川滇榿木次生代謝物對(duì)苯乙基酮為趨避云南松小蠹的緩釋劑及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于林業(yè)害蟲(chóng)防治，涉及防治云南松小蠹的藥物緩釋劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 云南松小蠹是云南切梢小蠹(Tomicus yunnanensis)、橫坑切梢小蠹(T. minor)、 短毛切梢小蠹(T. brevipiIosus)等以為害云南松為特征的一類(lèi)駐干小蠹，新羽化成蟲(chóng)喜 食健康松樹(shù)嫩梢，持續(xù)期8~9個(gè)月致使樹(shù)勢(shì)衰弱；性成熟后則選擇衰弱的云南松樹(shù)干作為 取食、產(chǎn)卵和繁殖，持續(xù)3~4個(gè)月最終使樹(shù)木死亡。但該小蠹從搜尋寄主開(kāi)始，到雌雄個(gè)體 相遇、交配、產(chǎn)卵、胚后發(fā)育等各個(gè)過(guò)程均受到非寄主氣味的影響，對(duì)林區(qū)內(nèi)存在寄主植物 具有高度的選擇和辨識(shí)能力。
[0003] 川滇梢木(Alnus ferdinandi-coburgii Schneid)隸屬于樺木科梢木屬植物，是 中國(guó)云南、貴州、四川等地的鄉(xiāng)土樹(shù)種，具有較強(qiáng)的適生性和抗逆能力，常用作云南松林中 低產(chǎn)林改造和混交林營(yíng)造的優(yōu)良樹(shù)種之一（陳強(qiáng)等，西部林業(yè)科學(xué)，2007，36，16-21;陳永 坤，云南林業(yè)，2011，32，53-53)。研究顯示樺木科屬植物含有二芳基庚烷類(lèi)化合物、綠原 酸、萜烯類(lèi)等化合物，能有誘集和趨避某些森林害蟲(chóng)（姜文霞等，武漢植物研究，1992，0， 391-392;楊曉珍等，大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2013,12,9-11等）。而云南松林套種川滇榿木證實(shí)明顯 降低云南松小蠹的危害，這可能與川滇榿木所釋放的次生代謝物質(zhì)，特別是與分子量小、沸 點(diǎn)低、易揮發(fā)的氣味物質(zhì)存在關(guān)系。但目前尚不清楚其次生代謝物質(zhì)的組成和活性成分，文 獻(xiàn)中僅見(jiàn)到尼泊爾榿木、川滇榿木果實(shí)、榿木葉片中的化合物，且這些化合物主要是高分子 次生代謝物質(zhì)，并未報(bào)導(dǎo)較為完整的川滇榿木次生代謝物質(zhì)的成分以及對(duì)這些成分的分 析。而川滇梢木成長(zhǎng)于海拔高度1500~3000m、土層厚度大于80cm，濕潤(rùn)的黃紅或紫色土壤， 且生長(zhǎng)期至少5年，限制了套種林木預(yù)防危害的效用。相關(guān)專(zhuān)利文獻(xiàn)，如"抗云南松小蠹混交 林模式快速篩選方法（CN201010249717.1)"是栽培非寄主林木營(yíng)造混交林以實(shí)現(xiàn)持續(xù)控 制小蠹蟲(chóng)的方法，但該方法也受限于非寄主林木的自然生長(zhǎng)環(huán)境和撫育時(shí)間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的首先是從云南松小蠹非寄主植物川滇榿木眾多次生代謝物質(zhì)中篩 選和鑒定活性成分，提供一種以生物學(xué)測(cè)定和嗅覺(jué)受體驗(yàn)證，干擾云南松小蠹寄主依存和 繁殖，趨避持續(xù)期不少于8個(gè)月的川滇榿木次生代謝物趨避云南松小蠹的緩釋劑。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是:提供一種應(yīng)用該緩釋劑的方法，該方法具有省時(shí)省力、使用 方便的優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明的目的按以下方式實(shí)現(xiàn)： (一)川滇榿木次生代謝物對(duì)苯乙基酮為趨避云南松小蠹的緩釋劑 該緩釋劑以正己烷或正戊烷或石油醚作為溶劑，以對(duì)苯乙基酮為溶質(zhì)，配置 對(duì)苯乙基酮溶液，用于趨避云南松小蠹危害程度不同的林分。
