專利名稱：一種快速鑒定啤酒酵母單倍體的方法
技術領域：
本發明涉及一種鑒定啤酒酵母單倍體的方法，特別是一種基于菌落PCR和流式細胞技術的方法，屬于微生物鑒定領域。
背景技術：
酵母是啤酒釀造的靈魂，對啤酒質量起至關重要的作用。工業啤酒酵母包括上面酵母(ale brewing yeast, Saccharomyces cerevisiae)和下面酵母(lager brewingyeast, Saccharomyces pastorianus)兩大類，市售啤酒90%以上是由下面酵母發酵而成，所以對工業啤酒酵母的研究也大多是針對下面酵母的。下面酵母又稱卡爾酵母，為異源雜合的多倍體或非整倍體，他們復雜的倍性給酵母改良和遺傳研究帶來了諸多困難。酵母單倍體菌株只有一套染色體，基因情況簡單明了，常被用作遺傳學和育種工作的模式菌株，既為性狀遺傳分析所必需，又可為雜交作好親本的準備。而且，單倍體菌株具有細胞小、蛋白酶A產量低、自溶性能好等優勢，在理論研究和實際應用中都具有深遠意義。但因為工業啤酒酵母長期生活在營養充足的環境里，產孢能力退化，單倍體分離率和成活率低，而且缺乏行之有效的鑒定方法，因此此方面的研究并不多。

發明內容
本發明要解決的技術問題是建立一種能精確、高效鑒定啤酒酵母倍性的方法。為解決上述技術問題，本發明的技術方案為首先采用菌落PCR進行初步判定，然后通過流式細胞儀檢測DNA含量確定倍性；菌落PCR的特異性引物為MAT 特異性引物(5' -AGTCACATCAAGATC GITTATGG-3')；MATa 特異性引物(5' -ACTCCACTTCAAGTAAGAGTTTG-3')；MATa 特異性引物(5' -GCACGGAATATGGGACTACTTCG-3')。本發明的具體檢測步驟如下(I)待檢測的菌種稀釋涂布YEH)平板，28°C培養2-3天后，用牙簽小心挑取適量菌體到I. 5mL離心管，為避免瓊脂干擾PCR結果，可先將細胞洗滌2-3次，收集菌體后進行菌落 PCR。(2) PCR反應中所用三種引物分另Ij為MAT特異性引物(5 ' -AGTCACATCAAGATCGTTTATGG-3 ' ) ；MATa 特異性弓I物(5 ' -ACTCCACTTCAAGTAAGAGTTTG-3 ' ) ；MAT a 特異性弓| 物(5' -GCACGGAATATGGGACTACTTCG-3' )。PCR 反應體系中(100 y L)加入適量細胞、三種引物各 2iiL、dNTP 8 u LUOXbuffer 10 y L、rTaq 酶 0. 5 y L、ddH20 75. 5 y L，適當混勻后置于 TECHNE TC-5000PCR 儀進行 PCR 反應，條件為 95°C變性 5min ;94°C變性 l_2min，50°C退火 30-60s，72°C延伸 l-2min, 25-40 個循環；72°C總延伸 5min。。(3)PCR產物進行I. 2% -2%的瓊脂糖電泳。單倍體菌株的電泳結果只有一條條、帶，其中MATa型的為544bp，MATa型的為404bp，雜合二倍體和多倍體菌株同時有兩條條帶，純合二倍體和多倍體菌株只有相應的一條條帶。(4)選取電泳結果只有一條條帶的菌種(單倍體或純和多倍體、雜倍體)進行流式細胞分析。(5)將選出的菌株與單倍體標準菌分別接種于YEH)液體培養基，28°C振蕩培養12-24h。取 0. 5-lmL 菌液到 I. 5mL 離心管中，8，000 X g-12, 000 X g 離心 5-lOmin 收集菌體，菌體重懸于PBS緩沖液后離心、洗滌2-3次，然后用PBS溶解。(6)將菌液沸水浴2-8min殺死細胞。加入10-12 u L 10mg/mL的RNaseA，50°C水浴 30_50min,然后加入 20-24 u L 20mg/mL proteinase K, 50°C水浴 30_50min。離心后收集菌體，重懸于PBS后適當稀釋，超聲10-20s，間隔2-3s，重復2-3次。(7)上機前每mL樣品加入5-10 ii L lmg/mL的碘化丙錠(PI),避光反應5-lOmin。
