家畜精液冷凍保存用抗凍劑、稀釋液及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種家畜精液冷凍保存用抗凍劑、稀釋液及其應用。所涉及的家畜精液冷凍保存用抗凍劑為甜菜堿。所涉及的家畜精液冷凍保存稀釋液包括常規稀釋液和抗凍劑，所述抗凍劑為甜菜堿，優選的常規稀釋液的配方為：葡萄糖1.1g、檸檬酸1.48g、Tris2.42g、新鮮雞蛋黃10％、青霉素鈉0.06g、硫酸鏈霉素0.1g、蒸餾水100ml。本發明的家畜精液冷凍保存稀釋液尤其適用于牛、豬、羊細管冷凍精液人工授精及精液超低溫冷凍后的長期保存和長途運輸后輸精，可顯著提高冷凍-解凍后精子活率、頂體完整率和質膜完整率，保持精子的受精活力。
【專利說明】家畜精液冷凍保存用抗凍劑、稀釋液及其應用

【技術領域】
[0001]本發明屬于哺乳動物精液的超低溫冷凍保存【技術領域】，具體涉及一種家畜精液冷凍保存用抗凍劑，同時還涉及一種家畜精液冷凍保存稀釋液，進一步還涉及家畜精液冷凍保存稀釋液的應用。

【背景技術】
[0002]哺乳動物精液冷凍保存技術為高度集約化的現代畜牧業發展提供了重要的技術支持。當甘油作為一種冷凍保護劑被用于精液冷凍保存以來，世界各國就開始了大規模的研究與應用。精液冷凍保存時間可以長達數十年之久，解決了哺乳動物雄性種質資源保護問題，使雄性優良種質資源的使用不受時間、地域的限制，便于開展省際、國際之間的協作，提高優良種畜的利用率；在建立全球優良物種基因庫，延長優良種畜的使用壽命；在及早進行后裔測定，縮短世代間隔和加快動物育種進程方面以及在保留和恢復精液供應、血統更新、引種、降低生產成本等方面均有重要意義。
[0003]精液冷凍是保存遺傳資源，建立精子基因庫的重要措施。而冷凍精子質量好壞與家畜的妊娠率、分娩率等密切相關。從目前的情況來看，盡管冷凍精液已經應用于養牛生產，但需要進一步提高精子活率和受精能力；而豬精子在冷凍解凍以后的精子活率、頂體完整率、質膜完整率等要遠低于新鮮精液，精子DNA、線粒體等的損傷要高于新鮮精液，導致在商品化養豬生產中，利用冷凍精液進行人工授精時母豬的受胎率和產仔率都較低而不能廣泛應用。為了解決這一問題，科研工作者進行了大量的研究，但是冷凍-解凍后精子活率仍不十分理想。
[0004]盡管甘油可以作為一種較好的冷凍保護劑已經可以用于養牛生產，但是以此為基礎的冷凍稀釋液對精子的保護性能較差，冷凍解凍后精子活率較低，與生產需求還存在較大差距，需要尋找新的冷凍保護劑；而以甘油為基礎的冷凍保護劑還不能用于養豬生產。隨著全國性、區域性種牛、豬聯合育種工作的深入開展，對精液冷凍保護劑研究越來越顯得迫切。
[0005]有關甜菜堿作為冷凍保護劑用于牛、豬等家畜精液冷凍保存的研究國內外尚未見相關報道。


