本發(fā)明涉及一種石蟬草(Peperomia dindygulensis Miq)組織培養(yǎng)快速繁殖的方法，特別是一種利用野生藥用植物石蟬草帶芽莖段進(jìn)行組織培養(yǎng)快速繁殖的方法。屬野生藥用植物種苗繁殖技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
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石蟬草(Peperomia dindygulensis Miq)系胡椒科草胡椒屬植物，為一年生肉質(zhì)草本，主要分布于我國(guó)南方的各省區(qū)。石蟬草以全草入藥，味辛，性涼，具有清熱解毒，化瘀散結(jié)、利水消腫的功效，主治肺熱咳嗽、麻疹、瘡毒、癌腫等癥。在民間常作為抗腫癌草藥應(yīng)用。在《云南中草選》中記載用其治療胃癌、食道癌、肝癌、乳腺癌和肺癌。石蟬草在云南主要分布于南部地區(qū)的石山林下，為云南省苗族、彝族、拉祜族等民族民間常用珍稀抗癌藥材。石蟬草具有可開(kāi)發(fā)為抗癌藥品和抗癌食品的潛力。長(zhǎng)期以來(lái)，石蟬草藥材來(lái)源全部依賴于野生植物資源，隨著天然藥品市場(chǎng)的需求量與日俱增，石蟬草野生資源受到嚴(yán)重破壞，目前野生資源已經(jīng)很難找到。
石蟬草地域分布狹窄，生長(zhǎng)速度較慢，自然繁殖困難，加之近年來(lái)掠奪式過(guò)度采挖，目前全草干品價(jià)格昂貴，極度珍稀、瀕臨滅絕。急需對(duì)其進(jìn)行資源保護(hù)和人工種苗快速繁殖技術(shù)研究。
經(jīng)文獻(xiàn)檢索，還未見(jiàn)到任何有關(guān)石蟬草種苗快速繁殖、種子萌發(fā)、野生資源調(diào)查、人工種植等公開(kāi)發(fā)表的內(nèi)容。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于提供一種利用石蟬草(Peperomia dindygulensis Miq)帶芽莖段進(jìn)行組織培養(yǎng)快速繁殖的方法。本方法通過(guò)外植體的選擇消毒、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)等到技術(shù)環(huán)節(jié)的調(diào)控，能有效實(shí)現(xiàn)石蟬草組織培養(yǎng)快速繁殖。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
一種石蟬草(Peperomia dindygulensis Miq)組織培養(yǎng)快速繁殖的方法，其特征在于包含下列步驟：
A.外植體的選擇和消毒：
剪取石蟬草生長(zhǎng)旺盛的帶芽莖段，清洗、消毒后去除葉片，帶入無(wú)菌操作臺(tái)；用75％乙醇浸泡8S，快速取出后用無(wú)菌水清洗2次，再將莖枝放入2％次氯酸鈉溶液中浸泡10-15min，取出后用無(wú)菌水清洗3次，用剪刀將取枝條剪切成帶節(jié)小莖段，接種于誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基上。
B.誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)：
誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基成分為MS+6-BA1.0～1.5mg/L+130g/L椰子汁+25g/L蔗糖+8～10g/L瓊脂,培養(yǎng)基pH值為5.8～6.0；誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度1500-2000lx，光照10h/d，溫度20～22℃；在誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)20～25d后，節(jié)上會(huì)出現(xiàn)大量芽，待芽枝長(zhǎng)到2～3cm，切取芽枝在相同培養(yǎng)條件下連續(xù)培養(yǎng)，可實(shí)現(xiàn)不斷增殖。C.生根培養(yǎng)：
切取2～3cm生長(zhǎng)健壯的新梢轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上；生根培養(yǎng)基成分為1/2MS+NAA0.6～0.9mg/L+Pt50g/L+Bn100g/L+25g/L蔗糖+8～10g/L瓊脂+0.2g/L活性炭,培養(yǎng)基pH值為5.8～6.0；生根培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度2000～3000lx，光照10～12h/d，溫度20～22℃；在生根培養(yǎng)基培養(yǎng)40～60d后可成苗。