鴨坦布蘇病毒囊膜e蛋白抑制肽及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽及其應(yīng)用，屬于動(dòng)物病毒分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明通過(guò)基因工程方法獲得DTMUV囊膜E蛋白，并以DTMUV?HN1株E蛋白作為靶標(biāo)，利用噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)篩選得到鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽，其氨基酸序列為：HWSTRQGSTRWN。該抑制肽可抑制鴨坦布蘇病毒在鴨胚成纖維細(xì)胞的增殖，在不同濃度下均能顯著下調(diào)DTMUV在鴨胚成纖維細(xì)胞中的病毒拷貝數(shù)，同時(shí)顯著降低DTMUV在鴨胚成纖維細(xì)胞中的病毒滴度，而其本身對(duì)鴨胚成纖維細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響。鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽在制備抗鴨坦布蘇病毒病的藥物或飼料添加劑方面具有良好的應(yīng)用前景，可用于鴨坦布蘇病毒病的防治。
【專(zhuān)利說(shuō)明】鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽，同時(shí)還涉及該抑制肽的應(yīng)用， 屬于動(dòng)物病毒分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，中國(guó)南方爆發(fā)了一種新的鴨病毒性傳染病，主要引起鴨產(chǎn)蛋嚴(yán)重下降，該 病傳播迅速、涉及范圍廣，發(fā)病前期為持續(xù)高熱，發(fā)病后期出現(xiàn)一定比例的神經(jīng)癥狀，表現(xiàn) 為癱瘓、翻滾、站立不穩(wěn)及共濟(jì)失調(diào)等，有些病鴨甚至在數(shù)日內(nèi)死亡。剖檢死亡鴨，多數(shù)呈現(xiàn) 脾臟和腎臟明顯腫大，蛋鴨表現(xiàn)為出血性卵巢炎。該病首先在江浙一帶爆發(fā)，隨后蔓延到福 建和安徽等地，之后在江西、山東、湖南、河南、河北相繼爆發(fā)。對(duì)于此病，國(guó)外尚未見(jiàn)報(bào)道。 國(guó)內(nèi)研究人員對(duì)其病原進(jìn)行了分離、形態(tài)學(xué)觀察、理化特性測(cè)定、RT-PCR檢測(cè)及序列分析， 現(xiàn)已確定該病病原為鴨坦布蘇病毒，故稱(chēng)該病為鴨坦布蘇病毒病。該病發(fā)病率高、傳播迅 速，發(fā)病范圍極廣，已給養(yǎng)鴨業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 鴨坦布蘇病毒（Duck tembusu virus，DTMUV)是一種新型黃病毒，屬于黃病毒科不 分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，其病毒粒子呈球形，直徑約45?50 nm，有囊膜和纖突，病毒約 由10990個(gè)核苷酸組成。該病毒對(duì)熱、脂溶劑和去氧膽酸鈉敏感，pH〈5或pH>10時(shí)便失去感 染活性，50°C以上加熱60 min即被滅活。DTMUV能在鴨胚、雞胚、鴨胚成纖維細(xì)胞及Vero、 BHKX6/36等部分傳代細(xì)胞系上增殖。其病毒基因組由5'端、3'端的非編碼區(qū)和中間的一 個(gè)開(kāi)放閱讀框組成，5'端的非編碼區(qū)長(zhǎng)度為142 nt，含I型m7GpppNp帽子結(jié)構(gòu)，3'端非編 碼區(qū)長(zhǎng)618 nt，沒(méi)有poly(A)尾巴，開(kāi)放閱讀框編碼由3410個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的多聚蛋白 前體。前體蛋白在宿主信號(hào)肽酶和病毒絲氨酸蛋白酶的作用下被切割成3種結(jié)構(gòu)蛋白（C、 prM 和 E)和 7 種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。
[0004] E蛋白是一種囊膜蛋白，編碼501個(gè)氨基酸，其氨基酸序列中存在高度保守區(qū)和變 異區(qū)。E蛋白位于成熟病毒顆粒表面，在病毒吸附受體、與宿主細(xì)胞膜融合以及病毒組裝過(guò) 程中具有重要的作用，且含有多種抗原表位，這些表位與病毒識(shí)別宿主細(xì)胞膜受體、吸附和 進(jìn)入細(xì)胞，病毒的致病性和誘導(dǎo)免疫應(yīng)答等密切相關(guān)，在病毒感染中起重要作用。另外，E蛋 白還具有較好的免疫原性和反應(yīng)原性，是宿主抗感染免疫的主要保護(hù)性抗原，也是檢測(cè)該 病毒特異性抗體的理想靶抗原。
