專利名稱：芝麻栽培種與Sesamum radiatum野生種遠緣雜交后代的分子鑒定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種植物雜交后代的分子鑒定方法，特別是涉及一種芝麻栽培種(2n=26)與野生種(Sesame radiatum, 2n=64)遠緣雜交后代的分子鑒定方法,屬于生物技術領域。
背景技術：
芝麻(Sesame indicumL. , 2n=26)屬胡麻科胡麻屬，是世界上最古老的特色油料作物之一。芝麻在我國已有三千多年的栽培歷史，因品質(zhì)優(yōu)良，在國際生產(chǎn)和貿(mào)易中占有重要地位。然而，由于芝麻抗病耐潰性較差，易受環(huán)境條件的影響，產(chǎn)量的穩(wěn)產(chǎn)性不佳。近二十 年來，開展高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)抗病抗逆新品種選育一直是我國芝麻遺傳育種的一項重點任務。芝麻野生種(Sesame radiatum, 2n=64)具有較好的抗病抗逆特性,將野生種的抗病抗逆特性轉入栽培種，是提高芝麻品種抗性特征的重要技術途徑。但是由于芝麻遠緣雜交不具有親和性，后代幾乎不能自交結實，目前只能采用幼胚拯救培養(yǎng)、組培苗移栽方式獲得遠緣雜交后代。在遠緣雜交后代鑒定方面，受研究技術限制，目前僅采用外觀形態(tài)、生物學等鑒定方法判斷芝麻遠緣雜交Fl代的真?zhèn)巍Ｑ芯堪l(fā)現(xiàn)，與實生苗不同的是，芝麻遠緣雜交后代組培苗之間在外觀形態(tài)方面差異不明顯，但與親本的差異都很顯著。因此選用外觀形態(tài)、生物學等方法對遠緣雜交后代進行鑒定，結果可靠性較差，且鑒定周期較長。因此，目前急需建立一種快速穩(wěn)定高效的芝麻遠緣雜交后代的鑒定方法，為完善芝麻遠緣雜交育種技術、加快芝麻遠緣雜交育種步伐提供技術支撐。DNA是生物的遺傳物質(zhì)，DNA的多態(tài)性是生物多樣性的本質(zhì)內(nèi)容。目前，隨著分子標記技術的不斷發(fā)展和廣泛應用，國內(nèi)外在植物雜交育種的后代鑒定中越來越多的應用各種分子標記技術，如RAPD、ISSR、AFLP、SSR等分子標記。與常規(guī)育種相比，分子標記可以直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個組織、各個發(fā)育階段均可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，也不存在表達與否等問題。其中，SSR標記由于其多態(tài)性高、共顯性和穩(wěn)定性好、染色體位置清楚而得到了廣泛應用，緊密連鎖的SSR標記可用于標記輔助選擇和聯(lián)合育種，在應用分子標記進行雜交后代真實性的鑒定過程中特異性的引物是關鍵所在。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種芝麻栽培種與Sesame radiatum野生種遠緣雜交后代的分子鑒定方法。為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術方案是檢測芝麻遠緣雜交后代的SSR引物，包括引物對HS209正向引物序列5’ -GCAAGAAGCCGACATGITTA-3 ’ (Tm=53. 35 °C )反向引物序列5’-ACTCCAATTCCTCCACCAAG-3’(Tm=55.4°C)。
上述引物用于芝麻栽培種與Sesame radiatum野生種遠緣雜交后代的分子鑒定方法，具體步驟如下(I)挑選飽滿健康的芝麻栽培種與Sesame radiatum野生種種子,6月播種后于7月下旬植株進入花期，進行人工授粉雜交，采用組織培養(yǎng)方法對雜交后代幼胚進行培養(yǎng)，獲得遠緣雜交Fl后代；(2)提取步驟(I)中芝麻栽培種(Sesame indicum L.，2n=26)、野生種(Sesameradiatum, 2n=64)及雜交后代F1基因組DNA，作為模板備用；(3)將步驟(2)提取的DNA模板應用于PCR反應體系，運行PCR擴增程序，在引物對HS209的引導下，得到PCR反應產(chǎn)物；(4)將步驟(3)的PCR反應產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，檢測結果有栽培種特異性條帶210bp和野生種特異性條帶200bp、230bp的為真雜種；其余則為假雜種。