本發(fā)明涉及十字花科蕓薹屬芥菜類蔬菜育種技術(shù)，具體涉及一種寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系的選育方法。

背景技術(shù)：

寬柄芥(Brassica juncea var.latipa)，系十字花科蕓薹屬芥菜種葉芥類蔬菜的一個(gè)變種，俗稱筍殼菜、青菜、寬板菜，因其葉柄及中肋寬大肥厚、質(zhì)地脆嫩，同時(shí)含不同程度的辛辣味、煮湯或涮火鍋味道尤美，具有去熱、御風(fēng)濕、利五臟、補(bǔ)天陽促進(jìn)血液循環(huán)之工效，頗受世人喜愛，是聞名于世的四川酸(泡)菜“主要原料，也是市民常用的特色鮮食蔬菜。目前在我國南方各省市區(qū)廣泛栽培，年種植面積達(dá)150萬畝以上，尤以四川、湖南、貴州等面積較大，生產(chǎn)種植加工也最為集中。

目前，國內(nèi)外有關(guān)寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系選育與研究還未見報(bào)道。特別是寬柄芥大面積生產(chǎn)用種方面，長期以來，無論是川、湘、黔等省還是重慶市，都是直接使用表現(xiàn)稍好的地方品種，大面積生產(chǎn)上的“多雜亂”及“自交衰退”現(xiàn)象十分普遍，直接結(jié)果就是原料作物的生長不整齊、產(chǎn)量不高、品質(zhì)差、抗病(逆)性弱等，嚴(yán)重制約著該產(chǎn)業(yè)的快速健康發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系的選育方法，利用芥菜類蔬菜(莖瘤芥)不育系為不育源，通過雜交、后代擇取典型單株與父本連續(xù)回交和SSR分子標(biāo)記鑒定，培育出了不育性狀穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)性狀良好且各具特色的寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系及保持系，實(shí)現(xiàn)該作物“三系”配套，進(jìn)而培育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗(耐)病性強(qiáng)的寬柄芥雜交新品種，實(shí)現(xiàn)雜種優(yōu)勢(shì)利用，屬國內(nèi)外首創(chuàng)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系的選育方法，包括如下步驟：

選取莖瘤芥胞質(zhì)雄性不育系JL154-5A作為母本，并同時(shí)選取寬柄芥優(yōu)良自交系作為轉(zhuǎn)育父本進(jìn)行常規(guī)雜交獲得F1，后代擇取典型單株與父本連續(xù)回交7代，獲得不育性狀穩(wěn)定，經(jīng)濟(jì)性狀良好的寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系及保持系。

本發(fā)明具有以下有益效果：

1、以莖瘤芥胞質(zhì)雄性不育系為不育源，寬柄芥優(yōu)良種質(zhì)為父本，通過雜交和連續(xù)回交，在國內(nèi)外率先培育出不育性狀穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)性狀良好且各具特色的寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系及保持系，豐富了芥菜類蔬菜的雜交育種遺傳種質(zhì)且屬國內(nèi)外首創(chuàng)。

2、以培育出的寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系及保持系為基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)該作物“三系”配套，進(jìn)而培育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗(耐)病性強(qiáng)的寬柄芥雜一代新品種，實(shí)現(xiàn)雜種優(yōu)勢(shì)利用，具有廣闊的市場(chǎng)前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例一種寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系的選育方法的系譜圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例引物“KBJ416”在寬柄芥不育系及保持系中多態(tài)性分布圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施事例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施事例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系的選育方法，包括如下步驟：

S1、以重慶市渝東南農(nóng)科院范永紅等培育出的莖瘤芥(榨菜)胞質(zhì)雄性不育系“JL154-5A”作母本，2011年3月，在田間系統(tǒng)鑒定并確證“JL154-5A”不育性狀穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，選擇不同性狀、不同生態(tài)類型、不同熟性的寬柄芥優(yōu)良自交系DJ、K6、HK-1、HK-2、K46、BK作父本進(jìn)行常規(guī)雜交獲得F1，后代擇取典型單株與父本連續(xù)回交7代，獲得不育性狀穩(wěn)定，經(jīng)濟(jì)性狀良好的寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系及保持系：DJA和DJB、K6A和K6B、HK-1A和HK-1B、K46A和K46B、HK-2A和HK-2B、BKA和BKB；

2010年10月將莖瘤芥不育系“JL154-5A”，在重慶市渝東南農(nóng)科院試驗(yàn)地進(jìn)行播種育苗移栽，2011年3月在開花期對(duì)不育系的花器官構(gòu)造、不育性狀表現(xiàn)進(jìn)行了觀察鑒定，確證為不育性徹底、性狀穩(wěn)定的不育系后，以莖瘤芥不育系JL154-5A作母本，選取6個(gè)優(yōu)良寬柄芥自交系、每自交系3個(gè)單株，與之分別成對(duì)雜交，得到F1代。2011年8月夏繁，從F1代中選擇3個(gè)典型單株作母親本，用上述對(duì)應(yīng)的自交系寬柄芥S1回交，同時(shí)母本單株自交測(cè)定其結(jié)實(shí)性。連續(xù)4年(2011-2014)的春季和夏季，繼續(xù)用寬柄芥自交系作輪回父本與之回交，同時(shí)母本單株套袋自交，測(cè)定其育性。到2015年5月選育出了不育度、不育株率為100％，且經(jīng)濟(jì)性狀良好穩(wěn)定的寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系及保持系6個(gè)

