一種Oscheius tipulae線蟲凍存液及其制備方法及該凍存液的應用的制作方法
【專利摘要】一種Oscheius?tipulae線蟲凍存液及其制備方法及該凍存液的應用，本發明涉及凍存液及其制備方法及該凍存液的應用。本發明要解決常規線蟲甘油凍存液無法冷凍保種Oscheius?tipulae線蟲的問題。凍存液由瓊脂膠、四氫呋喃和緩沖液組成；制備方法：一、制備緩沖液；二、制備瓊脂膠；三、制備凍存液；該凍存液用于Oscheius?tipulae線蟲的凍存。本發明凍存的Oscheius?tipulae線蟲解凍復蘇后正常生長繁殖，保證了對野外捕獲的Oscheius?tipulae線蟲進行室內培養的可持續性。本發明用于Oscheius?tipulae線蟲的凍存。
【專利說明】—種Oscheius t i pu I ae線蟲凍存液及其制備方法及該凍存液的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及凍存液及其制備方法及該凍存液的應用。
【背景技術】
[0002]Oscheius tipulae為小桿科線蟲,與秀麗隱桿線蟲C.elegans具有相近的生態位和相似的生活型。發明人在野外捕獲了 Oscheius tipulae并在室內培養成功。大多數線蟲在以甘油為主要成分的凍存液中，于_80°C可長期保存，在室溫下復蘇后可正常生長繁殖。但Oscheius tipulae在甘油凍存液中無法復蘇,進一步研究發現甘油對Oscheius tipulae具有致命毒性。因此常規的甘油凍存液對Oscheius tipulae的長期保存不適用。

【發明內容】

[0003]本發明要解決常規線蟲甘油凍存液無法冷凍保種Oscheius tipulae線蟲的問題，而提供一種Oscheius tipulae線蟲凍存液及其制備方法及該凍存液的應用。
[0004]一種Oscheius tipulae線蟲凍存液按體積百分含量由5%~15%的瓊脂膠、10%~20%的四氫呋喃和余量為緩沖液組成；
[0005]其中緩沖液中KH2PO4的濃度為0.003g/mL、Na2HPO4的濃度為0.006g/mL、NaCl的濃度為 0.004g/mL ~0.006g/mL、MgSO4 的濃度為 0.001g/mL ；
[0006]所述瓊脂膠的制備方法如下:
[0007]a、將KH2P04、Na2HPO4, NaCl和MgSO4加入蒸餾水中，配制成緩沖液，再放入高壓蒸汽滅菌鍋中，控制溫度為120°C，滅菌20min，其中，緩沖液中Iffl2PO4的濃度為0.003g/mL、Na2HPO4 的濃度為 0.006g/mL、NaCl 的濃度為 0.004g/mL ~0.006g/mL、MgSO4 的濃度為
0.001g/mL ；
[0008]b、將瓊脂加入步驟a制備的緩沖液中，封口膜密封后放入高壓蒸汽滅菌鍋中，控制溫度為120°C，滅菌20min，再室溫冷卻凝固得瓊脂膠，其中，瓊脂與緩沖液的質量體積比為(0.02g ~0.03g): IOmL0
[0009]—種Oscheius tipulae線蟲凍存液的制備方法,具體按以下步驟進行:
[0010]一、將KH2P04、Na2HPO4, NaCl和MgSO4加入蒸餾水中，配制成緩沖液，再放入高壓蒸汽滅菌鍋中，控制溫度為120°C，滅菌20min，其中，緩沖液中KH2PO4的濃度為0.003g/mL、Na2HPO4 的濃度為 0.006g/mL、NaCl 的濃度為 0.004g/mL ~0.006g/mL、MgSO4 的濃度為
0.001g/mL ；
[0011]二、將瓊脂加入步驟一制備的緩沖液中，封口膜密封后放入高壓蒸汽滅菌鍋中，控制溫度為120°c，滅菌20min，再室溫冷卻凝固得瓊脂膠；
[0012]三、將步驟二得到的瓊脂膠研碎，再加入步驟一制備的緩沖液，然后加入四氫呋喃，攪拌均勻，得到一種Oscheius tipulae線蟲凍存液,其中，按體積百分含量瓊脂膠為5%~15%、四氫呋喃為10%~20%、余量為緩沖液。[0013]上述凍存液用于Oscheius tipulae線蟲的凍存。