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：通過(guò)采用外植體選擇消毒、誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)相結(jié)合的配套技術(shù)，能通過(guò)石蟬草組織培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)種苗快速繁殖。本發(fā)明屬首次進(jìn)行石蟬草組織培養(yǎng)成果，本發(fā)明技術(shù)方法簡(jiǎn)單，成本較低，便于操作，適宜于實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案更清楚明白，本發(fā)明用具體實(shí)例對(duì)外植體的選擇處理、誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)等技術(shù)的研究篩選過(guò)程進(jìn)行了充分的說(shuō)明，以證明本研究成果的正確性，但并非說(shuō)明本發(fā)明僅限用于這些例子。
不同外植體的選擇研究
為了研究石蟬草不同器官培養(yǎng)的效果，選擇出最佳的培養(yǎng)材料。本研究分別采用石蟬草的葉片、休眠芽、帶節(jié)嫩莖段、成熟種子、未成熟種子為外植體。各種外植體采取用75％乙醇浸泡5～10S，快速取出后用無(wú)菌水清洗2次，再放入2％次氯酸鈉溶液中浸泡8-15min，取出后用無(wú)菌水清洗3次，然后接種于MS+6-BA0.8mg/L+Pt150g/L+25g/L蔗糖+8g/L瓊脂,培養(yǎng)基pH值為5.8；每處理接種5瓶，葉、芽和帶節(jié)嫩莖段，每瓶接種3個(gè)，成熟種子和未成熟種子每瓶按100粒；接種后的材料在光照強(qiáng)度1500～2000lx，光照10h/d，溫度20℃下培養(yǎng)，40d時(shí)觀察比較各處理的萌發(fā)時(shí)間、萌發(fā)率和新芽生長(zhǎng)情況。
通過(guò)試驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)：石蟬草帶節(jié)嫩莖芽作為外植體培養(yǎng)效果最好，表現(xiàn)為萌發(fā)時(shí)間最短，萌發(fā)數(shù)量最多，40天左右萌發(fā)的新芽可達(dá)24～32mm；休眠芽雖然能萌發(fā)，但表現(xiàn)為萌發(fā)速度較慢、萌發(fā)率較低、萌發(fā)后芽的生長(zhǎng)速度較慢；成熟種子也能少量萌發(fā)，雖萌發(fā)速度和生長(zhǎng)速度都較快，但污染率極高，在生產(chǎn)中極難操作；葉片和未成熟種子都未萌發(fā)；各處理有顯著差異。研究結(jié)果表明石蟬草的帶節(jié)嫩莖枝為最佳接種外植體。
表1石蟬草不同器官培養(yǎng)萌發(fā)情況比較
注:同一列上不同的字母,分別表示在P<0.05水平上的差異顯著性；表中數(shù)據(jù)為5個(gè)重復(fù)的平均數(shù)。
石蟬草嫩莖枝誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)中不同基本培養(yǎng)基的篩選研究
為了篩選出石蟬草帶芽莖段培養(yǎng)中最佳基本培養(yǎng)基種類。本研究以帶芽莖段為接種材料，分別以采取了MS、1/2MS、B5三種不同基本培養(yǎng)基，二種的6-BA濃度(2.0mg/L、1.0mg/L)進(jìn)行培養(yǎng)。在各處理中都添加相同的Pt150g/L+25g/L蔗糖+8g/L瓊脂，培養(yǎng)基pH值為5.8；每處理接種5瓶，每瓶接種3個(gè)0.3～0.5cm帶1個(gè)節(jié)嫩莖枝；接種后的材料在光照強(qiáng)度1500～2000lx，光照10h/d，溫度20℃下培養(yǎng)，30d時(shí)觀察比較各處理的萌發(fā)時(shí)間、萌發(fā)情況和芽的生長(zhǎng)情況。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)各處理差異著；處理1結(jié)果最佳，表現(xiàn)為接種后11～15天就開(kāi)始萌發(fā)，同時(shí)萌發(fā)后的莖枝節(jié)上腋芽開(kāi)始萌動(dòng)側(cè)枝，接種30d主枝平均長(zhǎng)到時(shí)2～3cm，增殖明顯；其次為處理2、3和4，雖然能萌發(fā)，但與處理1相比，萌發(fā)時(shí)間延遲，同時(shí)萌發(fā)芽數(shù)量較少，新芽生長(zhǎng)速度慢，增殖不明顯；處理5和處理6萌發(fā)速度慢。研究結(jié)果表明MS可作為石蟬草帶節(jié)嫩莖枝誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)的最佳基本培養(yǎng)基。
表2不同基本培養(yǎng)基對(duì)石蟬草帶芽莖段誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)中芽的萌發(fā)情況比較