所述的芝麻親本及雜交后代基因組DNA的提取方法采取CTAB提取法，取植株葉片，加入預冷的提取緩沖液，研磨，4°C離心，棄上清，于沉淀中加入預熱的裂解緩沖液，65°C水浴，加入氯仿/異戊醇混合液，混勻，15°C離心，取上清，加預冷的異丙醇，混勻，靜置，離心，棄上清，于沉淀中加入乙醇洗滌，離心，倒掉上清后干燥，加TE緩沖液，4°C溶解DNA30min以上，于20°C保存?zhèn)溆谩Ｋ龅奶崛【彌_液包括0.35M Glucose, 0. IM Tris-HCl, 5mM Na-EDTA, 2%PVP,1%(V/V) ^ _Me，余量為無菌超純水，4°C保存。所述的裂解緩沖液包括I.4M NaCl，0. IM Tris-HCl，20mM Na-EDTA, 2%CTAB,2%PVP，1%(V/V) ^ _Me，余量為無菌超純水，室溫保存。所述的TE 緩沖液包括10mM Tris-HCl (PH 8. 0)，ImM EDTA (PH 8. 0)，余量為無菌 超純水。所述的PCR 反應體系為DNA 模版 50ng，IOXBuffer I u L, IOmmol L-IdNTPs0. 2 u L, 10 u g L-1 引物對 HS2091 u L, 2. 5U u L-ITaq DNA polymerase 0.5iiL,加入無菌超純水至終體積10 u L0所述的PCR擴增程序為94°C變性3min，94°C變性I min，58°C退火45s，72°C延伸60s，30個循環(huán)，72°C總延伸IOmin ;4°C保存。所述的凝膠電泳檢測為采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濃度10%，電泳緩沖液為I X TBE，150V恒壓電泳2小時，電泳結束后，凝固定先膠，再銀染，漂洗，顯色，漂洗凝膠后記錄讀取數(shù)據(jù)。本發(fā)明的有益效果(I) HS209SSR標記為自主開發(fā)的種間特異性標記(GenBank，JP643611)，結果穩(wěn)定可靠。(2)試驗開展不受芝麻生產(chǎn)季節(jié)限制，可以以芝麻幼苗葉片為材料，用材少、周期短，材料的預處理及試驗操作步驟簡便易行。(3)采用SSR標記技術對野生種與栽培種芝麻的遠緣雜交后代進行鑒定，填補了芝麻遠緣雜交后代分子生物學鑒定技術的空白。與流式細胞儀細胞學檢測方法相比，該方法不需要基因組參照材料，數(shù)據(jù)更加穩(wěn)定可靠；此外，本發(fā)明技術要點均屬常規(guī)生物學技術方法，成本低，在短時間內(nèi)可完成大批試驗材料的鑒定。可廣泛用于今后的芝麻種質(zhì)創(chuàng)新、遠緣雜交育種等研究。


圖I遠緣雜交后代組培苗F1田間長勢；圖2親本與芝麻遠緣雜交后代的SSR標記鑒定電泳圖；注1=Marker DL2000 ；2 :豫芝 11 ；3 :野芝 I 號；4 :真雜種 FlNo. IH 07 ；5 :真雜種FlNo. IH25 ；6 :假雜種 FlNo. IH 01 ；7 :假雜種 FlNo. IH 13。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作詳細說明，但不構成對本發(fā)明的任何限制。 實施例本實施例用于芝麻豫芝11號(Sesame indicum L. , 2n=26)和野芝I號(Sesameradiatum, 2n=64)雜交F1代的鑒定,具體操作步驟如下(I)遠緣雜交親本及后代培養(yǎng)挑選飽滿健康的芝麻豫芝11號(Sesame indicumL. , 2n=26)和野芝I號(Sesame radiatum, 2n=64)種子,6月播種后于7月下旬植株進入花期，進行人工授粉雜交。采用組織培養(yǎng)方法對雜交后代幼胚進行培養(yǎng)，獲得遠緣雜交后代F1共4株(圖I)；(2)提取芝麻豫芝11號、野芝I號及雜交后代F1基因組DNA，作為模板備用；基因組DNA的提取采取CTAB小量提取法a.取親本、遠緣雜種Fl后代各2-3片嫩葉，加入600 ill預冷的新鮮配制的提取緩沖液，電轉研磨，再于5000rpm 4°C離心20min,棄上清；b.于沉淀中加入600 U I 65°C預熱的裂解緩沖液，65°C水浴30min，期間翻轉混勻2-3 次；c.