[0007] 所述的緩釋劑的對(duì)苯乙基酮濃度與云南松小蠹對(duì)林分危害程度呈正相關(guān)。
[0008] 所述的緩釋劑:該緩釋劑以正己烷作為溶劑，以對(duì)苯乙基酮為溶質(zhì)，配置濃度50~ 750 ng/uL對(duì)苯乙基酮溶液。
[0009] (二)應(yīng)用上述川滇榿木次生代謝物趨避云南松小蠹的緩釋劑的方法 將緩釋制劑盛入頂端開(kāi)孔口的緩釋瓶中，以揮發(fā)物釋放量多寡確定頂端開(kāi)孔口大小， 樹(shù)高塔式交叉懸掛于衰弱木枝干和枝梢各個(gè)方位上，直至緩釋瓶?jī)?nèi)的緩釋液釋放完畢，以 顯著降低云南松小蠹對(duì)云南松松梢和新萌發(fā)松梢的危害。
[00?0] 優(yōu)選的，所述的應(yīng)用方法在于：緩釋劑濃度分別為50 ng/uL、100 ng/uL、500 ng/ uL，分別對(duì)應(yīng)云南松小蠹危害程度為低、中、高三種林分。
[0011] 進(jìn)一步，所述的應(yīng)用方法在于:緩釋瓶為20 mL的塑料瓶，緩釋瓶的頂端開(kāi)孔口的 孔徑為0.05~0.10 mm。
[0012] 進(jìn)一步，所述的應(yīng)用方法，其特征在于:樹(shù)高塔式交叉懸掛于衰弱木枝干和枝梢各 個(gè)方位上，環(huán)形等距排列，每株懸掛8~50個(gè)。
[0013] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果： (1)本發(fā)明趨避劑所采用的對(duì)苯乙基酮是首次從非寄主植物次生代謝物質(zhì)中分離鑒定 出來(lái)的，其對(duì)云南松小蠹趨避能力未見(jiàn)于任何文獻(xiàn)報(bào)道。尤其是，該趨避劑對(duì)苯乙基酮為納 克數(shù)量級(jí)(ng)溶質(zhì)，具有用量少、高效、益于環(huán)境的特征，可為云南松小蠹無(wú)公害治理提供 技術(shù)和產(chǎn)品支持。
[0014] (2)本發(fā)明趨避劑容易配制，所使用的化學(xué)試劑，包括溶劑正己烷、正戊烷或石油 醚和溶質(zhì)對(duì)苯乙基酮均可直接從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)，價(jià)格低廉，推廣應(yīng)用非常方便快捷。
[0015] (3)對(duì)苯乙基酮和正己烷、正戊烷或石油醚化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，即使長(zhǎng)期暴露于林間條 件下也不易分解和氧化。因而本發(fā)明所制備的緩釋劑可覆蓋云南松小蠹取食、產(chǎn)卵和繁殖8 個(gè)月以上，長(zhǎng)期、穩(wěn)定的向外釋放可顯著降低云南松小蠹對(duì)云南松松梢和新萌發(fā)松梢的危 害，遏制云南松小蠹危害和擴(kuò)散蔓延。
[0016] (4)相比營(yíng)造混交林和一般化學(xué)農(nóng)藥試劑防治云南松小蠹，本發(fā)明節(jié)約勞動(dòng)力和 資金成本。
[0017] 應(yīng)用本發(fā)明所提供的對(duì)苯乙基酮緩釋劑在云南省曲靖市沾益縣九龍山林場(chǎng)、以云 南松小蠹危害程度為中度的云南松林分實(shí)施趨避性試驗(yàn)的結(jié)果證明：從4~12月連續(xù)觀察8 個(gè)月內(nèi)，本發(fā)明對(duì)云南松小蠹具有緩釋持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)和高效性趨避功能，覆蓋了云南松小蠹 的蛀梢期。
[0018] 為了便于理解，下面結(jié)合實(shí)施例及其附圖和附表，進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)地描述 和說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為云南松小蠹對(duì)川滇榿木次生代謝物質(zhì)的GC-EAD反應(yīng)圖譜。
[0020] 圖2為云南松小蠹對(duì)對(duì)苯乙基酮的選擇性。