【發明內容】

[0006]針對目前家畜精液冷凍的不足之處，本發明目的之一在于提供一種用于家畜精液冷凍保存的抗凍劑。實現該目的的技術方案是:
[0007]—種家畜精液冷凍保存用抗凍劑，所述抗凍劑為甜菜堿。
[0008]所述甜菜堿為從海帶中提取的甜菜堿。
[0009]針對現有技術的缺陷或不足，本發明的另一目的在于提供一種抗凍稀釋液及其制備方法，能有效提高牛、豬精液冷凍-解凍后的精子活率、頂體完整率、質膜完整率和DNA完整性。實現該目的的技術方案是:
[0010]一種家畜精液冷凍保存稀釋液，所述家畜精液冷凍保存稀釋液包括常規稀釋液和抗凍劑，所述抗凍劑為甜菜堿。
[0011]所述常規稀釋液的配方為:葡萄糖1.lg、檸檬酸1.48g、Tris2.42g、新鮮雞蛋黃10%、青霉素納0.06g、硫酸鏈霉素0.lg、蒸懼水100ml。
[0012]所述抗凍劑在每10ml常規稀釋液中的添加量為50?250mg。
[0013]所述家畜精液冷凍保存稀釋液中添加有體積比為2% -4%的甘油。
[0014]所述家畜精液冷凍保存稀釋液的pH值為6.5?7.5。
[0015]上述的家畜精液冷凍保存稀釋液用于保存豬精液時，所述抗凍劑在每10ml常規稀釋液中的添加量為100?200mg。
[0016]上述的家畜精液冷凍保存稀釋液用于保存牛精液時，所述抗凍劑在每10ml常規稀釋液中的添加量為150?250mg。
[0017]上述的家畜精液冷凍保存稀釋液用于保存羊精液時，所述抗凍劑在每10ml常規稀釋液中的添加量為50?lOOmg。
[0018]本發明首次將從海帶中提取的甜菜堿作為冷凍抗凍劑用于牛、豬、羊精液冷凍保存，制備方法簡單，取材容易，效果可靠，易于推廣，適用于牛、豬、羊細管冷凍精液人工授精及精液超低溫冷凍后的長期保存和長途運輸后輸精，可顯著提高冷凍-解凍后精子活率、頂體完整率和質膜完整率，保持精子的受精活力。

【具體實施方式】
[0019]本發明的家畜精液冷凍保存常規稀釋液的方法，包括下列步驟:
[0020](I)在常規稀釋液中加入抗凍劑混勻，所述抗凍劑為甜菜堿；
[0021](2)調節溶液pH值為6.5?7.5，過濾滅菌得家畜精液冷凍保存稀釋液。
[0022]如添加有甘油時，在步驟I所配制的稀釋液中添加合適量的甘油。優選的，步驟
(I)中在常規稀釋液中加入100?200mg抗凍劑時，添加3%的甘油，適合用于豬精液的冷凍保存；在常規稀釋液中加入150?250mg抗凍劑時，添加4%的甘油，適合用于牛精液的冷凍保存；常規稀釋液中加入50?10mg抗凍劑時，添加2%的甘油，適合用于羊精液的冷凍保存。
[0023]以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。
[0024]實施例1:
[0025]準確量取常規稀釋液組分(葡萄糖1.lg、檸檬酸1.48g、Tris2.42g、新鮮雞蛋黃10% (體積)、青霉素鈉0.06g、硫酸鏈霉素0.1g)溶于10ml蒸餾水，添加甜菜堿100?200mg，甘油3%配制成豬用精液冷凍保存稀釋液。調節溶液pH值為6.5?7.5，過濾滅菌，冷卻至室溫，放入4°C冰箱中備用。
[0026]發明人對該實施例的家畜精液冷凍保存稀釋液使用效果進行了如下試驗。
[0027](一 )精液采集
[0028]用手握法采精，選擇中段濃厚部分精液，經4層消毒紗布過濾除去膠狀物，用顯微鏡在37°C下進行常規品質檢查。選擇無異味、色澤為乳白色、精子形態正常、活率在0.7以上的精液用于試驗。
[0029]( 二)精液處理與冷凍
[0030]將新鮮精液加入等溫的常規稀釋液(30°C，1:1稀釋)，經紗布包裹后，在15°C恒溫箱中平衡lh。將平衡處理過的精液加入4°C的冷凍稀釋液，用紗布包裹后置于4°C冰箱中平衡lh。調整精子密度為1.0X 109個/ml，用專用注射器將精液吸入0.25ml細管內，快速封管，置于程序冷凍儀中以1°C /min的速率從4°C緩慢降至-5°C，迅速移至液氮上方2-3cm熏蒸5-10min，將細管投入液氮中保存。
[0031](三)細管凍精的解凍和精子質量評定
[0032]1、精子活率
[0033]將細管凍精取出后迅速放入37°C的水浴中解凍45s，收集于小試管內，然后用常溫稀釋液稀釋，孵育5min，取10 μ L精液于載玻片上，蓋上蓋玻片，在400 X倒置顯微鏡下評價精子活率(直線運動精子百分率)。每次至少檢查200個精子，重復5次。
[0034]2、精子頂體完整率
[0035]利用FITC-PNA染液染色后，熒光顯微鏡觀察精子頂體形態。凍精細管解凍后，將精液加到2ml3% PVP液面上，800 X g，3min離心洗2次，棄上清；用PBS (37°C )重懸調整密度至I~2X 106個精子/ml ;吸取30 μ I精子懸液，涂片，空氣干燥，用純甲醇固定1min ；再加入30 μ I FITC-PNA染液，37°C黑暗潮濕環境孵育30min ;PBS沖洗，空氣干燥，滴少量甘油:PBS(9:1)，蓋片，用無色指甲油封片，盡快在400X熒光顯微鏡下觀察。每次至少檢查200個精子，重復5次。
[0036]3、精子質膜完整率
[0037]采用果糖-檸檬酸鈉低滲液進行低滲腫脹檢測(HOST)。將解凍的精液用常規稀釋液稀釋，調整精子密度為I X 106個/ml，37°C孵育30 min，取20 μ I精液于懸液滴于血細胞計數板上，400 X顯微鏡下觀察，計算彎尾精子百分率，每次至少檢查200個精子，重復5次。
[0038](四)精子質量評定結果
[0039]應用本發明的豬精液冷凍保存抗凍劑以及精液冷凍-解凍方法，評定結果如下:
[0040]當甜菜堿添加量為80~120mg，冷凍-解凍后精子活率達65%，頂體完整率達69%，質膜完整率達72%。
[0041]試驗例結果如下表1所示:
[0042]表1

