鴨坦布蘇病毒囊膜e蛋白特異性結合肽及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結合肽及其應用，屬于動物病毒分子生物學【技術領域】。本發明通過噬菌體隨機12肽庫篩選得到鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結合肽，其氨基酸序列為：THRSWQGNSWYM。該特異性結合肽可抑制鴨坦布蘇病毒HN1株在鴨胚成纖維細胞的增殖，在不同濃度下均能顯著下調鴨坦布蘇病毒在鴨胚成纖維細胞中的病毒拷貝數，同時顯著降低鴨坦布蘇病毒在鴨胚成纖維細胞中的病毒滴度，而其本身對鴨胚成纖維細胞的增殖無明顯影響。鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結合肽在制備抗鴨坦布蘇病毒病的藥物或飼料添加劑中具有良好的應用前景，可用于鴨坦布蘇病毒病的防治。
【專利說明】鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結合肽及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結合肽，同時還涉及該特異性結 合肽的應用，屬于動物病毒分子生物學【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 近年來，中國南方爆發了一種新的鴨病毒性傳染病，主要引起鴨產蛋嚴重下降，該 病傳播迅速、涉及范圍廣，發病前期為持續高熱，發病后期出現一定比例的神經癥狀，表現 為癱瘓、翻滾、站立不穩及共濟失調等，有些病鴨甚至在數日內死亡。剖檢死亡鴨，多數呈現 脾臟和腎臟明顯腫大，蛋鴨表現為出血性卵巢炎。該病首先在江浙一帶爆發，隨后蔓延到福 建和安徽等地，之后在江西、山東、湖南、河南、河北相繼爆發。對于此病，國外尚未見報道。 國內研究人員對其病原進行了分離、形態學觀察、理化特性測定、RT-PCR檢測及序列分析， 現已確定該病病原為鴨坦布蘇病毒，故稱該病為鴨坦布蘇病毒病。該病發病率高、傳播迅 速，發病范圍極廣，已給養鴨業造成重大經濟損失。
[0003] 鴨坦布蘇病毒（Duck tembusu virus，DTMUV)是一種新型黃病毒，屬于黃病毒科不 分節段的單股正鏈RNA病毒，其病毒粒子呈球形，直徑約45?50nm，有囊膜和纖突，病毒約 由10990個核苷酸組成。該病毒對熱、脂溶劑和去氧膽酸鈉敏感，pH〈5或pH>10時便失去 感染活性，50°C以上加熱60min即被滅活。DTMUV能在鴨胚、雞胚、鴨胚成纖維細胞及Vero、 BHKX6/36等部分傳代細胞系上增殖。其病毒基因組由5'端、3'端的非編碼區和中間的一 個開放閱讀框組成，5'端的非編碼區長度為142nt，含I型m7GpppNp帽子結構，3'端非編 碼區長618nt，沒有poly (A)尾巴，開放閱讀框編碼由3410個氨基酸殘基構成的多聚蛋白 前體。前體蛋白在宿主信號肽酶和病毒絲氨酸蛋白酶的作用下被切割成3種結構蛋白（C、 prM 和 E)和 7 種非結構蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。
[0004] E蛋白是一種囊膜蛋白，編碼501個氨基酸，其氨基酸序列中存在高度保守區和變 異區。E蛋白位于成熟病毒顆粒表面，在病毒吸附受體、與宿主細胞膜融合以及病毒組裝過 程中具有重要的作用，且含有多種抗原表位，這些表位與病毒識別宿主細胞膜受體、吸附和 進入細胞，病毒的致病性和誘導免疫應答等密切相關，在病毒感染中起重要作用。另外，E蛋 白還具有較好的免疫原性和反應原性，是宿主抗感染免疫的主要保護性抗原，也是檢測該 病毒特異性抗體的理想靶抗原。
[0005] 噬菌體展示技術是近年來興起的一項研究蛋白質分子間相互作用的有效手段，具 有快捷、高效、表型和基因型一致等特點，近年來被廣泛應用于肽類藥物、抑制肽、抗原模擬 表位的篩選等研究領域。利用噬菌體展示技術篩選鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結合的 多肽，并研究該多肽對DTMUV在鴨胚成纖維細胞增殖方面的影響，可為DTMUV的防治提供一 個新的途徑，具有較好的應用前景。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的是提供一種鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結合肽。
[0007] 同時，本發明還提供一種鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結合肽的應用。
[0008] 為了實現以上目的，本發明所采用的技術方案是：
[0009] 鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結合肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0010] 所述的鴨坦布蘇病毒為鴨坦布蘇病毒HN1株。
