一個高產藥用天然產物的硬紫草轉LeEIL-1基因毛狀根株系的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一個能高產紫草藥用天然產物(紫草寧及其衍生物)的硬紫草的轉基因毛狀根株系。該株系通過構建一個硬紫草乙烯信號傳導途徑中的關鍵轉錄因子基因(LeEIL-1)的植物過表達載體，然后將該載體轉入發根農桿菌ATCC15834后，侵染硬紫草的無菌苗而獲得。該轉基因株系所產紫草寧及其衍生物的含量是直接用ATCC15834侵染硬紫草無菌苗所獲得的毛狀根株系的2.81倍。同時，該株系易于繁殖、生長迅速。本發明不僅可有效解決我國野外硬紫草資源日益短缺、人工栽培周期長、受氣候及地理條件等因素制約等問題，并且可高效大量生產硬紫草藥用天然產物。該高產株系將為利用硬紫草毛狀根工廠化生產硬紫草藥用天然產物提供材料支撐，具有廣闊的開發應用前景。
【專利說明】一個高產藥用天然產物的硬紫草轉LeE I L-1基因毛狀根株 系

【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物基因工程領域，涉及將攜帶目的基因的植物表達載體轉入發根農 桿菌，然后再侵染硬紫草無菌苗而誘導出轉基因的毛狀根株系。

【背景技術】
[0002] 硬紫草（Lithospermum erythrorhizon sieb. et zucc)是我國一種重要的藥用 植物，其根部可合成紫紅色的萘醌類藥用天然產物--紫草寧及其衍生物（以下簡稱紫草 寧），這類物質具有抗菌、消炎、活血等功效，而且還是一種珍貴的天然色素，可以廣泛用于 食品、高級化妝品、日化產品與塑料制品的著色等 [η]。近年來國內外的研究還發現紫草 寧通過活化Caspase-3和抑制拓撲異構酶活性來誘導癌細胞凋亡，被認為是繼喜樹堿、紫 杉醇之后又一類極具潛力的天然抗菌消炎、抗腫瘤、抑制HIV病毒等多種藥理活性的藥物
[4-6] 〇
[0003] 在我國有新疆紫草、東北硬紫草、內蒙紫草、滇紫草、廣西紫草等分布于相應地區。 近年來，隨著東北長白山脈及內蒙古草原地帶的對人為過度開發利用及放牧，以及自然生 態環境日漸惡化，作為重要紫草種類的硬紫草，其野生紫草資源日趨枯竭。
[0004] 隨著現代生物技術的發展，采用生物工程學手段生產人類所需的紫草寧，成為一 種非常重要的替代手段。上世紀70年代，日本即已成功利用兩階段培養法，即在光照條件 下B5固體培養基上繁殖紫草細胞，然后在黑暗條件下利用M9液體生產培養基中培養紫草 細胞進行工業化生產紫草寧，紫草也從而成為世界上第一個采用細胞培養體系來商業化生 產藥用天然產物的藥用植物 [7]。但在實踐過程中發現，用細胞生產紫草寧存在誘導愈傷細 胞困難、細胞易于老化褐化、紫草寧產量不高、產量不穩定、夏季難產或不產紫草寧等諸多 問題。
[0005] 發根農桿菌是在植物基因工程中廣泛應用的一種侵染性很強的根瘤菌科農桿菌 屬革蘭氏陰性菌，其攜帶的Ri質粒能有效侵染絕大多數雙子葉植物，少數單子葉植物以及 個別裸子植物，誘發植物產生形狀如根系的發根即毛狀根（hairy root)。由于發根農桿菌 轉化的毛狀根具有生長速度快、分支多，能夠持續合成次生代謝產物，獲得的次生代謝產物 量高且穩定、不需要添加外源植物激素等特點，因此可作為生產和研究植物次生代謝物質 的生物反應器；同時，由于發根農桿菌攜帶的Ri質粒能將外源基因整合到寄主染色體、其 誘導產生的毛狀根易獲得再生植株等優點，因此，建立特定植物的轉基因毛狀根體系，在定 向分子育種方面具有廣泛應用前景。近年來利用發根農桿菌已轉化大約160多種植物，在 40多種植物建立了毛狀根培養體系，特別是一些藥用植物建立了毛狀根轉基因體系，極大 地方便了藥用天然產物生產及遺傳育種研究。