加入SOOiU氯仿/異戊醇(氯仿異戊醇為24:1)混合液，翻轉50次以上，9000rpml5°C離心20min，將上清轉入I. 5ml的離心管中，加0. 6體積的預冷的異丙醇，緩慢翻轉30次,混勻，靜置IOmin, 9000rpm離心IOmin (RT),棄上清，于沉淀中加入Iml 70%的乙醇洗漆，IOOOrpm離心2min,倒掉上清液,通風干燥20min ；d.加30 ill TE緩沖液，4°C溶解DNA30min以上，_20°C保存?zhèn)溆谩Ｌ崛【彌_液包括0.35M Glucose, 0. IM Tris-HCl, 5mM Na-EDTA, 2%PVP, 1%(V/V)3 -Me，余量為無菌超純水，4°C保存。裂解緩沖液包括I. 4M NaCl，0. IM Tris-HCl，20mM Na-EDTA, 2%CTAB, 2%PVP,1%(V/V) ^ _Me，余量為無菌超純水，室溫保存。TE緩沖液包括10mM Tris-HCl (PH 8. 0)，ImM EDTA(PH 8. 0)，余量為無菌超純水。(3)將步驟(2)提取的DNA模板應用于PCR反應體系，運行PCR擴增程序，在引物對HS209的引導下，得到PCR反應產(chǎn)物；PCR 反應體系為DNA 模版 50ng，IOXBuffer I y L，IOmmol PdNTPs 0. 2 u L,10 u g L 1 引物對 HS2091 u L, 2. 5U u L 1Taq DNA polymerase 0. 5 u L,加入無菌超純水至終體積IOuD0PCR 擴增程序為94°C變性 3min，94°C變性 I min，58°C退火 45s，72°C延伸 60s，30個循環(huán)，72°C總延伸IOmin ;4°C保存。(4)將步驟(3)的PCR反應產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測。凝膠電泳檢測為采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濃度10%，凝膠大小180mmX120mmX2mm,電泳緩沖液為I X TBE，150V恒壓電泳2小時。電泳結束后，將凝膠先固定(10%乙醇、0. 5%冰乙酸)6分鐘；之后0. 2%的硝酸銀水溶液滲透銀染12分鐘；蒸餾水漂洗2分鐘兩次后，于I. 5%氫氧化鈉和0. 4%甲醛混合溶液中適度顯色；最后清水漂洗凝膠并記錄讀取數(shù)據(jù)。鑒定結果利用HS209引物在父本豫芝11親本擴增出了 I條特異帶(210bp)，在母本野芝I號親本上擴增出2條特異帶(分別為200bp和230bpp)。根據(jù)基因重組原理，真正的遠緣雜交后代Fl應同時具有兩親本特異條帶。分析上述PCR結果可知，No. IH 07、25同時具有豫芝11號與野芝I號的特異性條帶。因此，判定No. IH 07、25為豫芝11號與野芝I號真正的遠緣雜交后代。No. IH 01、13與母本相同，為假的后代(圖2)。為驗證上述技術鑒定結果的可靠性，同時對遠緣雜交后代Fl進行生物學方法和流式細胞DNA含量測定的鑒定。I.生物學方法遠緣雜交后代F1組培移栽植株間的生物學性狀較為相似，苗期不易區(qū)分，但F1幾乎全為不育，與親本間的生物學性狀差異明顯。因此，通過判定植株匕的育性特征進行鑒定，可育為假雜種，不可育為真雜種。2.流式細胞DNA含量測定在流式細胞DNA含量檢測中，選用大豆(WiIIiams 82，基因組大小950Mb)作為DNA含量標準對照。豫芝11和野芝I號的基因組大小分別為383. 60Mb,636. 50Mb,差異顯著，因此可依據(jù)材料的基因組大小初步判定是否為真的遠緣雜交后代。使用BDFACSCaiburTm流式細胞儀進行測試材料的細胞DNA含量檢測。利用DNA-ACQ軟件獲取數(shù)據(jù)散點圖和直方圖，使用ModFit LT軟件分析確定樣品GcZG1峰變異系數(shù)(CV%)，然后依據(jù)Seker等(2003)方法計算樣品核DNA的2C值(pg)，結果如表I。表I芝麻遠緣雜交后代的育性特征和細胞DNA含量檢測
權利要求
1.檢測芝麻栽培種與Sesameradiatum野生種遠緣雜交后代的的SSR引物,包括 引物對HS209 正向引物序列5’ -GCAAGAAGCCGACATGITTA-3’(Tm=53.35°C) 反向引物序列5’ -ACTCCAATTCCTCCACCAAG-3，(Tm=55. 4°C )。