[0011] 鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結合肽的應用，具體為特異性結合肽在制備抗鴨 坦布蘇病毒病（抑制鴨坦布蘇病毒增殖，如抑制鴨坦布蘇病毒在鴨胚成纖維細胞增殖）的 藥物或飼料添加劑中的應用。
[0012] 本發明的有益效果：
[0013] 本發明通過基因工程方法獲得DTMUV HN1株E蛋白，并以DTMUV HN1株E蛋白作 為靶標，利用噬菌體隨機12肽庫篩選得到鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結合肽，其氨基 酸序列為：THRSWQGNSWYM。該特異性結合肽可抑制鴨坦布蘇病毒HN1株在鴨胚成纖維細胞 的增殖。標準MTT法檢測E蛋白特異性結合肽對鴨胚成纖維細胞增殖的影響，結果顯示，多 肽本身對鴨胚成纖維細胞的增殖無明顯影響。熒光定量PCR和TCID50檢測E蛋白特異性 結合肽對鴨坦布蘇病毒在鴨胚成纖維細胞增殖方面的影響，結果顯示，該多肽在不同濃度 (0. 02 μ g/mL、0. 2 μ g/mL、2 μ g/mL、20 μ g/mL)下均能顯著下調鴨坦布蘇病毒在鴨胚成纖維 細胞中的病毒拷貝數，同時顯著降低鴨坦布蘇病毒在鴨胚成纖維細胞中的病毒滴度。結果 表明，E蛋白特異性結合肽能抑制鴨坦布蘇病毒在鴨胚成纖維細胞的增殖，在鴨坦布蘇病毒 病的防治中具有良好的應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1為本發明實施例1中重組表達質粒pET32a-E構建示意圖；
[0015] 圖2為本發明實施例1中ELISA檢測噬菌體展示肽對靶分子的結合活性；
[0016] 圖3為實施例1中噬菌體陽性克隆競爭抑制試驗結果；
[0017] 圖4為試驗例中DRMUV HN1株E蛋白特異性結合肽對鴨胚成纖維細胞增殖的影 響；
[0018] 圖5為試驗例中特異性結合肽對DRMUV HN1株在鴨胚成纖維細胞增殖的影響 (Real time PCR)；
[0019] 圖6為試驗例中特異性結合肽對DRMUV HN1株在鴨胚成纖維細胞增殖的影響 (TCID50)。

【具體實施方式】
[0020] 下述實施例僅對本發明作進一步詳細說明，但不構成對本發明的任何限制。
[0021] 實施例1
[0022] 本實施例中鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結合肽的篩選，包括以下步驟：
[0023] 1)常規方法制備DTMUV HN1株囊膜E蛋白
[0024] (1)重組表達質粒pET32a_E的構建
[0025] 根據GenBank發表的DTMUV HN1株E蛋白的基因序列（序列號：JQ669731)，利用 DNAStar軟件分析，設計一對特異性引物P1和P2,引物兩端分別加限制性酶切位點EcoR I 和Xba I及保護性堿基（Takara公司合成），下劃線部分為酶切位點。
[0026] 上游引物 PI :5' -CCG GAATTC TTCAGCTGTCTGGGGATGCA-3'（如 SEQ ID NO: 2,下劃 線部分為EcoR I酶切位點）；
[0027] 下游引物 P2 :5' -CGATCTAGA ATTGACATTTACTGCCAGG-3'（如 SEQ ID NO: 3,下劃線 部分為Xba I酶切位點）。
[0028] 常規方法提取DTMUV HN1株RNA (病毒RNA提取試劑盒，南京Tiangen有限公司）， 通過常規反轉錄PCR獲取E蛋白的基因全長序列（Invitrogen -步法RT-PCR試劑盒），將 獲取的E蛋白基因克隆入pMD18-T載體中，并進行測序。將pMD18-T載體上的E蛋白基因 目的片段經EcoR I與Xba I酶切后，克隆入pET32a載體，構建重組表達質粒pET32a-E，并 用EcoR I與Xba I雙酶切和PCR進行鑒定，鑒定陽性的質粒即為重組表達質粒pET32a-E， 送上海Invitrogen公司測序（見圖1)。
[0029] (2)重組表達質粒pET32a_E的誘導表達與純化
[0030] 采用CaCl2轉化法，將重組質粒pET32a-E轉化入大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞 中，篩選陽性克隆，即為含DTMUV HN1株E蛋白的基因的陽性基因工程菌株。將陽性基因工 程菌株于37°C培養，待A_值達到0. 5時（0. 4?0. 6均可），加 IPTG至終濃度為0. 8mM， 進行誘導表達。收集不同誘導時間表達的菌體，超聲波破碎，離心后分別取上清和沉淀進行 SDS-PAGE電泳，并以鴨抗DTMUV-1血清為一抗，HRP標記的兔抗鴨IgG為二抗對表達產物進 行Western blot分析，最后用DAB顯色試劑盒顯色。將誘導表達的菌液離心并收獲沉淀， 以洗滌液（5mM咪唑，0. 5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH7. 9)重懸菌體后，經超聲波裂解后離 心，將可溶性表達上清用蛋白質Ni柱親和層析進行純化，具體操作過程參照Novagen公司 His .bind purification kit說明書，E蛋白經鎳柱純化后，即獲得DTMUV HN1株E蛋白。