[0006] 紫草寧的合成受到多種物理和化學因素的影響，如光、無機鹽離子、植物激素（乙 烯和茉莉酸等）[8_1(1]。乙烯是一種能調控植物生長發育、抗逆境脅迫反應等多個方面的氣態 類激素，通過改變乙烯濃度，或者改變植物乙烯信號傳導途徑中關鍵靶標基因的表達，可以 改變植物對天然產物的合成調控，如改變煙草ERF189及ERF163表達，可直接促進煙草生物 堿的合成[11];研究表明，乙烯同樣參與紫草寧的合成調控[12]。
[0007] 紫草的 LeEIL-1 (L. erythrorhizon EIN3_like protein 1)基因編碼 EIN3 轉錄因 子家族蛋白LeEIL-1。EIN3/EIL1是乙烯信號傳導途徑中的關鍵轉錄因子，在乙烯介導的植 物生長發育及代謝調控中起重要作用。紫草細胞從B5轉入M9中后，LeEIL-Ι受誘導表達， 并且在紫草根部（紫草寧合成的特異性部位）高表達，推測該基因參與乙烯介導的對紫草 寧的合成調控 [13]。
[0008] 通過轉基因技術將紫草本身的LeEIL-Ι基因轉入紫草中過表達，改變紫草細胞中 內源乙烯對紫草寧的合成調控，從中篩選出高產藥用天然產物的硬紫草轉基因毛狀根株 系，在理論上是完全可行的。
[0009] 通過轉基因技術獲得高產藥用天然產物的紫草毛狀根株系，不僅在系統研究紫草 藥用天然產物生物合成途徑及其分子調控機制方面具有重要的理論意義，并在商業化生產 紫草藥用天然產物方面具有非常重要的應用前景和價值。盡管目前國內外有利用毛狀根為 材料對紫草寧合成調控進行的相關研究，但并無將紫草EIN3/EIL1家族蛋白的相關基因轉 入發根農桿菌，誘導出能高效合成紫草藥用天然產物的紫草轉基因毛狀根并藉此提高紫草 寧合成的相關報道。


【發明內容】

[0010] 本發明需要解決的問題是通過轉基因技術獲得一個高產藥用天然產物的硬紫草 轉基因毛狀根株系，主要是通過將所選擇的目的基因（硬紫草中編碼EIN3轉錄因子家族蛋 白LeEIL-Ι的基因 LeEIL-Ι)轉入發根農桿菌，然后侵染硬紫草無菌苗，誘導出含目的基因 的硬紫草毛狀根，對獲得的轉基因毛狀根擴大培養并進行分子鑒定和藥用天然產物含量檢 測。
[0011] 本發明的技術方案包括如下步驟：
[0012] (1)硬紫草無菌苗培養：選取飽滿的硬紫草種子，清洗后置于4°C環境中培養，直 至種子發芽；挑取剛發芽的種子，用6%的次氯酸鈉消毒后，無菌水洗干凈；置于MS培養基 培養一定數量的紫草無菌苗。一個月后，當紫草無菌苗生長到一定高度后作為誘導毛狀根 的外植體。
[0013] (2)轉基因侵染菌液制備：高保真酶擴增目的基因 LeEIL-Ι，將獲得的目的片段與 真核表達載體pBI121-eGFP(真核表達載體pBI121中插入增強型綠色熒光蛋白基因 eGFP 序列，代替了 PBI121中的標記基因 GUS，以方便后續轉基因毛狀根的檢測驗證）連接，將連 接產物用凍融法轉化發根農桿菌ATCC15834感受態細胞；挑取陽性克隆，用YEB液體培養基 擴增至0D600 = 0. 5時，添加 AS (乙酰丁香酮），作為轉基因侵染菌液。
[0014] (3)針刺莖節法誘導硬紫草轉基因毛狀根：用接種針蘸上述活化的具有侵染特性 的轉基因菌液，用針尖穿刺紫草無菌苗的莖節處2-3次；將侵染的無菌苗轉移到MS固體培 養基上于26°C黑暗培養。10-15天左右即可發現侵染部位出現白色突起，2天后在侵染部位 的白色突起長出絨毛狀根系，然后長出一條或多條毛狀根。
[0015] (4)硬紫草轉基因毛狀根的培養：剪取長度約1cm的毛狀根，轉入MS+500mg/L頭 孢霉素的固體除菌培養基，再過一星期轉入MS+250mg/L頭孢霉素除菌培養基，直至除去殘 留的發根農桿菌；將徹底除菌的毛狀根轉入B5固體培養基擴大培養；將固體擴大培養的毛 狀根轉入B5液體培養基擴大培養。
[0016] (5)轉基因毛狀根分子鑒定：分為分子鑒定和熒光鑒定2個部分。取一定數量毛 狀根，PCR方法檢測農桿菌Ri質粒中RolC基因，判斷是否為毛狀根，再檢測綠色熒光蛋白， 驗證是否是硬紫草轉基因毛狀根。