[0005] 噬菌體展示技術(shù)是近年來(lái)興起的一項(xiàng)研究蛋白質(zhì)分子間相互作用的有效手段，具 有快捷、高效、表型和基因型一致等特點(diǎn)，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于肽類(lèi)藥物、抑制肽、抗原模擬 表位的篩選等研究領(lǐng)域。利用噬菌體展示技術(shù)篩選鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽，并研 究該抑制肽對(duì)DTMUV在鴨胚成纖維細(xì)胞增殖方面的影響，可為鴨坦布蘇病毒病防治提供一 個(gè)新的途徑，具有較好的應(yīng)用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽。
[0007] 同時(shí)，本發(fā)明還提供一種鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽的應(yīng)用。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0009] 鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0010] 所述的鴨坦布蘇病毒為鴨坦布蘇病毒HN1株。
[0011] 鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽的應(yīng)用，具體為鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽 在制備抗鴨坦布蘇病毒病（抑制鴨坦布蘇病毒增殖，如抑制鴨坦布蘇病毒在鴨胚成纖維細(xì) 胞增殖）的藥物或飼料添加劑中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的有益效果：
[0013] 本發(fā)明通過(guò)基因工程方法獲得DTMUV HN1株E蛋白，并以DTMUV HN1株E蛋白作 為靶標(biāo)，利用噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)篩選得到鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽，其氨基酸序列 為：HWSTRQGSTRWN。該抑制肽可抑制鴨坦布蘇病毒HN1株在鴨胚成纖維細(xì)胞的增殖。標(biāo)準(zhǔn) MTT法檢測(cè)E蛋白抑制肽對(duì)鴨胚成纖維細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，E蛋白抑制肽本身對(duì)鴨 胚成纖維細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響。熒光定量PCR和TCID50檢測(cè)E蛋白抑制肽對(duì)DTMUV在鴨 胚成纖維細(xì)胞增殖方面的影響，結(jié)果顯示，不同濃度的的抑制肽（0. 02 μ g/mL、0. 2 μ g/mL、 2 μ g/mL、20 μ g/mL)均能顯著下調(diào)DTMUV在鴨胚成纖維細(xì)胞中的病毒拷貝數(shù)，同時(shí)顯著降 低DTMUV在鴨胚成纖維細(xì)胞中的病毒滴度。結(jié)果表明，囊膜E蛋白抑制肽能抑制DTMUV在 鴨胚成纖維細(xì)胞的增殖，在DTMUV的防治中具有良好的應(yīng)用前景。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-E構(gòu)建示意圖；
[0015] 圖2為實(shí)施例1中ELISA檢測(cè)噬菌體展示肽對(duì)靶分子的結(jié)合活性；
[0016] 圖3為實(shí)施例1中噬菌體陽(yáng)性克隆競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)結(jié)果；
[0017] 圖4為試驗(yàn)例中DRMUV HN1株E蛋白抑制肽對(duì)鴨胚成纖維細(xì)胞增殖的影響；
[0018] 圖5為試驗(yàn)例中抑制肽對(duì)DRMUV HN1株在鴨胚成纖維細(xì)胞增殖的影響（Real time PCR)；
[0019] 圖6為試驗(yàn)例中抑制肽對(duì)DRMUV HN1株在鴨胚成纖維細(xì)胞增殖的影響（TCID50)。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 下述實(shí)施例僅對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。