(8)樣品倍性用Becton Dickinson FACSCalibur流式細胞儀進行分析。超純水作為流動鞘液，用氬離子激發熒光，激發波長為488nm，使用660/16nm帶濾光片作PI熒光分析，每個樣品至少檢測I X IO4個細胞，得到FCM圖譜。(9)酵母菌株的倍性用DNA含量表示，通過與單倍體標準菌的對比得出若待測菌與標準菌具有相同或相似的DNA含量,則為單倍體菌株；若DNA含量為標準菌的倍數,則為相應倍性的純和多倍體或雜倍體。穩定性和可重復性分析MAT PCR、瓊脂糖電泳和流式細胞技術都是穩定性和可重復性良好的實驗方法。經檢驗，當流式細胞儀熒光強度的線性相關系數(I)在0. 98以上，前向角散射光檢測靈敏度< I U m，前向角散射光和熒光信號的熒光通道全峰寬或半峰寬CV值< 5%時，可以保證實驗結果的準確性和可重復性。本發明提供了一種客觀有效的鑒定啤酒酵母單倍體的方法，其特征是基于MATPCR和流式細胞技術聯用的實驗策略，高效、精確、可重復性好。相較于傳統的單倍體鑒定方法(長時間培養、染色鏡檢)而言，該發明能在極短的時間內得出實驗結果，大大減少工作量和工作時間，實驗結果也更加真實可信。而且，該發明能夠同時鑒定出單倍體菌株的交配型(MATa/MAT a )，并能將釀酒酵母單倍體標準菌對實驗結果的影響降到最小。該發明中，MT PCR不僅是菌株交配型的判定方法，更是倍性鑒定的初判手段，能快捷、方便的排除部分菌株的干擾。


圖I為單倍體標準菌(W303-1A MATa, W303-1B MAT a )、四株單倍體疑似菌(H2、H5、H12、H18)和一株啤酒酵母工業菌株G-03(倍性不明)MAT PCR產物的瓊脂糖電泳圖。M marker ；1 W303-1A ；2 W303-1B ；3 H2 ；4 H5 ；5 H12 ；6 H18 ；7 :G_03。圖2為單倍體標準菌W303-1B的FCM圖譜。圖3為四株單倍體疑似菌的FCM圖譜。
具體實施例方式實例I以實驗室保存的四株單倍體疑似菌(H2、H5、H18)、一株啤酒酵母工業菌株G_03(倍性不明)、單倍體標準菌W303-1A、W303-1B (購于中國高校工業微生物資源和信息中心，CICIM-CU)作為實驗菌株驗證本發明方法的可行性與準確性。(I)將五株菌和單倍體標準菌稀釋涂布YEH)平板，28°C培養2天后，用牙簽挑取約1/2菌落的菌體到I. 5mL離心管，用ddH20洗滌3次，收集菌體后進行菌落PCR。(2)每個反應體系中(IOOiiL)加入三種引物各L、dNTP 8 U LUOXbuffer10 u L、rTaq 酶 0. 5 y UddH2O 75. 5 u L，適當混勻后置于 TECHNE TC-5000PCR 儀進行 PCR 反應,條件為:95°C變性5min ;94°C變性lmin，50°C退火30s，72。。延伸lmin,30個循環；72°C總延伸5min。(3)PCR產物進行2%的瓊脂糖電泳。如圖I所示，四株單倍體疑似菌的電泳結果都只有一條條帶，其中H2和H5的MAT PCR產物為404bp，H12和H18的為544bp。工業菌株MAT PCR產物有兩條條帶，不是單倍體菌株。