本發明涉及一種水稻無菌苗培養的方法，屬于植物組織培養技術領域。

背景技術：
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“無菌苗”法是植物組織培養技術的延伸，無菌苗是植物有機營養及根系分泌物研究等試驗的必備生物材料，而水稻無菌苗的有效培養是開展后續組織培養和轉基因工作的前提和基礎。水稻種子消毒是一項麻煩的工作，這是由于水稻種子中的內生菌較多，而且種子外有一層與胚結合緊密的殼包裹著，這就給消毒帶來了麻煩，使消毒液不易滲入種子內殺死微生物。在現代研究技術領域中，水稻種子消毒的方法比較少，目前效果比較好的方法只有周穎君等人的先將水稻種子去殼后，再用5％的次氯酸鈉消毒45分鐘，這種方法不但繁瑣，增加工作量，而且會損傷種子的胚，影響發芽率，所以說目前尋找一種適合水稻種子的消毒方法是比較重要的。

技術實現要素：
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針對上述問題，本發明要解決的技術問題是提供一種水稻無菌苗培養的方法。

本發明的水稻無菌苗培養的具體方法為：1、取一定量的水稻種子，用水選法汰除空秕粒后，用水浸種4-8小時；

2、準備幾個大燒杯或培養皿、幾瓶去離子水以及實驗所需直徑為4-5cm杯底墊有4層濕紗布的培養杯，將其包好后置于120-130℃下滅菌25-35分鐘；

3、待浸種完成后，在超凈工作臺內進行如下操作：

3-1、將浸種后的水稻種子置于無菌的燒杯中，向燒杯中倒入適量的70％-75％酒精，使其完全沒過水稻種子，讓酒精浸泡1-2分鐘；

3-2、待酒精消毒完成后，倒去酒精，再向燒杯中加入適量的35％-40％甲醛，使其完全沒過水稻種子，讓甲醛浸泡種子3-5分鐘；

3-3、待甲醛消毒完成后，倒去甲醛，再向燒杯中加入適量的無菌水(去離子水滅菌所得)清洗種子，清洗三次；

3-4、待種子洗凈后，將種子置于鋪墊4層紗布的無菌培養杯中以無菌培養膜封口，再將培養杯置于溫度25℃-32℃的環境中進行催芽。

本發明的有益效果：它的方法簡單，易于操作，能解決現在實驗室中的水稻種子的消毒問題，進而為開展后續組織培養和轉基因工作提供前處理技術，以及為研究水稻有機營養及根系分泌物提供實驗材料。

附圖說明：

為了易于說明，本發明由下述的具體實施及附圖作以詳細描述。

圖1為本發明實施例1中培養的水稻的生長狀況觀察結果圖；

圖2為本發明實施例1中培養的水稻的發芽率分析結果圖；

圖3為本發明實施例2中培養的水稻的發芽率分析結果圖；

圖4為本發明實施例3中培養的水稻的發芽率分析結果圖。

具體實施方式：

本具體實施方式采用以下技術方案：1、取一定量的水稻種子，用水選法汰除空秕粒后，用水浸種4-8小時；

2、準備幾個大燒杯或培養皿、幾瓶去離子水以及實驗所需直徑為4-5cm杯底墊有4層濕紗布的培養杯，將其包好后置于120-130℃下滅菌25-35分鐘；

3、待浸種完成后，在超凈工作臺內進行如下操作：

3-1、將浸種后的水稻種子置于無菌的燒杯中，向燒杯中倒入適量的70％-75％酒精，使其完全沒過水稻種子，讓酒精浸泡1-2分鐘；

3-2、待酒精消毒完成后，倒去酒精，再向燒杯中加入適量的35％-40％甲醛，使其完全沒過水稻種子，讓甲醛浸泡種子3-5分鐘；

3-3、待甲醛消毒完成后，倒去甲醛，再向燒杯中加入適量的無菌水(去離子水滅菌所得)清洗種子，清洗三次；

3-4、待種子洗凈后，將種子置于鋪墊4層紗布的無菌培養杯中以無菌培養膜封口，再將培養杯置于溫度25℃-32℃的環境中進行催芽。

以上顯示和描述了本發明的基本原理和主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。

實施例1：

稱取5克水稻種子，將其置于一燒杯中，在燒杯中注滿水，然后將水稻秕粒撈出來，再讓水浸泡4小時。同時在121℃下將5套培養皿、3瓶300ml去離子水滅菌30min。在實驗前40分鐘再將實驗所需用具，如：鑷子、酒精燈、無菌的土豆培養基平板等置于超凈工作臺內打開紫外燈滅菌30分鐘，待滅菌完成后，在超凈工作臺內將浸種后的水稻種子轉移到滅過菌的培養皿中，再向培養皿中加入濃度為75％的酒精使其沒過水稻種子，浸泡1分鐘后倒去酒精，再向盛有種子的培養皿中加入適量濃度濃度為40％的甲醛使其沒過種子，浸泡5分鐘后倒去甲醛，再用無菌水清洗三次。然后用無菌的鑷子夾取15顆種子分別置于三個無菌的土豆培養基平板中，每個平板5顆，在28℃的環境中培養7天，觀察結果(見圖1；圖2)。此實施例中水稻的發芽率為93.33％。

實施例2：

稱取10克水稻種子，將其置于一燒杯中，在燒杯中注滿水，然后將水稻空殼秕粒撈出來，再讓水浸泡4小時。同時在121℃下將1個規格為500ml燒杯、5瓶300ml去離子水滅菌30min。在實驗前40分鐘再將實驗所需用具，如：鑷子、酒精燈、無菌且內有濕潤紗布的聚乙烯耐高溫培養杯等置于超凈工作臺內打開紫外燈滅菌30分鐘，待滅菌完成后，在超凈工作臺內將浸種后的水稻種子轉移到滅過菌的燒杯中，再向燒杯中加入濃度為70％的酒精使其沒過水稻種子，浸泡2分鐘后倒去酒精，再向盛有種子的燒杯中加入適量濃度為40％的甲醛使其沒過種子，浸泡5分鐘后倒去甲醛，再用無菌水清洗三次。然后用無菌的鑷子夾取90顆種子分別置于三個無菌且內有濕潤紗布的聚乙烯耐高溫培養杯，每個培養杯30顆，在30℃的環境中培養7天，觀察結果(見圖3)，此實施例中水稻的發芽率為91.11％。

實施例3：

稱取10克水稻種子，將其置于一燒杯中，在燒杯中注滿水，然后將水稻空殼撈出來，再讓水浸泡8小時。同時在121℃下將1個規格為500ml燒杯、5瓶300ml去離子水滅菌30min。在實驗前40分鐘再將實驗所需用具，如：鑷子、酒精燈、無菌且內有濕潤紗布的聚乙烯耐高溫培養杯等置于超凈工作臺內打開紫外燈滅菌30分鐘，待滅菌完成后，在超凈工作臺內將浸種后的水稻種子轉移到滅過菌的燒杯中，再向燒杯中加入濃度為75％的酒精使其沒過水稻種子，浸泡1分鐘后倒去酒精，再向盛有種子的燒杯中加入適量濃度為38％的甲醛使其沒過種子，浸泡5分鐘后倒去甲醛，再用無菌水清洗三次。然后用無菌的鑷子夾取150顆種子分別置于三個無菌且內有濕潤紗布的聚乙烯耐高溫培養杯，每個培養杯50顆，在29℃的環境中培養9天，觀察結果(見圖4)，此實施例中水稻的發芽率為94％。