桑樹休眠芽段的超低溫保存及嫁接復活方法
【專利摘要】本發明涉及植物種質資源保護領域，特別是提供一種桑樹休眠芽段的超低溫保存及嫁接復活方法，包括1)獲取休眠枝條；2)剪成休眠芽段；3)干燥；4)密封；5)梯度降溫；6)液氮保存；(7)化凍；8)回濕；9)嫁接復活。本發明的方法是一種利用干燥-梯度降溫冷凍法進行桑樹休眠芽段的超低溫保存及嫁接復活方法。將桑樹休眠芽段進行干燥至含水量20％-40％，經緩慢逐級降溫處理、凍存、化凍、回濕和嫁接復活等步驟，獲得較高存活率。采用本發明提供的方法，桑樹休眠芽段超低溫保存后平均存活率最高可達95％。本發明提供的桑樹休眠芽段的超低溫保存方法程序簡單，易于操作，凍存效果好，是桑樹種質資源離體長期保存的一條有效途徑。
【專利說明】桑樹休眠芽段的超低溫保存及嫁接復活方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及植物種質資源保護領域，特別是涉及一種桑樹休眠芽段的超低溫保存 及嫁接復活方法。

【背景技術】
[0002] 桑樹為雙子葉，桑科，桑屬（Morus alba L.)多年生木本植物（落葉喬木或灌木）。 具有極高的經濟價值、藥用價值和園林觀賞價值。桑木木材堅硬，可以用來制造家具、樂器、 雕刻等，還可做弓（桑弧）、造紙、制造農業生產工具，如桑杈、車轅等。枯枝可以作為干柴； 樹皮可以作為藥材或造紙；桑葉為養蠶的主要飼料，亦作藥用，并可作土農藥。桑椹不但可 以充饑，還可以釀酒，稱桑子酒。桑樹樹冠寬闊，樹葉茂密，秋季葉色變黃，頗為美觀，且能抗 煙塵及有毒氣體，適于城市、工礦區及農村四旁綠化。我國是桑樹的重要起源中心之一，桑 樹遍布全國各地，經長期的自然選擇和人工選擇，形成了多種多樣的桑樹種質資源，具有豐 富的桑樹遺傳多樣性。我國目前收集保存的桑樹種質分屬12個桑種，3個變種。桑樹在我 國栽培范圍廣泛，東北自哈爾濱以南；西北從內蒙古南部至新疆、青海、甘肅、陜西；南至廣 東、廣西，東至臺灣；西至四川、云南；長江中下游各地栽培最多。
[0003] 桑樹種質資源一般進行田間、盆和溫室栽培保存。但栽培保存不僅占用耕地，并且 栽培管理需耗費人力物力，還面臨干旱、洪澇、低溫、熱害、病蟲害等自然災害的影響而導致 種質資源丟失的危險。試管苗組織培養保存因多次繼代，耗費人力物力，易引起遺傳性狀變 異或污染的危險。超低溫保存被認為是這類植物種質資源目前安全、有效、成本低廉的長期 保存重要方法。
[0004] 現已證明，植物材料經超低溫保存后，仍能在適宜的條件下復活，再生出新的植 株，并保持其遺傳穩定性。它避免了田間保存易受自然災害影響而導致種質變異或毀滅，以 及試管苗組織培養保存中因多次繼代引起遺傳性狀變異或污染的危險。
[0005] 超低溫保存方法已發展了很多種。由于植物的繁殖特性、種屬、基因型、抗凍性不 同，適宜進行超低溫保存的種質外植體材料類型也有所不同。迄今為止，國際上尚未建立起 具有普適性的超低溫保存方法，這也是超低溫保存技術實際應用中的一個主要瓶頸。