[0021] 實(shí)施例1
[0022] 本實(shí)施例中鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽的篩選，包括以下步驟：
[0023] 1)常規(guī)方法制備DTMUV HN1株囊膜E蛋白
[0024] 根據(jù)GenBank發(fā)表的DTMUV HN1株E蛋白的基因序列（序列號(hào)JQ669731)，利用 DNAStar軟件分析，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物P1和P2,引物兩端分別加限制性酶切位點(diǎn)EcoR I 和Xba I及保護(hù)性堿基（Takara公司合成），下劃線部分為酶切位點(diǎn)。
[0025] 上游引物 P1 :5' -CCG GAATTC TTCAGCTGTCTGGGGATGCA-3'（如 SEQ ID N0:2,下劃 線部分為EcoR I酶切位點(diǎn)）；
[0026] 下游引物 P2 :5' -CGATCTAGA ATTGACATTTACTGCCAGG-3'（如 SEQ ID N0:3,下劃線 部分為Xba I酶切位點(diǎn)）。
[0027] 常規(guī)方法提取DTMUV HN1株RNA (病毒RNA提取試劑盒，南京Tiangen有限公司）， 通過(guò)常規(guī)反轉(zhuǎn)錄PCR獲取E蛋白的基因全長(zhǎng)序列（Invitrogen -步法RT-PCR試劑盒），將 獲取的E蛋白基因克隆入pMD18-T載體中，并進(jìn)行測(cè)序。將pMD18-T載體上的E蛋白基因 目的片段經(jīng)EcoR I與Xba I酶切后，克隆入pET32a載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-E，并 用EcoR I與Xba I雙酶切和PCR進(jìn)行鑒定，鑒定陽(yáng)性的質(zhì)粒即為重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-E， 送上海Invitrogen公司測(cè)序（見(jiàn)圖1)。
[0028] 重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a_E的誘導(dǎo)表達(dá)與純化
[0029] 采用CaCl2轉(zhuǎn)化法，將重組質(zhì)粒pET32a_E轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞 中，篩選陽(yáng)性克隆，即為含DTMUV HN1株E蛋白的基因的陽(yáng)性基因工程菌株。將陽(yáng)性基因工 程菌株于37°C培養(yǎng)，待A_值達(dá)到0. 5時(shí)（0. 4?0. 6均可），加 IPTG至終濃度為0. 8mM， 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。收集不同誘導(dǎo)時(shí)間表達(dá)的菌體，超聲波破碎，離心后分別取上清和沉淀進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，并以鴨抗DTMUV-1血清為一抗，HRP標(biāo)記的兔抗鴨IgG為二抗對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn) 行Western blot分析，最后用DAB顯色試劑盒顯色。將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液離心并收獲沉淀， 以洗滌液（5 mM咪唑，0. 5 M NaCl，20 mM Tris-HCl，pH 7. 9)重懸菌體后，經(jīng)超聲波裂解 后離心，將可溶性表達(dá)上清用蛋白質(zhì)Ni柱親和層析進(jìn)行純化，具體操作過(guò)程參照Novagen 公司His · bind purification kit說(shuō)明書(shū)，E蛋白經(jīng)鎳柱純化后，即獲得DTMUV HN1株E蛋 白。
[0030] 2)噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)的親和篩選
[0031] (1)包被純化的DTMUV HN1株E蛋白
[0032] 將上述基因工程表達(dá)的E蛋白以TBS稀釋為10 μ g/mL，取稀釋后的E蛋白包被酶 標(biāo)板，100 μ L/孔，放置濕盒中4°C過(guò)夜；次日傾棄包被液，加入含0. 05% Tween 20的TBST 洗滌3次（每次靜置3 min)，叩干，然后以含5 %脫脂奶粉的TBS按100 μ L/孔加入各孔， 置濕盒中37°C封閉2 h;傾棄封閉液，以含0.05% Tween 20的TBST溶液洗滌3次，叩干， 將包被好的酶標(biāo)板封口，于4°C保存待用。
