一種sit1突變蛋白及其編碼基因與其在植物耐逆性中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種SIT1突變蛋白及其編碼基因與其在植物耐逆性中的應用。本發明提供了一種蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列3衍生的蛋白質。本發明的實驗證明，本發明發現水稻類受體激酶突變基因SIT1KE，其導入植物中可以提高植物耐鹽性，且比野生型SIT1基因的耐鹽性高。證明該突變基因具有耐鹽性，為提高農作物抗鹽性上提供了重要的理論依據和應用價值。
【專利說明】一種SIT1突變蛋白及其編碼基因與其在植物耐逆性中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種SITl突變蛋白及其編碼基因與其在植物耐逆性中的應用。
【背景技術】
[0002]鹽脅迫是目前世界上影響作物產量的最主要的非生物因素。據聯合國糧農組織的不完全統計，我國鹽堿地面積占耕地總面積的20%以上，且由于灌溉方式不當及淡水資源匱乏等原因，這個比例還在不斷增長。研究作物耐鹽機制對于增加作物種植面積，提高糧食
產量具有非常重要的意義。
[0003]植物在遭受外界鹽脅迫時，植物會做出一系列的應激反應，目前關于這一方面的報道主要集中在離子通道及其調控子以及轉錄因子等基因上，比如朱健康教授實驗室所報道的經典的S0S(Salt Overly Sensitive)系統，大致由三個主要的組成部分S0S1，S0S2，S0S3構成，該系統通過磷酸化的調節植物Na離子的外排。還有另一類經典的基因家族轉運蛋白HKT1，第一 HKT蛋白在小麥中被克隆出來發現該基因能夠具有選擇性的親和鈉離子和鉀離子，但是在 擬南芥中AtHKTl卻并不像小麥HKT —樣具有較高的離子選擇性，而是在參與調節擬南芥地上和地下部分中的鈉離子平衡過程中，而在水稻中鑒定出的0sHKT2.1則是在根中調節了在低鉀的情況下的鈉離子的攝入發揮作用。而在轉錄因子方面科學家們已經鑒定出了許多和鹽脅迫相關的各類轉錄因子，比如一些鋅指蛋白、MYB、AP2/ERF、WRKY和NAC類的轉錄因子都是報道比較多的調節鹽響應的幾大類轉錄因子，比如Zatl2，ZFP179,ZFP182，SNACl，SNAC2, SERFl等基因。還有極少數關于植物耐鹽性的報道是關于位于細胞表面的負責信號感知的類受體激酶的比如OsSIKl，Srlk，AtLecRK2，鹽脅迫信號經過一系列的中間傳遞過程，誘導下游脅迫響應基因表達，使植物產生耐鹽反應。植物類受體激酶是植物中最為龐大的基因家族之一，關于此類基因的研究已成為植物學領域的一個研究熱點。植物類受體激酶蛋白主要由三部分組成:結構多樣的胞外結構域，跨膜域和保守的胞內激酶結構域。根據植物類受體激酶胞外結構域的不同，植物類受體激酶家族被分為多個亞家族。自從20多年前第一個植物類受體激酶在玉米中被發現以后，越來越多的類受體激酶被克隆出來，并被證明參與了從植物生長發育到參與逆境反應，如植物的自交不親和過程，激素信號的接收和傳遞，生長發育的調節，抗病反應等植物生長發育的各個方面。
[0004]已有結果表明類受體激酶很有可能作為細胞表面的鹽脅迫信號的感應分子來發揮作用。因此，研究植物類受體激酶在植物耐鹽反應中的作用，對于闡明植物的抗鹽機制是十分重要的。該基因及其點突變形式的發現以及對其功能的研究對于闡述植物耐鹽性的機理提供了新的線索并對基因工程育種方面提供了新的材料和應用價值。

【發明內容】

[0005]本發明的一個目的是提供一種SITl突變蛋白及其編碼基因。[0006]本發明的SITl突變蛋白，是如下(a)或(b):
[0007](a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0008](b)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列3衍生的蛋白質。
[0009]上述經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0010]編碼上述蛋白的DNA分子也是本發明保護的范圍。
[0011]上述DNA分子是如下⑴-⑶中任一種的DNA分子:
[0012](1)編碼區為序列表中的序列2所示的DNA分子；
[0013](2)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼與植物耐逆性相關的蛋白的DNA分子；
[0014](3)與⑴限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與植物耐逆性相關蛋白的DNA分子。
[0015]上述嚴格條件為如下:50°C，在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4和ImMEDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2XSSC，0.1% SDS中漂洗；
[0016]含有上述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也是本發明保護的范圍。
[0017]上述重組載體為將上述DNA分子插入表達載體中，得到表達上述蛋白的重組載體。
[0018]在本發明的實施例中，表達載體為pCAMBIA1300-35S::MH載體，重組載體為將序列表中序列2所示的核苷酸插入pCAMBIA1300-35S::MH載體的XbaI和BglII雙酶切位點間得到的載體。