[0021]圖3為氣味分子對(duì)苯乙基酮與嗅覺(jué)受體Tyun0BP6蛋白的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合曲線(xiàn)。
[0022]圖4為緩釋瓶頂端開(kāi)口方式示意圖。
[0023]圖5為緩釋瓶林間緩釋效果。
[0024]圖6為緩釋瓶林間依樹(shù)高等距塔式十字交叉懸掛示意圖。
[0025]圖7為對(duì)苯乙基酮趨避云南松小蠹的林間測(cè)試效果。
[0026]具體實(shí)施方法 1材料與方法 1.1次生代謝物質(zhì)的篩選與確定 1.1.1非寄主植物次生代謝物質(zhì)的收集與分析 采用頂空動(dòng)態(tài)法收集川滇榿木的次生代謝物質(zhì)。將采集的葉片和枝條用無(wú)味透明的塑 料袋(PTEK)包裹起來(lái)，袋的兩端分別留有進(jìn)氣口和出氣口。進(jìn)氣端空氣經(jīng)活性炭(0RB0TM-32)過(guò)濾，流速控制在400 mL/min;出氣端流經(jīng)150 mg Porapak Q吸附劑（50-80 mesh)，流 速為300 mL/min，收集時(shí)間為1.5 h。吸附完畢后，用正己烷(HPLC)洗脫，洗脫液300 yL保存 于2 mL容量的棕色試劑瓶?jī)?nèi)。然后經(jīng)吣濃縮至100 yL，加入正辛烷(0.702g/cm3)和乙酸癸酯 (0.865g/cm3)兩種內(nèi)標(biāo)化合物，每種內(nèi)標(biāo)化合物300 ng/yL。放入-20 °C冰箱內(nèi)保存待用。 [0027] 氣味分析采用GC-MS (Agilent HP6890A/5975 MS)進(jìn)行，取1.0 μL濃縮液從進(jìn)樣 口注入，質(zhì)譜柱型號(hào)極性HP-5MS型石英柱(30 m X 0.25 mm X 0.25 μπι)。升溫程序?yàn)?40 。(:保持2 min;然后2.57°C/min升溫至100°C，以后以30 °C/min升至250 °C，保持10 min。載 氣為高純的N2,柱流量1.0 ml/min，進(jìn)樣口溫度250 °C，柱前壓100 kPa;進(jìn)樣采用10:1的分 流模式。氣味物質(zhì)的鑒定采用NIST 98 MS譜庫(kù)檢索法、保留指數(shù)法和參考相關(guān)文獻(xiàn)法加以 確定。
[0028] 1.1.2次生代謝物質(zhì)的GC-EAD測(cè)試 首先用刀片將云南松小蠹成蟲(chóng)頭部切除，再用拉制的毛細(xì)管尖端刺破觸角端部，然后 將參比電極插入小蠹蟲(chóng)頭部血腔，固定于微動(dòng)操作臺(tái)上，調(diào)整距離，記錄電極端套入受損的 觸角頂端。參比電極和記錄電極玻璃管內(nèi)充滿(mǎn)生理液，內(nèi)插一根Ag/AgCl細(xì)絲用于導(dǎo)電。濕 潤(rùn)空氣流持續(xù)吹向固定好的觸角，流速400 mL/min。將2.0 yL濃縮液從氣相色譜進(jìn)樣口注 入，然后經(jīng)一個(gè)四壁不銹鋼分流裝置將濃縮液按照1:1方式分別注入GC和吹向觸角，吹向觸 角的揮發(fā)物經(jīng)一加熱罩加熱，加熱溫度260°C，GC升溫程序和色譜柱型號(hào)均與GC-MS分析一 樣，但GC(氣相色譜儀)不分流。刺激信號(hào)通過(guò)接受器感應(yīng)放大，經(jīng)IDAC-2信號(hào)面板的記錄、 儲(chǔ)存、處理，通過(guò)軟件Autospike(Version 3.6，Syntech)在計(jì)算機(jī)屏幕上展示出來(lái)。云南 切梢小蠹、橫坑切梢小蠹、短毛切梢小蠹每種各進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)試，雌雄均3次。