為排除純和多倍體或雜倍體的情況，將H2、 H5、H12和H18進行流式細胞分析。(4)將四株菌和標準菌W303-1B分別接種于YETO液體培養基，28°C振蕩培養24h。取ImL菌液到I. 5mL離心管中，10，OOOXg離心IOmin收集菌體，菌體重懸于PBS緩沖液后離心、洗滌3次，然后用PBS溶解。(5)將菌液沸水浴5min殺死細胞。加入IOyL 10mg/mL的RNaseA，50 V水浴45min,然后加入20 ii L 20mg/mL proteinase K, 50°C水浴45min。離心后收集菌體，重懸于PBS后，稀釋至I X IO7 IXlO8個細胞/mL菌液，超聲20s，間隔2s，重復2次。(6)流式細胞分析上樣前,每mL樣品加入5 ii L lmg/mL的碘化丙錠(PI),避光反應 5min。(7)樣品倍性用BD公司的FACSCalibur流式細胞儀進行分析。每個樣品檢測4X IO4個細胞，得到FCM圖譜。每個樣品做三個平行。酵母菌株的倍性用DNA含量(對應PI熒光強度)表示，通過與單倍體標準菌的對比得出。實驗結果如圖2、圖3、表I所示，四株單倍體疑似菌與單倍體標準菌W303-1B具有相似的熒光強度峰值和平均熒光強度，即具有相似的DNA含量，所以H2、H5、H12和H18被確認為單倍體菌株。表I五株菌FCM DNA和交配型分析結果
權利要求
1.一種快速鑒定啤酒酵母單倍體的方法，其特征在于首先采用菌落PCR進行初步判定，然后通過流式細胞儀檢測DNA含量確定倍性。
2.權利要求I所述的方法，其特征在于所述菌落PCR程序為95°C變性5min;94°C變性l-2min，50°C退火 30_60s，72°C延伸 l_2min，25-40 個循環；72°C總延伸 5min。
3.權利要求I或2所述的方法，其特征在于所述流式細胞儀檢測方法前處理步驟如下 菌株與單倍體標準菌W303-1A、W303-1B分別接種于YETO液體培養基，28°C振蕩培養12-24h ;取 O. 5-lmL 菌液到 I. 5mL 離心管中，8，000 X g-12, 000 X g 離心 5-lOmin 收集菌體，菌體重懸于PBS緩沖液后離心、洗滌2-3次，然后用PBS溶解；將菌液沸水浴2-8min殺死細胞；加入 10-12 μ L 10mg/mL 的 RNaseA, 50°C水浴 30_50min，然后加入 20-24 μ L 20mg/mLproteinase K, 50°C水浴30_50min ;離心后收集菌體,重懸于PBS后適當稀釋,超聲10_20s,間隔2-3s，重復2-3次；上機前每mL樣品加入5-10 μ L lmg/mL的碘化丙錠(PI)，避光反應5-10mino
全文摘要
本發明公開一種快速鑒定啤酒酵母單倍體的方法，屬于微生物鑒定領域。本發明采用菌落PCR和流式細胞技術聯用的實驗策略，高效、精確、可重復性好。相較于傳統的單倍體鑒定方法(長時間培養、染色鏡檢)而言，該發明能在極短的時間內得出實驗結果，大大減少工作量和工作時間，實驗結果也更加真實可信。而且，該發明能夠同時鑒定出單倍體菌株的交配型(MATa/MATα)，并能將釀酒酵母單倍體標準菌對實驗結果的影響降到最小。該發明中，MAT PCR不僅是菌株交配型的判定方法，更是倍性鑒定的初判手段，能快捷、方便的排除部分菌株的干擾。
文檔編號C12Q1/68GK102732620SQ201210189030
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月11日 優先權日2012年6月11日
發明者劉春鳳, 李崎, 李永仙, 王金晶, 許維娜, 鄭飛云 申請人:江南大學