[0019]pCAMBIA1300-35S::MH載體為將序列5所示的DNA分子插入pCAMBIA1300載體的BamHI和EcoRI酶切位點得到的載體。
[0020]擴增上述DNA分子全長或其任意片段的引物對也是本發明保護的范圍。
[0021]上述蛋白、上述DNA分子或上述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在調控植物耐逆性中的應用也是本發明保護的范圍。
[0022]上述應用中,所述耐逆性為耐鹽性；
[0023]所述調控植物耐逆性為提高植物耐逆性；
[0024]所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。
[0025]本發明的另一個目的是提供一種培育轉基因植物的方法。
[0026]本發明提供的方法，為將上述蛋白的DNA分子導入目的植物，獲得轉基因植物，所述轉基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
[0027]上述方法中，所述耐逆性為耐鹽性；
[0028]所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。
[0029]本發明的實驗證明，本發明發現水稻類受體激酶突變基因SITIke，其導入植物中可以提高植物耐鹽性，且比野生型SITl基因的耐鹽性高。證明該突變基因具有耐鹽性，為提高農作物抗鹽性上提供了重要的理論依據和應用價值。【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為SITl擬南芥超表達突變體的耐鹽性分析圖【具體實施方式】
[0031 ] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0032]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0033]實施例1、SITl突變基因SITIke及其過表達載體的構建
[0034]1、SITl基因的獲得
[0035]提取日本晴水稻葉片RNA，反轉錄得到cDNA為模板，用引物5' GCTCTAGATGCGGCGTCCCGAGCTAA3'和 5' GAAGATCTCGCTCGAGGAATGTCA3'進行PCR擴增，得到2034bp的PCR產物，經過測序，具有序列表序列I所示的核苷酸，為SITl去除終止密碼子的基因。
[0036]2、SITl突變基因SITIke的獲得
[0037]I)過表達SITl基因重組載體
[0038]pCAMBIA1300-35S::MH載體為將序列5所示的DNA分子插入pCAMBIA1300載體的BamHI和EcoRI酶切位點得到的載體。 [0039]以cDNA 作為模板，用 5 ' GCTCTAGATGCGGCGTCCCGAGCTAA3 '和5 ' GAAGATCTCGCTCGAGGAATGTCA3'進行 PCR 擴增，得到 2034bp 的 PCR 產物，經過測序，該PCR產物具有序列表序列I自5’末端第I位一 2022位核苷酸。
[0040]用XbaI和BglII雙酶切上述PCR產物，得到的酶切產物與經過同樣酶切的PCAMBIA1300-35S::MH載體連接，得到重組載體pCAMBIA1300_35S::SIT1 — 7M6H，為過表達SITl基因重組載體。
[0041]經過測序，該載體為將序列表序列I自5’末端第I位一 2022位核苷酸插入PCAMBIA1300-35S::MH載體的XbaI和BglII酶切位點間得到的載體。
[0042]2) SITl激酶點突變載體
[0043]序列I自5’末端第I位-2022位核苷酸為去終止密碼子的SITl。
[0044]將此片段利用Gateway方法連入pENTRTM/SD/D-T0P0載體，得到重組載體pENTR?/SD/D-T0P0-SIT1。
[0045]設計SITIke點突變引物，參照Transgene點突變試劑盒方法用重組載體pENTR?/SD/D-T0P0-SIT1生產含SITIke的重組載體。
[0046]SITIkeA突變引物如下:
[0047]5’ GTGGAGATTGCAGTGGAGAAGGTATCCCACG3’ 和
[0048]5’ CCACTGCAATCTCCACTCGGGATACCAGTA3’
[0049]用XbaI和BglII雙酶切含SITIke的重組載體，回收2034bp的片段，與經過同樣酶切的載體 PCAMBIA1300-35S::MH 連接，得到 pCAMBIA1300_35S:: SIT1KE_7M6H。經過測序，該載體為將序列表中序列2所示的核苷酸插入pCAMBIA1300-35S::MH載體的XbaI和BglII雙酶切位點間得到的載體。
[0050]序列表中序列2所示的核苷酸為SITl突變基因SITIke，該基因編碼的蛋白SITIke的氨基酸序列為序列表中序列3。
[0051]序列表中序列I所示的核苷酸為SITl基因，該基因編碼的蛋白SITl的氨基酸序列為序列表中序列4。
[0052]SITl基因的序列I自5’末端第1156-1158位AAG突變為GAG，得到序列2所示的SITIke ；
[0053]SITl蛋白的序列4自N’末端第386位賴氨酸突變為谷氨酸，得到序列3所示的SITIke0
[0054]實施例2、突變基因SITIke在提高植物耐逆性中的應用