【權利要求】
1.一種家畜精液冷凍保存用抗凍劑，其特征在于，所述抗凍劑為甜菜堿。
2.如權利要求1所述的家畜精液冷凍保存用抗凍劑，其特征在于，所述甜菜堿為從海帶中提取的甜菜堿。
3.一種家畜精液冷凍保存稀釋液，該家畜精液冷凍保存稀釋液包括常規稀釋液和抗凍齊IJ，其特征在于，所述抗凍劑為甜菜堿。
4.如權利要求3所述的家畜精液冷凍保存稀釋液，其特征在于，所述常規稀釋液的配方為:葡萄糖1.lg、檸檬酸1.48g、Tris2.42g、新鮮雞蛋黃10%、青霉素鈉0.06g、硫酸鏈霉素0.lg、蒸懼水10mlo
5.如權利要求4所述的家畜精液冷凍保存稀釋液，其特征在于，所述抗凍劑在每10ml常規稀釋液中的添加量為50?250mg。
6.如權利要求5所述的家畜精液冷凍保存稀釋液，其特征在于，所述家畜精液冷凍保存稀釋液中添加有體積比為2% -4%的甘油。
7.如權利要求3所述的家畜精液冷凍保存稀釋液，其特征在于，所述家畜精液冷凍保存稀釋液的PH值為6.5?7.5。
8.權利要求3所述的家畜精液冷凍保存稀釋液用于保存豬精液，其特征在于，所述抗凍劑在每10ml常規稀釋液中的添加量為100?200mg。
9.權利要求4所述的家畜精液冷凍保存稀釋液用于保存牛精液，其特征在于，所述抗凍劑在每10ml常規稀釋液中的添加量為150?250mg。
10.權利要求4所述的家畜精液冷凍保存稀釋液用于保存羊精液，其特征在于，所述抗凍劑在每10ml常規稀釋液中的添加量為50?lOOmg。
【文檔編號】A01N1/02GK104161036SQ201410335943
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月15日 優先權日:2014年7月15日
【發明者】李青旺, 胡靚華, 江中良 申請人:西北農林科技大學