[0014]本發明制備出一種不含甘油的適用于Oscheius tipulae長期保持的凍存液，保證了 Oscheius tipulae室內研究的可持續進行。
[0015]本發明的有益效果是:本發明解決了常規線蟲甘油凍存液無法冷凍保種Oscheiustipulae線蟲的問題。利用本發明的線蟲凍存液可長期保種Oscheius tipulae線蟲。本發明凍存的Oscheius tipulae線蟲解凍復蘇后正常生長繁殖,保證了對野外捕獲的Oscheiustipulae線蟲進行室內培養的可持續性。
[0016]本發明用于Oscheius tipulae線蟲的凍存。
【具體實施方式】
[0017]本發明技術方案不局限于以下所列舉的【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】之間的任意組合。
[0018]【具體實施方式】一:本實施方式一種Oscheius tipulae線蟲凍存液按體積百分含量由5%~15%的瓊脂膠、10%~20%的四氫呋喃和余量為緩沖液組成；
[0019]其中緩沖液中KH2PO4的濃度為0.003g/mL、Na2HPO4的濃度為0.006g/mL、NaCl的濃度為 0.004g/mL ~0.006g/mL、MgSO4 的濃度為 0.001g/mL ；
[0020]所述瓊脂膠的制 備方法如下:
[0021]a、將KH2P04、Na2HPO4, NaCl和MgSO4加入蒸餾水中，配制成緩沖液，再放入高壓蒸汽滅菌鍋中，控制溫度為120°C，滅菌20min，其中，緩沖液中KH2PO4的濃度為0.003g/mL、Na2HPO4 的濃度為 0.006g/mL、NaCl 的濃度為 0.004g/mL ~0.006g/mL、MgSO4 的濃度為
0.001g/mL ；
[0022]b、將瓊脂加入步驟a制備的緩沖液中，封口膜密封后放入高壓蒸汽滅菌鍋中，控制溫度為120°C，滅菌20min，再室溫冷卻凝固得瓊脂膠，其中，瓊脂與緩沖液的質量體積比為(0.02g ~0.03g): IOmL0
[0023]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:一種Oscheiustipulae線蟲凍存液按體積百分含量由8%~11%的瓊脂膠、12%~18%的四氫呋喃和余量為緩沖液組成。其它與【具體實施方式】一相同。
[0024]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:一種Oscheiustipulae線蟲凍存液按體積百分含量由6%的瓊脂膠、11%的四氫呋喃和余量為緩沖液組成。其它與【具體實施方式】一相同。
[0025]【具體實施方式】四:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:一種Oscheiustipulae線蟲凍存液按體積百分含量由13%的瓊脂膠、19%的四氫呋喃和余量為緩沖液組成。其它與【具體實施方式】一相同。
[0026]【具體實施方式】五:【具體實施方式】一所述的一種Oscheius tipulae線蟲凍存液的制備方法，具體按以下步驟進行:
[0027]一、將KH2P04、Na2HPO4, NaCl和MgSO4加入蒸餾水中，配制成緩沖液，再放入高壓蒸汽滅菌鍋中，控制溫度為120°C，滅菌20min，其中，緩沖液中KH2PO4的濃度為0.003g/mL、Na2HPO4 的濃度為 0.006g/mL、NaCl 的濃度為 0.004g/mL ~0.006g/mL、MgSO4 的濃度為
0.001g/mL ；[0028]二、將瓊脂加入步驟一制備的緩沖液中，封口膜密封后放入高壓蒸汽滅菌鍋中，控制溫度為120°C，滅菌20min，再室溫冷卻凝固得瓊脂膠；
[0029]三、 將步驟二得到的瓊脂膠研碎，再加入步驟一制備的緩沖液，然后加入四氫呋喃，攪拌均勻，得到一種Oscheius tipulae線蟲凍存液,其中，按體積百分含量瓊脂膠為5%~15%、四氫呋喃為10%~20%、余量為緩沖液。
[0030]【具體實施方式】六:本實施方式與【具體實施方式】五不同的是:步驟二中瓊脂與緩沖液的質量體積比為(0.02g~0.03g): 10mL。其它與【具體實施方式】五相同。