2.—種如權利要求I所述的引物用于芝麻栽培種與Sesame radiatum野生種遠緣雜交后代的分子鑒定方法，其特征在于，具體步驟如下 (1)挑選飽滿健康的芝麻栽培種(Sesameindicum L.，2n=26)與野生種(Sesameradiatum, 2n=64)種子，6月播種后于7月下旬植株進入花期，進行人工授粉雜交，采用組織培養(yǎng)方法對雜交后代幼胚進行培養(yǎng)，獲得遠緣雜交F1后代； (2)提取步驟(I)中芝麻栽培種(Sesameindicum L.，2n=26)、野生種(Sesameradiatum, 2n=64)及雜交后代F1基因組DNA，作為模板備用； (3)將步驟(2)提取的DNA模板應用于PCR反應體系，運行PCR擴增程序，在引物對HS209的引導下，得到PCR反應產(chǎn)物； (4)將步驟(3)的PCR反應產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，檢測結果有栽培種特異性條帶210bp和野生種特異性條帶200bp、230bp的為真雜種；其余則為假雜種。
3.根據(jù)權利要求2所述的分子鑒定方法，其特征在于，所述的基因組DNA的提取方法取植株葉片，加入預冷的提取緩沖液，研磨，4°C離心，棄上清，于沉淀中加入預熱的裂解緩沖液，65°C水浴，加入氯仿/異戊醇混合液，混勻，15°C離心，取上清，加預冷的異丙醇，混勻，靜置，離心，棄上清，于沉淀中加入乙醇洗滌，離心，倒掉上清后干燥，加TE緩沖液，4°C溶解DNA30min以上，于20°C保存?zhèn)溆谩?br> 4.根據(jù)權利要求3所述的分子鑒定方法，其特征在于，所述的提取緩沖液包括0.35MGlucose,0. IM Tris-HCl, 5mM Na-EDTA, 2%PVP, 1%(V/V) P-Me，余量為無菌超純水。
5.根據(jù)權利要求3所述的分子鑒定方法，其特征在于，所述的裂解緩沖液包括1.4MNaCl,0. IM Tris-HCl, 20mM Na-EDTA, 2%CTAB, 2%PVP, 1%(V/V) ^ -Me,余量為無菌超純水。
6.根據(jù)權利要求3所述的分子鑒定方法，其特征在于，所述的TE緩沖液包括IOmMTris-HCl (PH 8. 0), ImM EDTA(PH 8. 0)，余量為無菌超純水。
7.根據(jù)權利要求2所述的分子鑒定方法，其特征在于，所述的PCR反應體系為DNA模版 50ng，IOXBuffer I u L, IOmmol L^dNTPs 0. 2 y L，10 y g L-1 引物對 HS2091 u L,2.5U u L 1Taq DNApolymerase 0. 5 U L,加入無菌超純水至終體積 10 U L。
8.根據(jù)權利要求2所述的分子鑒定方法，其特征在于，所述的PCR擴增程序為94°C變性 3min，94°C變性 I min，58°C退火 45s，72°C延伸 60s，30 個循環(huán)，72°C總延伸 IOmin ;4°C保存。
9.根據(jù)權利要求2所述的分子鑒定方法，其特征在于，凝膠電泳檢測為聚丙烯酰胺凝膠濃度為10%，電泳緩沖液為1XTBE，150V恒壓電泳2小時，電泳結束后，凝固定先膠，再銀染，漂洗，顯色，漂洗凝膠后記錄讀取數(shù)據(jù)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種芝麻栽培種與Sesame radiatum野生種遠緣雜交后代的分子鑒定方法，屬生物技術領域。通過提取栽培種(Sesame indicum L.,2n=26)、野生種(Sesame radiatum,2n=64)及雜交后代F1的基因組DNA，進行PCR擴增和凝膠電泳檢測，根據(jù)是否能夠同時擴增出親本的特異性條帶判定遠緣雜交F1代的真假。本發(fā)明建立的芝麻遠緣雜交后代的分子鑒定方法，解決了芝麻遠緣雜交育種研究過程中的遠緣雜種鑒定周期長、準確率低等難題，填補了我國芝麻遠緣雜交育種技術的空白。利用該方法可以高效快速地鑒定芝麻遠緣雜交后代F1，為芝麻抗病新品種育種奠定了材料和技術基礎。
文檔編號C12N15/11GK102965431SQ20121031849
公開日2013年3月13日 申請日期2012年8月31日 優(yōu)先權日2012年8月31日
發(fā)明者張海洋, 苗紅梅, 張體德, 魏利斌, 李春, 琚銘, 王慧麗 申請人:河南省農(nóng)業(yè)科學院