[0055]1、轉SITIke擬南芥的構建
[0056]將實施例1得到的重組質粒pCAMBIA1300-35S:: SITIke — 7M6H轉化農桿菌GV3101，得到含有重組質粒的GV3101 (提取質粒測序鑒定，質粒為PCAMBIA1300-35S:: SITIke — 7M6H)。
[0057]擬南芥的遺傳轉化:把調配好的含有農桿菌的轉化介質倒入大小合適的燒杯或廣口罐頭瓶中，將已經提前剪過角果和開放花蕾的擬南芥(擬南芥的品種col-Ο，以下簡稱野生型擬南芥)受體植株的整個地上部分都浸沒到轉化介質中，浸泡5-6min ;取出擬南芥植株，將莖、葉、花上等多 余的水珠輕輕抖落，橫躺在平整的桌面或凳子上，等水珠基本干燥后置于干凈的塑料盒中，仍然維持橫躺的姿勢，并用黑色袋子覆蓋避光保溫，22°C光照培養室中恢復培養16-36h ;揭去黑袋,將擬南芥重新豎直放置,在22°C光照培養室中正常培養；一般生長2-3周后，角果多數已經飽滿，此時盡量少澆水和營養液，促進種子成熟；種子成熟后，放于1.5ml Ep管中，加入適量干燥劑硅膠，常溫下短期保存，長期保存最好把干燥的種子置于_70°C冰箱，得到Tl代轉SITIke擬南芥種子。
[0058]提取Tl 代轉 SITIke 擬南芥葉片基因組 DNA，用 5’ -ATGCGGCGTCCCGAGCTAA-3’ 和5’ -CGCTCGAGGAATGTCA-3’進行PCR擴增，得到2022bp的為陽性Tl代轉SITIke擬南芥。
[0059]播種陽性Tl代轉SITIke擬南芥傳代，直到得到T3代轉SITIke擬南芥。T3代純和植株通過western blot利用c_MYC抗體(sigma)檢測SITIke-MYC融合蛋白的表達。
[0060]采用同樣的方法將pCAMBIA1300-35S::SIT1 — 7M6H轉入擬南芥中，培養直到得到T3代轉SITl擬南芥。
[0061]2、SITIke在提高水稻耐鹽性中的應用
[0062]將T3代轉SITIke擬南芥株系4#、9#在含有10mM NaCl的1/2MS培養基上培養，以野生型擬南芥Col和T3代轉SITl擬南芥為對照。實驗重復3次，結果取平均值。
[0063]結果如圖1所示，A圖為表型圖，B圖為存活率統計圖，其中，SITl為T3代轉SITl擬南芥、SIT1ke9和SIT1ke4為T3代轉SITIke擬南芥株系、col為野生型擬南芥；可以看出，
[0064]在正常條件下，各個株系無顯著差異；
[0065]在10mM NaCl脅迫下，與野生型擬南芥和T3代轉SITl擬南芥相比，點突變SIT1daT3代轉SITIke擬南芥SIT1KE9和SIT1KE4均表現出明顯的耐鹽抗性，轉SITIke擬南芥的存活率(為95%以上)高于野生型植物(約85%)，遠遠高于T3代轉SITl擬南芥SITl。
[0066]上述結果表明，SITIke可以提高植物鹽性，在植物耐鹽性方面發揮正向調節作用。
【權利要求】
1.一種蛋白，是如下(a)或(b): (a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列3衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述蛋白的DNA分子。
3.如權利要求2所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子是如下(1)-(3)中任一種的DNA分子: (1)編碼區為序列表中的序列2所示的DNA分子； (2)在嚴格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼與植物耐逆性相關的蛋白的DNA分子; (3)與(1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與植物耐逆性相關蛋白的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.如權利要求4所述的重組載體，其特征在于: 所述重組載體為將權利要求2或3所述DNA分子插入表達載體中，得到表達權利要求1所述蛋白的重組載體。
6.擴增權利要求2或3所述DNA分子全長或其任意片段的引物對。
7.權利要求1所述蛋白、權利要求2或3所述DNA分子或權利要求4所述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在調控植物耐逆性中的應用。
8.根據權利要求8所述的應用，其特征在于:所述耐逆性為耐鹽性； 所述調控植物耐逆性為提高植物耐逆性； 所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。
9.一種培育轉基因植物的方法，為將編碼權利要求1所述蛋白的DNA分子導入目的植物，獲得轉基因植物，所述轉基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于:所述耐逆性為耐鹽性； 所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。
【文檔編號】A01H5/00GK104031131SQ201410227807
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月27日 優先權日:2014年5月27日
【發明者】孫穎, 王耕, 李晨輝, 艾連峰, 張勝偉 申請人:河北師范大學