[0031]【具體實施方式】七:本實施方式與【具體實施方式】五不同的是:步驟三中按體積百分含量瓊脂膠為10%。其它與【具體實施方式】五相同。
[0032]【具體實施方式】八:【具體實施方式】一所述的一種Oscheius tipulae線蟲凍存液用于Oscheius tipulae線蟲的凍存。
[0033]【具體實施方式】九:本實施方式與【具體實施方式】八不同的是:該凍存液用于Oscheius tipulae線蟲的凍存,具體操作如下:
[0034]A、將KH2P04、Na2HPO4, NaCl和MgSO4加入蒸餾水中，配制成緩沖液，再放入高壓蒸汽滅菌鍋中，控制溫度為120°C，滅菌20min，其中，緩沖液中KH2PO4的濃度為0.003g/mL、Na2HPO4 的濃度為 0.006g/mL、NaCl 的濃度為 0.004g/mL ~0.006g/mL、MgSO4 的濃度為
0.001g/mL ；
[0035]B、取各發育階段的Oscheius tipulae幼蟲、成蟲及蟲卵，用步驟A制備的緩沖液清洗干凈，然后放入【具體實施方式】一所述的一種Oscheius tipulae線蟲凍存液中，再放入溫度為-73°C~_80°C的冰箱中，完成Oscheius tipulae線蟲的凍存。其它與【具體實施方式】八相同。
[0036]【具體實施方式】十:本實施方式與【具體實施方式】八不同的是:步驟二中冰箱溫度為-78V。其它與【具體實施方式】八相同。
[0037]采用以下實施例驗證本發明的有益效果:
[0038]實施例一:
[0039]本實施例一種Oscheius tipulae線蟲凍存液的制備方法,具體按以下步驟進行:
[0040]一、將KH2P04、Na2HPO4, NaCl和MgSO4加入蒸餾水中，配制成緩沖液，再放入高壓蒸汽滅菌鍋中，控制溫度為120°C，滅菌20min，其中，緩沖液中KH2PO4的濃度為0.003g/mL、Na2HPO4 的濃度為 0.006g/mL、NaCl 的濃度為 0.005g/mL、MgSO4 的濃度為 0.001g/mL ；
[0041]二、將瓊脂加入步驟一制備的緩沖液中，封口膜密封后放入高壓蒸汽滅菌鍋中，控制溫度為120°C，滅菌20min，再室溫冷卻凝固得瓊脂膠，其中，瓊脂與緩沖液的質量體積比為 0.03g: IOmL ；
[0042]三、將步驟二得到的瓊脂膠研碎，再加入步驟一制備的緩沖液，然后加入四氫呋喃，攪拌均勻，得到一種Oscheius tipulae線蟲凍存液,其中，按體積百分含量瓊脂膠為15%、四氫呋喃為20%、余量為緩沖液。
[0043]該凍存液用于Oscheius tipulae線蟲的凍存,具體操作如下:
[0044]A、將KH2P04、Na2HPO4, NaCl和MgSO4加入蒸餾水中，配制成緩沖液，再放入高壓蒸汽滅菌鍋中，控制溫度為120°C，滅菌20min，其中，緩沖液中KH2PO4的濃度為0.003g/mL、Na2HPO4 的濃度為 0.006g/mL、NaCl 的濃度為 0.005g/mL、MgSO4 的濃度為 0.001g/mL ；[0045]B、取各發育階段的Oscheius tipulae幼蟲、成蟲及蟲卵，用步驟A制備的緩沖液清洗干凈，然后放入本實施例所述的一種Oscheius tipulae線蟲凍存液中，再放入溫度為_80°C的冰箱中，完成Oscheius tipulae線蟲的凍存。 [0046]本實施例凍存的Oscheius tipulae線蟲解凍復蘇后正常生長繁殖,保證了對野外捕獲的Oscheius tipulae線蟲進行室內培養的可持續性。
【權利要求】