S2、在雜交和各回交世代，花期以材料為單位，進(jìn)行單株套袋自交，考查不育株自花授粉的結(jié)實(shí)性。

S3、對(duì)回交7代(不育系)及其父本(保持系)，隨機(jī)抽選3-5個(gè)典型單株在盛花期分別觀察測(cè)定花冠、雄蕊、雌蕊和蜜腺的形狀及大小，并對(duì)其開花特性進(jìn)行系統(tǒng)觀察。

S4、對(duì)回交7代(不育系)及其父本(保持系)的花粉，用0.5％的紅四唑(TTC)液在38℃下恒溫染色50min(分)，測(cè)定其生活力。

S5、對(duì)不育系和保特系，在重慶市渝東南農(nóng)科院(海拔273m)進(jìn)行正季種植，常規(guī)管理，各材料現(xiàn)蕾時(shí)，每材料選取5個(gè)典型單株，按《芥菜類蔬菜田間試驗(yàn)觀察記載項(xiàng)目及標(biāo)準(zhǔn)》，系統(tǒng)觀察其形態(tài)特征和主要性狀表現(xiàn)。

2014年月9月～2015年2月，對(duì)已經(jīng)完成回交轉(zhuǎn)育并經(jīng)育性鑒定達(dá)不育系標(biāo)準(zhǔn)的所有不育系和保持系，集中在渝東南農(nóng)科院同一生態(tài)條件下栽培，對(duì)其形態(tài)特征和主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行了系統(tǒng)的觀察鑒定。結(jié)果為：

經(jīng)連續(xù)7代回交轉(zhuǎn)育后的寬柄不育株系，其在葉形、葉緣、中脈顏色、葉片剌毛蠟粉、單株有效葉片數(shù)等方面，與對(duì)應(yīng)的保持系表現(xiàn)相同或相近。但在株高、開展度、單株鮮重、中肋寬及厚度等方面，與對(duì)應(yīng)的保持系有較大的差異。即：不育系比對(duì)應(yīng)保持系的植株高2-4cm，開展度大4-9cm，單株鮮重較保持系重100-300g等。同時(shí)，不育系的營養(yǎng)生長期比保持系要長3-5天。

2014年3-5月，在繼續(xù)進(jìn)行寬柄芥不育系回交轉(zhuǎn)育的同時(shí)，對(duì)不育系和相應(yīng)保持系的花器官形態(tài)特征、開花特性及花期變化進(jìn)行了系統(tǒng)的觀察。

(1)不育系的花器官特征

保持系的花冠由4個(gè)花瓣組成，呈十字形，黃色或淺黃色，雄蕊6枚、4強(qiáng)2弱；雌蕊單生，柱頭表面多乳突，花藥和花絲的長度稍大于花柱的長度，花藥較飽滿；蜜腺發(fā)育良好，3-4個(gè)，圓形，綠色或淺綠色，個(gè)別深綠色經(jīng)連續(xù)回交7代轉(zhuǎn)育的寬柄芥不育系花與對(duì)應(yīng)的保持系相比較，有其形態(tài)特征和結(jié)構(gòu)上的差別：不育系花冠盛花時(shí)花瓣表現(xiàn)為半開或全開，呈不規(guī)則的十字狀；每朵花雄蕊5-6枚，但花藥干癟、纖瘦、有棱或多棱；花絲比保持系短0.87-1.45mm；雌蕊單生，柱頭表面多乳突，子房外觀形態(tài)和大小與保持系基本相同；蜜腺發(fā)育良，與對(duì)應(yīng)的保持系沒有明顯差異。

(2)不育系的開花特點(diǎn)

經(jīng)連續(xù)7代回交轉(zhuǎn)育的寬柄芥不育系，幾乎每朵花的柱頭，在花蕾成熟之前就伸出蕾外達(dá)2.1-3.1mm，形成特殊的“花柱異長期”，此時(shí)人工授以正常的芥菜類花粉能夠正常結(jié)實(shí)結(jié)籽，平均結(jié)實(shí)率達(dá)90％以上。柱頭外露2～3d(天)后，花瓣才全展開或半展開，呈不規(guī)則的十字形，再經(jīng)2～3d(天)花瓣脫落，柱頭表面變黑。而對(duì)應(yīng)的保持系花蕾?zèng)]有異長期，每個(gè)花蕾從萼片開裂到花瓣展開僅3～4h(小時(shí))就呈十字形，再經(jīng)1-2d(天)后花瓣脫落。其它諸如植株的開花順序、每天的開花時(shí)間等，不育系與對(duì)應(yīng)的保持系沒有明顯的差別。