[0033] (2)親和篩選
[0034] 以TBST稀釋原始文庫(kù)（購(gòu)于美國(guó)New England Biolabs，NEB公司）至1 X 10npfu/ mL，取稀釋后的文庫(kù)液100 μ L加入到預(yù)先包被E蛋白的酶標(biāo)板孔內(nèi)，放置濕盒中4°C過(guò)夜。 次日棄孔內(nèi)液，并用TBST清洗10次，向微孔中加入100yL 0. 2M Glycine-HCl(pH 2. 2)，于 室溫溫和搖動(dòng)l〇min，洗脫液吸入另一干凈微量離心管中，加入15yL 1M Tris-HCl(pH9. 1) 中和上述洗脫液。測(cè)定少量（?luL)洗脫物的滴度，剩余洗脫物加入到20mL ER2738 培養(yǎng)物中（菌體處于對(duì)數(shù)前期），37°C劇烈搖動(dòng)培養(yǎng)4. 5h。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入離心管中， 4°C 12,000rpm離心10min。上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，再離心。取80%上清轉(zhuǎn)入新管中， 加入1/6體積的PEG/NaCl，4°C沉淀過(guò)夜。次日，4°C 12, OOOrpm離心PEG沉淀15min。棄 上清，再短暫離心，棄去殘留上清。沉淀物重懸于lmL TBS中，懸液轉(zhuǎn)入微量離心管中，4°C 離心5min使殘余細(xì)胞沉淀。上清轉(zhuǎn)入另一新鮮微量離心管，用1/6體積的PEG/NaCl再沉 淀。冰上孵育30min(15?60min均可）。4°C離心10min，棄上清，再短暫離心，用微量移液 器吸棄殘余上清。沉淀物重懸于200yL TBS、0.02%NaN3中。離心lmin，沉淀任何殘余的 不溶物。上清轉(zhuǎn)入新的離心管中，即為第一輪擴(kuò)增后的噬菌體洗脫物。根據(jù)常規(guī)M13方法 用LB/IPTG/Xgal平板測(cè)定擴(kuò)增后洗脫物的滴度。將第一輪擴(kuò)增后的噬菌體液以TBS稀釋 為1 X 10npfu/mL，取100 μ L加入到預(yù)先包被E蛋白的酶標(biāo)板孔中進(jìn)行第二輪篩選，37°C溫 育2h，棄孔內(nèi)液，并用含0. 05% Tween 20的TBST溶液清洗10次，同上進(jìn)行篩選后噬菌體 的擴(kuò)增和滴度的測(cè)定，重復(fù)以上步驟進(jìn)行第三輪篩選。
[0035] 在篩選過(guò)程中，將每輪投入篩選的噬菌體量記為Input、洗脫得到的噬菌體量記為 Output,分析比較每輪產(chǎn)出/投入比（Input/Output)情況，來(lái)反映特異性結(jié)合噬菌體的富 集程度。經(jīng)過(guò)3輪篩選發(fā)現(xiàn)：淘選獲得的噬菌體越來(lái)越多，特異性越來(lái)越強(qiáng)，其中第三輪噬 菌體滴度為2. 3X 106pfu/mL。噬菌體產(chǎn)出投入比逐輪提高（見(jiàn)下表1)，表明具有特異性結(jié) 合作用的噬菌體顯示較好的富集效果。
[0036] 表1三輪親和篩選對(duì)噬菌體的富集
[0037]

【權(quán)利要求】
1. 鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽，其特征在于：所述的鴨坦 布蘇病毒為鴨坦布蘇病毒HN1株。
3. -種如權(quán)利要求1或2所述的鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽的應(yīng)用，其特征在于： 所述鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽在制備抗鴨坦布蘇病毒病的藥物或飼料添加劑中的 應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽的應(yīng)用，其特征在于：所述 鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽在制備抑制鴨坦布蘇病毒在鴨胚成纖維細(xì)胞增殖的藥物 或飼料添加劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A23K1/16GK104193805SQ201410361073
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月25日
【發(fā)明者】王臣, 李小康, 郭香玲, 汪洋, 牛明媚, 吳庭才 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)