1.一種Oscheius tipulae線蟲凍存液,其特征在于一種Oscheius tipulae線蟲凍存液按體積百分含量由5%~15%的瓊脂膠、10%~20%的四氫呋喃和余量為緩沖液組成； 其中緩沖液中KH2PO4的濃度為0.003g/mL、Na2HPO4的濃度為0.006g/mL、NaCl的濃度為 0.004g/mL ~0.006g/mL、MgSO4 的濃度為 0.001g/mL ； 所述瓊脂膠的制備方法如下: a、將KH2P04、Na2HP04、NaCl和MgSO4加入蒸餾水中，配制成緩沖液，再放入高壓蒸汽滅菌鍋中，控制溫度為120°C，滅菌20min，其中，緩沖液中KH2PO4的濃度為0.003g/mL、Na2HP04的濃度為 0.006g/mL、NaCl 的濃度為 0.004g/mL ~0.006g/mL、MgSO4 的濃度為 0.001g/mL ； b、將瓊脂加入步驟a制備的緩沖液中，封口膜密封后放入高壓蒸汽滅菌鍋中，控制溫度為120°C，滅菌20min，再室溫冷卻凝固得瓊脂膠，其中，瓊脂與緩沖液的質量體積比為(0.02g ~0.03g): 10mT,η
2.根據權利要求1所述的一種Oscheiustipulae線蟲凍存液，其特征在于一種Oscheius tipulae線蟲凍存液按體積百分含量由8%~11%的瓊脂膠、12%~18%的四氫呋喃和余量為緩沖液組成。
3.根據權利要求1所述的一種Oscheiustipulae線蟲凍存液，其特征在于一種Oscheius tipulae線蟲凍存液按體積百分含量由6%的瓊脂膠、11%的四氫呋喃和余量為緩沖液組成。
4.根據權利要求1所述的一種Oscheiustipulae線蟲凍存液，其特征在于一種Oscheius tipulae線蟲 凍存液按體積百分含量由13%的瓊脂膠、19%的四氫呋喃和余量為緩沖液組成。
5.如權利要求1所述的一種Oscheiustipulae線蟲凍存液的制備方法,其特征在于具體按以下步驟進行: 一、將KH2P04、Na2HPO4,NaCl和MgSO4加入蒸餾水中，配制成緩沖液，再放入高壓蒸汽滅菌鍋中，控制溫度為120°C，滅菌20min，其中，緩沖液中KH2PO4的濃度為0.003g/mL、Na2HP04的濃度為 0.006g/mL> NaCl 的濃度為 0.004g/mL ~0.006g/mL、MgSO4 的濃度為 0.001g/mL ； 二、將瓊脂加入步驟一制備的緩沖液中，封口膜密封后放入高壓蒸汽滅菌鍋中，控制溫度為120°C，滅菌20min，再室溫冷卻凝固得瓊脂膠； 三、將步驟二得到的瓊脂膠研碎，再加入步驟一制備的緩沖液，然后加入四氫呋喃，攪拌均勻，得到一種Oscheius tipulae線蟲凍存液，其中，按體積百分含量瓊脂膠為5%~15%、四氫呋喃為10%~20%、余量為緩沖液。
6.根據權利要求5所述的一種Oscheiustipulae線蟲凍存液的制備方法,其特征在于步驟二中瓊脂與緩沖液的質量體積比為(0.02g~0.03g): 10mL。
7.根據權利要求5所述的一種Oscheiustipulae線蟲凍存液的制備方法,其特征在于步驟三中按體積百分含量瓊脂膠為10%。
8.如權利要求1所述的一種Oscheiustipulae線蟲凍存液的應用，其特征在于該凍存液用于Oscheius tipulae線蟲的凍存。
9.根據權利要求8所述的一種Oscheiustipulae線蟲凍存液的應用，其特征在于該凍存液用于Oscheius tipulae線蟲的凍存,具體操作如下: A、將KH2P04、Na2HP04、NaCl和MgSO4加入蒸餾水中，配制成緩沖液，再放入高壓蒸汽滅菌鍋中，控制溫度為120°C，滅菌20min，其中，緩沖液中KH2PO4的濃度為0.003g/mL、Na2HP04的濃度為 0.006g/mL、NaCl 的濃度為 0.004g/mL ~0.006g/mL、MgSO4 的濃度為 0.001g/mL ； B、取各發育階段的Oscheius tipulae幼蟲、成蟲及蟲卵，用步驟A制備的緩沖液清洗干凈，然后放入權利要求1所述的一種Oscheius tipulae線蟲凍存液中，再放入溫度為-73°C~_80°C的冰箱中，完成Oscheius tipulae線蟲的凍存。
10.根據權利要求8所述的一種Oscheius tipulae線蟲凍存液的應用，其特征在于步驟二中冰箱溫 度為-78V。
【文檔編號】A01N1/02GK103891710SQ201410085826
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月11日 優先權日:2014年3月11日
【發明者】王云彪, 郭泰亮 申請人:中國科學院東北地理與農業生態研究所