[0029] 1.2活性成分高效性測(cè)定 1.2.1生物學(xué)測(cè)試 采用"Y"型嗅覺(jué)儀進(jìn)行生物學(xué)測(cè)定。將樣品和對(duì)照(二氯甲烷)滴在一個(gè)長(zhǎng)形的濾紙上， 室溫放置20 min后，置于一個(gè)球形容器內(nèi)，并與?'型管的兩臂相連，然后開(kāi)始抽氣，氣流經(jīng) 活性炭過(guò)濾后加濕吹向釋放管內(nèi)的云南松小蠹，氣流速度300 mL/min，設(shè)置反應(yīng)時(shí)間為5 min，超過(guò)反應(yīng)時(shí)間的小蠹蟲(chóng)將其移出，記作不反應(yīng)，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)試20-30只。
[0030] 1.2.2嗅覺(jué)受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合驗(yàn)證 采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，首先設(shè)定發(fā)光波長(zhǎng)357 nm，掃描波長(zhǎng)范圍380~500 nm， 再向熒光比色皿中加入50 mmol/L Tris緩沖液(pH 7.4)，然后向比色皿中加入云南松小蠹 嗅覺(jué)受體蛋白Tyun0BP6使其濃度為2 umol/L，待熒光強(qiáng)度穩(wěn)定后即開(kāi)始掃描，然后加入含 有苯乙基酮?dú)馕度芤海状紴槿芤海K濃度控制在I mmol/L)加入到比色皿中，使加入的熒 光探針I(yè)-NPN溶度從2umol/L增加到16 umol/L。每次記錄最大的熒光強(qiáng)度，每次試驗(yàn)重復(fù)3 次。
[0031] 1.3緩釋液的制備與緩釋方法 以正己燒做溶液，將篩選確定活性次生代謝物質(zhì)配置成50 ng/uL，100 ng/uL，500 ng/ uL的三種濃度液體，盛放于20 ml的塑料瓶?jī)?nèi)，瓶的頂端采用A、B、C三種方式開(kāi)口（見(jiàn)圖4)， 空口直徑0.05~0.10 mm，分別對(duì)應(yīng)云南松小蠹危害程度為低、中、高三種林分。以中等危害 程度的林分為例，懸掛30個(gè)緩釋瓶，每月觀察一次，記錄每次剩余體積量，以此判斷緩釋劑 的釋放量，直至緩釋瓶?jī)?nèi)的緩釋液釋放完畢。
[0032]該緩釋劑也可以用正戊烷或石油醚為溶劑。
[0033] 1.4林間測(cè)定 趨避實(shí)驗(yàn)在云南省曲靖市沾益縣九龍山林場(chǎng)云南松林進(jìn)行，以云南松小蠹危害程度為 中度的林分為例，選擇兩塊，每塊隨機(jī)選擇30株云南松，然后將配置好的對(duì)苯乙基酮溶液按 方位、塔式十字交叉懸掛于枝干處（圖5)，從4~12月連續(xù)觀察8個(gè)月，記錄云南松小蠹蛀梢率 (DSI)，蛀梢率=(處理后被害率-處理前被害率)/(處理后被害率+處理前被害率），蛀梢率值 位于-1和1之間，負(fù)值意味被害率降低，正值為被害率增加。以正己烷對(duì)照，隨機(jī)選取10棵樹(shù) 木懸掛。
[0034] 2結(jié)果與分析 從表1可知，共鑒定44種川滇榿木次生代謝物質(zhì)，主要成分包括對(duì)苯乙基酮、Ct-薇烯、香 檜烯、β-蒎烯、月桂烯和α-石竹烯等烷烴類(lèi)和萜烯類(lèi)化合物，但昆蟲(chóng)觸角電位記錄系統(tǒng)顯示 僅有對(duì)苯乙基酮能引起云南松小蠹反應(yīng)（圖1 )，〇. 5 ng即具有79.3%趨避效果，選擇性表現(xiàn) 顯著。且隨釋放量的增加，云南松小蠹趨避能力也會(huì)隨之增加（圖2)，與嗅覺(jué)受體競(jìng)爭(zhēng)性實(shí) 驗(yàn)證明對(duì)苯乙基酮與受體結(jié)合能力強(qiáng)，且解離速度慢（圖3)。在中度危害的林分內(nèi)，懸掛對(duì) 苯乙基酮可持續(xù)衡量釋放9個(gè)多月（圖6)，覆蓋云南松小蠹的全部蛀梢期，懸掛趨避劑的云 南松松梢的被害率DSI=-0.0547,與對(duì)照相比（DSI=O. 2952)能夠顯著降低云南松小蠹的危 害(Ρ〈0·001，圖7)。
[0035]表1川滇榿木次生代謝物質(zhì)成分及其相對(duì)含量