[0017] (6)紫草寧合成及測定：將鑒定的轉基因紫草毛狀根轉入M9液體培養基，置于 26°C黑暗培養，一周后紫草寧含量即可達到很高濃度；用石油醚浸泡紫草毛狀根及含有紫 草寧的M9液體，提取紫草寧，紫外分光光度計測定紫草寧含量，以相同生長條件下的野生 型紫草毛狀根（只用不含外源基因的ATCC15834侵染而獲得的硬紫草毛狀根）為對照，計 算轉基因毛狀根中紫草寧含量變化。
[0018] 本發明與現有技術相比，其有益效果是：
[0019] 如前所述，野生紫草資源的日益匱乏及缺乏真正高效的人工合成紫草寧的培養體 系，已經成為紫草寧藥用研究及商業化大量應用的一個制約因素。至今未見通過誘導出轉 入LeEIL-Ι基因的毛狀根，并藉此提高紫草寧合成產量的相關文獻報道。本發明首次將一 個紫草EIN3/EIL1家族蛋白的關鍵轉錄因子基因 LeEIL-Ι轉入植物表達載體，將該載體轉 入發根農桿菌后再轉入紫草無菌苗，誘導出紫草轉基因毛狀根；獲得的硬紫草轉基因毛狀 根中紫草寧含量較野生型紫草毛狀根大大提高。該方法可克服紫草愈傷細胞誘導、培養困 難，細胞易于老化褐化、紫草寧產量不高、產量不穩定、夏季難產或不產紫草寧等諸多問題； 解決了利用愈傷細胞進行遺傳轉化存在的周期長，轉化效率偏低等問題，轉基因毛狀根誘 導和繁殖不受外界環境、季節和紫草花性等因素制約，大大提高紫草轉基因效率；轉入的 LeEIL-Ι基因有助于紫草乙烯信號傳導機制及藥用天然產物合成的分子調控機制研究，對 紫草功能基因鑒定和研究及分子育種具有重要指導意義，對其他轉基因困難的木本植物提 供了可靠的借鑒方法；獲得的轉基因毛狀根紫草寧高產株系具有廣闊的開發應用前景和商 業價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1針刺莖節法誘導出的轉LeEIL-Ι基因的硬紫草毛狀根
[0021] 圖2轉基因毛狀根在B5固體培養基培養
[0022] 圖3轉基因毛狀根在B5液體培養基擴大培養
[0023] 圖4轉LeEIL-Ι基因硬紫草毛狀根RolC基因檢測
[0024] 圖5轉LeEIL-Ι基因硬紫草毛狀根熒光檢測
[0025] 圖6轉基因毛狀根在M9液體培養基培養
[0026] 圖7轉基因毛狀根紫草寧及其衍生物含量測定及比較

【具體實施方式】
[0027] 實施例1、轉硬紫草LeEIL-Ι基因毛狀根的誘導
[0028] (1)硬紫草無菌苗培養：選取飽滿的硬紫草種子，無菌水清洗后置于4°C環境中黑 暗培養1-2個月，直至種子發芽；挑取剛發芽的種子，清水洗干凈；用6 %的次氯酸鈉浸泡 5min，再用無菌水洗幾次；置于MS基本培養基，26°C _28°C光照培養，獲得一定數量的紫草 無菌苗。一個月后，當紫草無菌苗生長到8-lOcm后，作為誘導毛狀根的外植體。
[0029] (2)轉基因侵染菌液制備：將市售的pBI121載體中的GUS基因片段用增強型綠色 熒光蛋白eGFP基因片段代替，改造成便于轉基因檢測的植物真核表達載體pBI121-eGFP ; 根據 GenBank 公布的紫草 LeEIL-1 序列（FJ890314)設計引物 LeEIL-l-〇E-F :5' -CTAGTCT AGAATGATGATGTTCGAGGAGATGGGGT-3; ；LeEIL-1-〇E-R ： 5; -CTAGTCTAGAAAACCAGATGGATTCGT CCTGCTTT-3'，高保真酶擴增目的片段；將獲得的目的片段切膠回收，并與pBI121-eGFP載 體連接，構建pBI 121-LeEIL-l-eGFP質粒；將pBI 121-LeEIL-l-eGFP質粒用凍融法轉化發根 農桿菌ATCC15834感受態細胞；挑取陽性克隆，轉入YEB液體培養基，在26-28°C，180rpm的 搖床中擴增至0D600 = 0. 5時，添加200 μ L/L的AS，作為轉基因侵染菌液。