[0031] 2)噬菌體隨機12肽庫的親和篩選
[0032] (1)包被純化的DTMUV HN1株E蛋白
[0033] 將上述基因工程表達的E蛋白以TBS稀釋為10 μ g/mL，取稀釋后的E蛋白包被酶 標板，100 μ L/孔，放置濕盒中4°C過夜；次日傾棄包被液，加入含0. 05 % Tween20的TBST洗 滌3次（每次靜置3min)，叩干，然后以含5 %脫脂奶粉的TBS按100 μ L/孔加入各孔，置濕 盒中37°C封閉2h ;傾棄封閉液，以含0. 05% Tween20的TBST溶液洗滌3次，叩干，將包被 好的酶標板封口，于4°C保存待用。
[0034] (2)親和篩選
[0035] 以TBST稀釋原始文庫（購于美國New England Biolabs，NEB公司）至1 X 10npfu/ mL，取稀釋后的文庫液100 μ L加入到預先包被E蛋白的酶標板孔內，放置濕盒中4°C過夜。 次日棄孔內液，并用TBST清洗10次，向微孔中加入100 μ L0. 2M Glycine-HCl (pH2. 2)，于室 溫溫和搖動l〇min，洗脫液吸入另一干凈微量離心管中，加入15yLlM Tris-HCl(pH9. 1)中 和上述洗脫液。測定少量（?1 μ L)洗脫物的滴度，剩余洗脫物加入到20mL ER2738培養物 中（菌體處于對數前期），37°C劇烈搖動培養4. 5h。將培養物轉入離心管中，4°C 12,000rpm 離心10min。上清液轉入另一離心管中，再離心。取80%上清轉入新管中，加入1/6體積 的PEG/NaCl，4°C沉淀過夜。次日，4°C 12,000rpm離心PEG沉淀15min。棄上清，再短暫離 心，棄去殘留上清。沉淀物重懸于lmL TBS中，懸液轉入微量離心管中，4°C離心5min使殘 余細胞沉淀。上清轉入另一新鮮微量離心管，用1/6體積的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育 30min(15?60min均可）。4°C離心10min，棄上清，再短暫離心，用微量移液器吸棄殘余上 清。沉淀物重懸于200 μ L TBS、0. 02% NaN3中。離心lmin，沉淀任何殘余的不溶物。上清轉 入新的離心管中，即為第一輪擴增后的噬菌體洗脫物。根據常規M13方法用LB/IPTG/Xgal 平板測定擴增后洗脫物的滴度。將第一輪擴增后的噬菌體液以TBS稀釋為IX 10npfu/mL， 取100 μ L加入到預先包被E蛋白的酶標板孔中進行第二輪篩選，37°C溫育2h，棄孔內液， 并用含0. 05% Tween20的TBST溶液清洗10次，同上進行篩選后噬菌體的擴增和滴度的測 定，重復以上步驟進行第三輪篩選。
[0036] 在篩選過程中，將每輪投入篩選的噬菌體量記為Input、洗脫得到的噬菌體量記為 Output,分析比較每輪產出/投入比（Input/Output)情況，來反映特異性結合噬菌體的富 集程度。經過3輪篩選發現：淘選獲得的噬菌體越來越多，特異性越來越強，其中第三輪噬 菌體滴度為2. 3X 106pfu/mL。噬菌體產出投入比逐輪提高（見下表1)，表明具有特異性結 合作用的噬菌體顯示較好的富集效果。
[0037] 表1三輪親和篩選對噬菌體的富集
[0038]

【權利要求】
1. 鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結合肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID N0:1 所示。
2. 根據權利要求1所述的鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結合肽，其特征在于：所述 的鴨坦布蘇病毒為鴨坦布蘇病毒HN1株。
3. -種如權利要求1或2所述的鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結合肽的應用，其特 征在于：所述鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結合肽在制備抗鴨坦布蘇病毒病的藥物或飼 料添加劑中的應用。
4. 根據權利要求3所述的鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結合肽的應用，其特征在于： 所述鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白特異性結合肽在制備抑制鴨坦布蘇病毒在鴨胚成纖維細胞 增殖的藥物或飼料添加劑中的應用。
【文檔編號】A61P35/00GK104193804SQ201410361045
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月25日 優先權日:2014年7月25日
【發明者】王臣, 張才, 何雷, 牛明媚, 張春杰 申請人:河南科技大學