$標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證，活性化學(xué)物質(zhì) 本發(fā)明所提供的一種云南松小蠹高效趨避劑的制備及緩釋方法，按照本方法篩選和中 度危害林分所實(shí)施趨避性試驗(yàn)，結(jié)果表明對(duì)苯乙基酮對(duì)云南松小蠹具有高效的趨避功能， 且所制備工藝簡(jiǎn)單，緩釋持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，能夠完全覆蓋云南松小蠹的蛀梢期。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 川滇榿木次生代謝物對(duì)苯乙基酮為趨避云南松小蠹的緩釋劑，其特征在于：該緩釋 劑以正己烷或正戊烷或石油醚作為溶劑，以對(duì)苯乙基酮為溶質(zhì)，配置對(duì)苯乙基酮溶液，用于 趨避云南松小蠹危害程度不同的林分。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的緩釋劑，其特征在于:該緩釋劑的對(duì)苯乙基酮濃度與云南松小 蠹對(duì)林分危害程度呈正相關(guān)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的緩釋劑，，其特征在于：該緩釋劑以正己烷作為溶劑，以對(duì) 苯乙基酮為溶質(zhì)，配置濃度50~750 ng/uL對(duì)苯乙基酮溶液。4. 一種應(yīng)用如權(quán)利要求1所述緩釋劑的方法，其特征在于:將緩釋制劑盛入頂端開(kāi)孔口 的緩釋瓶中，以揮發(fā)物釋放量多寡確定頂端開(kāi)孔口大小，樹(shù)高塔式交叉懸掛于衰弱木枝干 和枝梢各個(gè)方位上，直至緩釋瓶?jī)?nèi)的緩釋液釋放完畢，以顯著降低云南松小蠹對(duì)云南松松 梢和新萌發(fā)松梢的危害。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用方法，其特征在于:緩釋劑濃度分別為50 ng/uL、100 ng/ uL、500 ng/uL，分別對(duì)應(yīng)云南松小蠹危害程度為低、中、高三種林分。6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用方法，其特征在于:緩釋瓶為20 mL的塑料瓶，緩釋瓶 的頂端開(kāi)孔口的孔徑為0.05~0.10 mm。7. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用方法，其特征在于:樹(shù)高塔式交叉懸掛于衰弱木枝干 和枝梢各個(gè)方位上，環(huán)形等距排列，每株懸掛8~50個(gè)。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用方法，其特征在于:樹(shù)高塔式交叉懸掛于衰弱木枝干和枝 梢各個(gè)方位上，環(huán)形等距排列，每株懸掛8~50個(gè)。
【專(zhuān)利摘要】川滇榿木次生代謝物對(duì)苯乙基酮為趨避云南松小蠹的緩釋劑及方法。本發(fā)明以正己烷或正戊烷或石油醚為溶劑、以對(duì)苯乙基酮為溶質(zhì)配置對(duì)苯乙基酮溶液，用于趨避云南松小蠹危害程度不同的林分；對(duì)苯乙基酮濃度與云南松小蠹對(duì)林分危害程度正相關(guān)。應(yīng)用是將緩釋劑濃度設(shè)置為50~500 ng/uL置于一頂端開(kāi)口的緩釋瓶?jī)?nèi)，按方位、樹(shù)高塔式交叉懸掛于衰弱木枝干枝梢上。本發(fā)明取材于云南松小蠹的非寄主林木次生代謝物，趨避力強(qiáng)、持續(xù)周期長(zhǎng)、價(jià)格低廉、環(huán)境友好，可持續(xù)用于控制云南松小蠹的種群數(shù)量，推廣潛力大。
【IPC分類(lèi)】A01N25/02, A01N35/04, A01M1/20, A01N25/18, A01P17/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105707060
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610029911
【發(fā)明人】李宗波, 趙寧, 朱家穎, 楊斌, 王大偉, 澤桑梓
【申請(qǐng)人】西南林業(yè)大學(xué), 云南省林業(yè)有害生物防治檢疫局