黑麥來源的附加染色體和染色體片段的涂染鑒定I.黑麥有絲分裂中期分裂相的制備所用黑麥(Secale cereal) king II，購自美國農業部牧草與畜牧研究室(USDA，ARS，FRRL，UT,USA)。DN2O處理根尖用鑷子在I. 5ml離心管的蓋子上扎一個孔，打開蓋子，用噴霧瓶向離心管中噴水至管壁有一層水珠，切取l_2cm的根尖放入管中，蓋上蓋子后放入N2O氣室中處理 l_3h，壓強為 lOATMd. OlMpa)；2)根尖固定用90%乙酸冰上固定根尖10分鐘(不超過Ih)(可向原來的帶孔的1.5ml管中直接加90%乙酸，或轉移根尖至新管中固定)；固定后的根尖轉入70%的乙醇中放入-20°C可保存多年；3)水洗用水洗根尖10分鐘(換2-3次H2O)，放于冰上；4)轉移根尖至干濾紙上，輕輕轉動根尖去除根尖表面的粘稠物；酶解切下2mm長的生長點部分轉入20 μ L冰冷的酶液中(2-3個根尖/管)(酶解液配制把一個塑料培養皿放到天平上，向里面加入IX檸檬酸緩沖液(IOmM檸檬酸鈉+IOmM EDTA，pH 5. 5) 4. 85g，取出置于冰上，稱取50mg果膠酶Y-23 (購自北京華綠源科技有限公司，l%w/w)和IOOmg纖維素酶Onozuka R-10 (購自北京華綠源科技有限公司，2% w/w)加入緩沖液中，用槍頭吹吸助溶，酶溶解后用分液器分裝到O. 5ml薄壁PCR管中，放入干冰中迅速冷凍一下，_20°C保存)，放入37°C的水浴中30-50分鐘；5)取出離心管放冰上，加入500 μ L 70%乙醇，混勻，倒掉乙醇后，加入500μ L新的70%乙醇，再倒出乙醇，留40 μ L乙醇，用解剖針搗碎根尖，渦旋幾秒鐘或用手指彈擊管壁幾次懸浮細胞，在小離心機上離心10-20秒，轉速不超過2000rcf，小心倒置PCR管于濾紙或吸水紙至乙醇完全流盡；6)放離心管于冰上，加30 μ L無水乙酸，渦旋或用槍頭輕輕吹吸混勻，吸5-8 μ L滴片，載玻片已擺放在保濕盒中，滴片后蓋住保濕盒，放置5分鐘后即可利用光學顯微鏡物鏡20 X下觀察染色體。2.黑麥IR染色體的顯微分離首先將直徑為I. Omm的微細玻璃棒，在酒精燈下，利用Leitz拉針儀手工拉制成直徑為Iym左右的微細玻璃針。在倒置顯微鏡下(OlympuslM)用手工拉制的玻璃針借助Leitz顯微操作儀(code-No. 93314,購自德國萊卡公司)對識別的染色體進行前后左右的劃動，輕輕刮取。將粘附有IR染色體(帶有隨體的小染色體，可在不染色的情況下識別確認，圖1A，左箭頭所示；圖1A，右為IR染色體被分離后的圖像)的針尖折斷于預先裝有
10μ L 蛋白酶 K (Proteinase K, recombinant PCR Grade 03115887001Roche, 50ng/μ L,由IXTaq DNA聚合酶緩沖液配制)反應緩沖液的O. 2mlEppend0f管中，室溫高速(離心速率4000rpm)離心30s，_20°C放置待用。3.黑麥 IR 染色體 D0P-PCR(Degenerate-Oligonucleotide-Primed PCR)擴增首先將含有按實施例I. 2得到的微分離染色體的PCR管放于37°C進行酶解去蛋白反應，2h后90°C處理IOmin失活蛋白酶K，用作第一輪DOP-PCR反應的模板。將DOP-PCR 引物(5，-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3’ ) (N 表示 A，G，T 或 C)、水、緩沖液(D0P-PCR擴增試劑盒所帶，DOP-PCR擴增試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司)在紫外燈下照射30min，操作均在超凈操作臺上操作。第一輪DOP-PCR擴增反應體系
權利要求
1.一種利用染色體涂染技術鑒定植物遠緣雜交種外源染色體和染色體片段的方法，其包括下述步驟 1)顯微分離待測植物中的待檢測的染色體的單染色體或染色體片段； 2)利用步驟I)分離的單染色體或染色體片段構建單染色體或染色體片段熒光探針； 3)利用步驟2)構建的單染色體或染色體片段熒光探針對雜交種中期分裂相染色體進行熒光原位雜交；和 4)分析步驟3)得到的熒光原位雜交結果，確定待測植物中所述待檢測的染色體的熒光信號分布。
2.權利要求I所述的方法，其中步驟I)通過制備植物遠緣雜交種根尖中期分裂相，利用單染色體顯微分離技術分離待檢測的染色體的單染色體或染色體片段。
3.權利要求I所述的方法，其中步驟2)通過對步驟I)分離的單染色體或染色體片段進行DOP-PCR擴增，借助切口平移方法對所述分離的單染色體或染色體片段DOP-PCR擴增產物進行熒光探針構建。
4.權利要求3所述的方法，其中步驟2)對微分離的單染色體進行兩輪DOP-PCR擴增。
5.權利要求I所述的方法，其中所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
6.權利要求5所述的方法，其中所述單子葉植物為禾本科植物。
7.權利要求5所述的方法,其中所述植物選自小麥、黑麥、中間偃麥草-小麥附加系TAI-27、長穗偃麥草-小麥附加系7ES/CS。
8.權利要求7所述的方法，其中所述待檢測的染色體和染色體片段選自黑麥IR染色體、中間偃麥草-小麥附加系TAI-27附加染色體、長穗偃麥草-小麥附加系7ES/CS附加染色體。
全文摘要
本發明提供了一種利用染色體涂染技術鑒定植物遠緣雜交種中外源染色體和染色體片段的方法，所述方法包括下述步驟1)顯微分離待測植物中的待檢測的染色體的單染色體或染色體片段；2)利用步驟1)分離的單染色體或染色體片段構建單染色體或染色體片段熒光探針；3)利用步驟2)構建的單染色體或染色體片段熒光探針對雜交種中期分裂相染色體進行熒光原位雜交；和4)分析步驟3)得到的熒光原位雜交結果，確定待測植物中所述待檢測的染色體的熒光信號分布。利用本發明提供的方法不但可以用來對小麥遠緣雜交種中外源染色體和染色體片段進行鑒定，也可以應用到對其他農作物遠緣雜交種中外源染色體和染色體片段的鑒定工作中。
文檔編號C12Q1/68GK102876801SQ20121040285
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月22日 優先權日2012年10月22日
發明者胡贊民, 鄧傳良, 符書蘭, 韓方普, 尹維波, 陳宇紅 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所