【發明內容】

[0006] 為了更好地保存桑樹種質資源，本發明的目的是提供一種桑樹的超低溫保存及嫁 接復活方法。
[0007] 為了實現本發明目的，本發明的一種桑樹休眠芽段的超低溫保存及嫁接復活方 法，包括如下步驟：
[0008] 1)獲取休眠枝條；2)剪成休眠芽段；3)干燥；4)密封；5)梯度降溫；6)液氮保存； (7)化凍；8)回濕；9)嫁接復活。
[0009] 其中，步驟1)所述獲取休眠枝條，為冬天從桑樹上剪取帶有健康休眠芽的一年生 枝條。具體為：冬天從田間生長的桑樹上剪取帶有健康休眠芽的一年生新枝條，其上休眠芽 處于深度休眠期，沒有被打破休眠。
[0010] 其中，步驟2)所述剪成休眠芽段，為將步驟1)所獲休眠枝條的中部條段剪成長 4-30cm長的節段，每段帶1-3個芽。優選剪成長4-5cm長的節段，每段帶2個芽。
[0011] 其中，步驟3)所述干燥為使休眠芽段含水量降低到質量百分含量20% -40%。處 理具體為：將休眠芽段用尼龍網袋裝好后進行緩慢干燥3-200小時。
[0012] 其中，步驟4)所述密封為：將干燥后的休眠芽段用鋁箔袋或聚丙烯冷凍管密封。
[0013] 其中，步驟5)所述梯度降溫，為將步驟4)密封好的休眠芽段順序以以下溫度和時 長降溫：5°C 1 天，0°C 1 天，_5°C 1 天，-10°C 1 天，_15°C 1 天，_20°C 1 天，_30°C 2 天。
[0014] 其中，步驟6)所述液氮保存為將步驟5)梯度降溫后的休眠芽段投入液氮或液氮 蒸汽中保存。
[0015] 其中，步驟7)所述化凍為室溫化凍，具體為室溫化凍1-4小時。
[0016] 其中，步驟8)所述回濕為將化凍后的休眠芽段放在濕潤的沙土加蛭石或泥炭加 蛭石中回濕24-48小時。
[0017] 其中，步驟9)所述嫁接復活為：從回濕后的休眠芽段上削下1. 5-2. 5cm長、帶有1 個休眠芽的芽片，嫁接到砧木條上；每根砧木條嫁接1-2個休眠芽，嫁接1-2周后在接芽上 方1-2厘米處剪去上部砧木。
[0018] 本發明還提供所述桑樹休眠芽段的超低溫保存及嫁接復活方法在桑樹種質資源 保護中的應用。
[0019] 其中，所述桑樹的品種優選"湖桑32號"、"育71-1"或"中桑9703"。
[0020] 本發明所述桑樹的超低溫保存及嫁接復活方法是一種利用干燥-梯度降溫冷凍 法進行桑樹休眠芽段的超低溫保存及嫁接復活方法。將桑樹休眠芽段進行干燥至含水量 20%-40%，經緩慢逐級降溫處理、凍存、化凍、回濕和嫁接復活等步驟，獲得較高存活率。采 用本發明提供的方法，桑樹休眠芽段超低溫保存后平均存活率最高可達95%。本發明提供 的桑樹休眠芽段的超低溫保存方法程序簡單，易于操作，凍存效果好，是桑樹種質資源離體 長期保存的一條有效途徑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為實施例1中從田間取回的桑樹休眠枝條的照片。
[0022] 圖2為實施例1中剪成的桑樹休眠芽段的照片。
[0023] 圖3為實施例1中桑樹休眠芽段進行干燥處理的照片。
[0024] 圖4為實施例1中休眠芽段密封包裝的照片。
[0025] 圖5為實施例1中超低溫保存后嫁接復活芽及成活枝條的照片。