(3)不育系的花期

經(jīng)連續(xù)7代回交轉(zhuǎn)育的寬柄芥不育系的始花期與對(duì)應(yīng)的保持系相比，一般推遲2～3d(天)，盛花期和終花期相應(yīng)推遲3～5d(天)，整個(gè)花期持續(xù)20-27d(天)，長的達(dá)29d(天)以上，即不育系的花期比保持系要長5-6d(天)。

寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系的育性

(1)雄蕊的育性

①自然生態(tài)氣候條件下的育性：2011～2015年，在對(duì)寬柄芥雄性不育株系的每個(gè)世代進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育的同時(shí)，對(duì)中選單株進(jìn)行了套袋自交測(cè)定，除個(gè)別材料的回交世代株系發(fā)現(xiàn)有單株自交結(jié)實(shí)指數(shù)≥1(已陶汰)以外，未發(fā)現(xiàn)有自交結(jié)實(shí)現(xiàn)象。2014～2015年，又對(duì)經(jīng)回交六代后的“DJA、K6A、HK-1A、K46A”等不育系及對(duì)應(yīng)保持系單株自交結(jié)實(shí)情況進(jìn)行了系統(tǒng)考查，4個(gè)不育株系無論是春季還是夏季的自交結(jié)實(shí)指數(shù)均為“0”，表現(xiàn)為高度的不育且育性非常穩(wěn)定；而保持系在不同的季節(jié)結(jié)實(shí)率差異較大，一般是春季結(jié)實(shí)高于夏季結(jié)實(shí)，這可能與夏季氣溫較高、植株?duì)I養(yǎng)體小有關(guān)。

②不育系花粉的生活力：2014年3月，對(duì)“DJA、K6A、HK-1A、HK-2A K46A、BKA”等6個(gè)不育系及對(duì)應(yīng)的保持系的花粉粒進(jìn)行了“TTC”染色鏡檢觀察。結(jié)果為：不育系的花粉粒均不著色，且多數(shù)花粉粒呈不規(guī)則圓球形、透明，部分花粉粒還有開裂、缺失現(xiàn)象，花粉粒邊沿呈乳突狀；而保持系的花粉粒著色率為85-96％，表現(xiàn)為有生活力的花粉占絕大多數(shù)，花粉粒的形狀多為圓球形或橢圓形，不透明、飽滿。

(2)雌蕊的育性

2011～2015年，每個(gè)世代的回交轉(zhuǎn)育結(jié)果表明，寬柄芥不育系(或不育單株)的雌蕊柱頭在人工授粉后，不但能結(jié)實(shí)結(jié)籽，而且后代生長發(fā)育正常，不存在生殖隔離。同時(shí)，觀察不育系雌蕊的形態(tài)特征，均未發(fā)現(xiàn)與對(duì)應(yīng)的保持系(或回交父本材料)有質(zhì)的差異。由此證明，寬柄芥雄性不育系的雌蕊育性是完全正常的。

S6、選取經(jīng)回交七代轉(zhuǎn)育且植株形態(tài)特征及性狀表現(xiàn)穩(wěn)定的各不育系及對(duì)應(yīng)保持系的幼嫩葉片組織進(jìn)行了不育系SSR分子標(biāo)記鑒定。即：選用十字花科蕓薹屬網(wǎng)公布的600對(duì)SSR引物序列(由生工生物工程有限公司代理合成)，采用CTAB法提取全基因組DNA，并分別進(jìn)行PCR反應(yīng)、電泳及銀染等。具體為：

2016年1-4月，對(duì)培育出的寬柄芥雄性不育系及保持系6個(gè)(DJA和DJB、K6A和K6B、HK-1A和HK-1B、K46A和K46B、HK-2A和HK-2B、BKA和BKB)，選用十字花科蕓薹屬網(wǎng)公布的600對(duì)SSR引物序列，在重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院，進(jìn)行了SSR分子標(biāo)記篩選鑒定，結(jié)果如圖2所示，圖中，1-2為不育源JL154；3-5為DJA-1-DJA-3；6-8為K46A-1-K46A-3；9-10為保持系DJ和K46；11-13為K6A-1--K6A-3；14-15為BKA-1-BKA-2；16-17為HK-1A和HK-2A；18-21為保持系K6、BK、HK-1、HK-2；22為Maker。

引物“KBJ416”在不育系及保持系中擴(kuò)增出的條帶呈多態(tài)性。其中，泳道1為引物KBJ416在莖瘤芥不育系JL154-5A(寬柄芥不育源上)所擴(kuò)增出的條帶；泳道2-8、11-17為引物“KBJ416”在不同寬柄芥不育系上擴(kuò)增出的條帶；泳道9-10、18-21為引物“KBJ416”在寬柄芥保持系上擴(kuò)增出的條帶。同時(shí)，帶型分析表明，引物“KBJ416”在不育源和經(jīng)連續(xù)回交轉(zhuǎn)育的不同寬柄芥胞質(zhì)雄性不育系上擴(kuò)增的條帶完全一致，而與對(duì)應(yīng)的寬柄芥保持系擴(kuò)增出的帶型表現(xiàn)有顯著的差異。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。