[0030] (3)針刺莖節法誘導硬紫草轉基因毛狀根：用接種針蘸上述活化的具有侵染特性 的轉基因菌液，用針尖穿刺紫草無菌苗的莖節處，針尖每浸蘸菌液一次，刺莖節處一下，每 株共穿刺2-3次；將侵染的無菌苗轉移到MS固體培養基上于26°C黑暗培養。10-15天左右 即可發現侵染部位出現白色突起，2天后在侵染部位的白色突起長出絨毛狀根系，然后長出 一條或多條毛狀根（圖1);以不含外源基因的野生型ATCC15834菌液按照上述相同方法， 誘導出紫草野生型毛狀根，作為對照材料。
[0031] 實施例2、轉硬紫草LeEIL-Ι基因毛狀根的培養
[0032] (1)毛狀根除菌培養：誘導出來的毛狀根經過一星期的生長，剪取長度約1cm的毛 狀根，轉入MS+500mg/L頭孢霉素的固體除菌培養基，再過一星期轉入MS+250mg/L頭孢霉 素，直至除去殘留的發根農桿菌；將徹底除菌的毛狀根轉入B5固體培養基培養（圖2);
[0033] (2)毛狀根擴大培養：將固體擴大培養的毛狀根轉入B5液體培養基，lOOrpm的搖 床中光照擴大培養（圖3)。
[0034] 實施例3、轉硬紫草LeEIL-Ι基因毛狀根的鑒定
[0035] 分為分子檢測和熒光檢測2個部分。取一定數量毛狀根，CTAB法提取 毛狀根 DNA 為模板，設計引物 rolc-F:5' -ACAAGCCACTTCTGTTTCCC-3' ；rolC-R: 5, -CAGCGACTGCAACCAGTTTA-3'，用PCR方法擴增，以硬紫草基因組DNA為對照，擴增產物測 序比對，檢測轉基因毛狀根中農桿菌Ri質粒中RolC基因存在與否，隨機選取的3個擴大培 養硬紫草毛狀根株系，均檢測到RolC基因的存在（圖4)，說明獲得的均為毛狀根；同時上 述株系中長度約2-3_的毛狀根，制作成切片，用激光共聚焦顯微鏡檢測熒光，結果顯示均 檢測到熒光（圖5)，表明所擴大培養的紫草毛狀根均為轉基因毛狀根。
[0036] 實施例4、轉硬紫草LeEIL-Ι基因毛狀根紫草寧含量測定
[0037] (1)將驗證為轉入目的基因的轉基因硬紫草毛狀根及野生型毛狀根轉入M9液體 培養基，置于26°C、100rpm的搖床中黑暗培養，一周后紫草寧含量即可達到很高濃度（圖 6)；
[0038] (2)用石油醚浸泡紫草毛狀根及含有紫草寧的M9液體，提取紫草寧，紫外分光光 度計測定紫草寧含量，以野生型紫草毛狀根為對照，計算轉基因毛狀根中紫草寧含量變化 (圖7)。紫草寧含量總量包括紫草細胞或毛狀根和分泌到M9培養基中的紫草寧含量總和。 具體方法如下：稱取在M9培養體系中的毛狀根，并取含有分泌的紫草寧的M9培養基，用石 油醚浸泡，反復提取紫草寧，直到提取液無色，合并提取液，紫外分光光度計測定0D520的 吸光值，由下列方程得到紫草寧含量：紫草寧含量（mg/gFW) = 41. 66X0D520X稀釋倍數。
[0039] (3)紫草寧含量測定顯示，所得到的這一個轉LeEIL-1基因的硬紫草毛狀根 在M9液體培養基中一周后紫草寧含量比相同生長條件下的野生型毛狀根中的含量提 高2. 81倍，而且該株系具有生長速度快、繁殖容易的特點，適于商業化生產所用，命名為 LeEIL-l-line-001〇
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【權利要求】
1. 一個高產藥用天然產物（紫草寧及其衍生物）的硬紫草轉LeEIL-1基因毛狀根株 系。
2. 權利要求1中所述的硬紫草轉基因高產株系的商業化應用。
【文檔編號】A01H5/06GK104195167SQ201410366238
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月28日 優先權日:2014年7月28日
【發明者】楊永華, 戚金亮, 方榮俊, 趙胡, 趙華, 劉靜, 朱煜, 吳鳳瑤, 王小明, 陸桂華, 楊榮武 申請人:南京大學