【具體實施方式】
[0026] 以下實施進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本 發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所做的修改或替換，均屬于本發明的 范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。 [0027] 實施例1不同品種休眠芽段干燥處理時間、含水量與超低溫保存成活率的關系 [0028] 實驗材料：實驗所用桑樹品種為"湖桑32號"、"育71-1"和"中桑9703"。
[0029] 實驗方法具體步驟如下：
[0030] 獲取休眠枝條：2013年12月27日，從中國農業科學院蠶業研究所的"國家桑樹種 質圃"生長健康的桑樹上剪取帶有正常休眠芽的一年生新枝條，其上休眠芽處于深度休眠 期，沒有被打破休眠，即進入持續休眠后當地氣溫沒有超過12°C。從田間取回的桑樹休眠枝 條的照片見圖1。
[0031] 剪成休眠芽段：選取休眠枝條的中部條段，剪成帶有2個芽，4-5cm長的節段。剪 成的桑樹休眠芽段的照片見圖2。
[0032] 干燥：將休眠芽段用尼龍網袋裝好后進行緩慢干燥（室溫）0-165小時，含水量在 質量百分含量17. 70%-47. 34%。通過減重法測定不同干燥時間處理節段的含水量。4次 重復，每次重復15個芽段。桑樹休眠芽段進行干燥處理的照片見圖3。
[0033] 密封：將干燥處理后的芽段用鋁箔袋進行密封包裝，休眠芽段密封包裝的照片見 圖4。以聚丙烯冷凍管密封也能取得相同效果。
[0034] 梯度降溫處理：將密封包裝后的節段順序置于以下溫度不同時間，即5°C 1天， 0°C 1 天，-5°c 1 天，-10°c 1 天，-15°c 1 天，-20°c 1 天，-30°c 2 天。
[0035] 液氮保存：從_30°C取出后直接投入到液氮氣相中保存。
[0036] 化凍：2014年3月22-29日，將裝有干燥芽段的鋁箔袋從液氮蒸汽中取出后放室 溫化凍4小時。
[0037] 回濕：將化凍處理后的芽段放在濕潤的泥炭+蛭石（兩者的混合比例為體積比 1:2,用體積比1:2的沙土 +蛭石替換能實現同樣的效果）中回濕24小時。
[0038] 嫁接復活：從回濕后的芽段上削下1. 5-2. 5cm長，帶有1個休眠芽的芽片，嫁接到 砧木條上。每根砧木條嫁接1-2個休眠芽。嫁接1周后在接芽上方1-2厘米處剪去上部砧 木。超低溫保存后嫁接復活芽及成活枝條的照片見圖5。超低溫保存結果如表1所示。
[0039] 表1休眠芽段干燥處理時間、含水量與超低溫保存成活率的關系
[0040]

【權利要求】
1. 一種桑樹休眠芽段的超低溫保存及嫁接復活方法，其特征在于，包括如下步驟： 1)獲取休眠枝條；2)剪成休眠芽段；3)干燥；4)密封；5)梯度降溫；6)液氮保存；（7) 化凍；8)回濕；9)嫁接復活。
2. 根據權利要求1所述的桑樹休眠芽段的超低溫保存及嫁接復活方法，其特征在于， 步驟1)所述獲取休眠枝條，為冬天從桑樹上剪取帶有健康休眠芽的一年生枝條。
3. 根據權利要求1所述的桑樹休眠芽段的超低溫保存及嫁接復活方法，其特征在于， 步驟2)所述剪成休眠芽段，為將步驟1)所獲休眠枝條的中部條段剪成長4-30cm長的節 段，每段帶1 _3個芽。
4. 根據權利要求1所述的桑樹休眠芽段的超低溫保存及嫁接復活方法，其特征在于， 步驟3)所述干燥為使休眠芽段含水量降低到質量百分含量20% -40%。
5. 根據權利要求1所述的桑樹休眠芽段的超低溫保存及嫁接復活方法，其特征在于， 步驟4)所述密封為：將干燥后的休眠芽段用鋁箔袋或聚丙烯冷凍管密封。
6. 根據權利要求1所述的桑樹休眠芽段的超低溫保存及嫁接復活方法，其特征在于， 步驟5)所述梯度降溫，為將步驟4)密封好的休眠芽段順序以以下溫度和時長降溫：5°C 1 天，0°C 1 天，_5°C 1 天，-10°C 1 天，_15°C 1 天，_20°C 1 天，_30°C 2 天。
7. 根據權利要求1所述的桑樹休眠芽段的超低溫保存及嫁接復活方法，其特征在 于，步驟8)所述回濕為將化凍后的休眠芽段放在濕潤的沙土加蛭石或泥炭加蛭石中回濕 24-48小時。
8. 根據權利要求1所述的桑樹休眠芽段的超低溫保存及嫁接復活方法，其特征在于， 步驟9)所述嫁接復活為：從回濕后的休眠芽段上削下1. 5-2. 5cm長、帶有1個休眠芽的芽 片，嫁接到砧木條上；每根砧木條嫁接1-2個休眠芽，嫁接1-2周后在接芽上方1-2厘米處 剪去上部砧木。
9. 權利要求1-8任一項所述桑樹休眠芽段的超低溫保存及嫁接復活方法在桑樹種質 資源保護中的應用。
10. 根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述桑樹的品種優選"湖桑32號"、"育 71-1" 或"中桑 9703"。
【文檔編號】A01G1/06GK104145722SQ201410366753
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月29日 優先權日:2014年7月29日
【發明者】陳曉玲, 張金梅, 盧新雄, 辛霞, 尹廣鹍, 何娟娟 申請人:中國農業科學院作物科學研究所