注:同一列上不同的字母,分別表示在P<0.05水平上的差異顯著性；表中數(shù)據(jù)為5個(gè)重復(fù)的平均數(shù)。
石蟬草帶芽莖段誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)中細(xì)胞分裂素種類和濃度的篩選研究
為了篩選出石蟬草帶芽莖段誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)中最佳細(xì)胞分裂素種類和濃度。本研究以帶節(jié)嫩莖枝為接種材料，以MS為基本培養(yǎng)基，選擇3種不同的細(xì)胞分裂素種類(6-BA、KT、ZT)，3種不同濃度(1.5mg/L、1.0mg/L、0.5mg/L)進(jìn)行培養(yǎng)。在各處理中都添加相同的Pt150g/L+25g/L蔗糖+6g/L瓊脂，培養(yǎng)基pH值為5.8；每處理接種5瓶，每瓶接種3個(gè)0.3～0.5cm帶1個(gè)節(jié)嫩莖枝；接種后的材料在光照強(qiáng)度1500～2000lx，光照10h/d，溫度20℃下培養(yǎng)，30d時(shí)觀察比較各處理的萌發(fā)時(shí)間、萌發(fā)情況和芽的生長(zhǎng)情況。
通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)各處理差異著；處理2萌發(fā)增殖效果最佳，表現(xiàn)為接種后10～15天就開(kāi)始萌發(fā)，同時(shí)萌發(fā)后的莖枝節(jié)上腋芽開(kāi)始萌動(dòng)側(cè)枝，接種單莖萌發(fā)數(shù)可達(dá)4～6個(gè)，接種30d主枝平均長(zhǎng)到時(shí)3～5cm，為側(cè)枝增殖非常明顯；其次為處理3，也表現(xiàn)出較好萌發(fā)增殖效果，但與處理2相比，雖然萌發(fā)速度和芽數(shù)量無(wú)顯著差異，但新芽生長(zhǎng)速度減慢；其余處理萌發(fā)增殖效果均較差。研究結(jié)果表明石蟬草帶節(jié)嫩莖枝誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基配方中最佳的細(xì)胞分裂素種類為6-BA,其較適宜的濃度為1.0-1.5mg/L之間。
表3不同細(xì)胞分裂素對(duì)石蟬草嫩莖枝誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)中芽的萌發(fā)情況比較
注:同一列上不同的字母,分別表示在P<0.05水平上的差異顯著性；表中數(shù)據(jù)為5個(gè)重復(fù)的平均數(shù)。
石蟬草帶芽莖段誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)培養(yǎng)的最佳添加有機(jī)物的篩選研究
為了摸清石蟬草帶芽莖段誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)的最適宜的有機(jī)添加物種類。本研究以帶芽莖段枝為接種材料，選擇5種不同有機(jī)添加物(椰子汁、香蕉泥、馬鈴薯汁、蘋果汁、香蕉泥馬鈴薯汁混合)種類進(jìn)行培養(yǎng)，每種有機(jī)添加物的量為130g/L。在各處理中都添加相同的MS+6-BA1.0mg/L+25g/L蔗糖+8g/L瓊脂,培養(yǎng)基pH值為5.8；每處理接種5瓶，每瓶接種3個(gè)0.3-0.5cm帶1個(gè)節(jié)嫩莖枝；接種后的材料在光照強(qiáng)度1500～2000lx，光照10h/d，溫度20℃下培養(yǎng)，30d時(shí)觀察比較各處理的萌發(fā)時(shí)間、萌發(fā)情況和芽的生長(zhǎng)情況。
通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，處理1萌發(fā)增殖效果最佳，表現(xiàn)為接種后9～13天就開(kāi)始萌發(fā)，接種單莖萌發(fā)數(shù)可達(dá)6～8個(gè)，接種30d主枝平均長(zhǎng)到時(shí)4～5cm，為側(cè)枝增殖非常明顯；處理效果較好的為處理3，也表現(xiàn)出較好萌發(fā)增殖效果，但與處理1相比，同時(shí)萌發(fā)芽數(shù)量減少，新芽生長(zhǎng)速度減慢，二者差異顯著，；其次為處理3和處理2，雖然也表現(xiàn)出一定的萌發(fā)增殖效果，但萌發(fā)芽數(shù)量和新芽生長(zhǎng)速度都減慢，說(shuō)明單獨(dú)應(yīng)用馬鈴薯和香蕉，結(jié)果都還太理想；所有處理中，處理5效果最差，說(shuō)明帶芽莖段誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)中添加蘋果，效果不佳。研究結(jié)果表明，椰子汁作為石蟬草帶芽莖段誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)的最適宜添加的有機(jī)物，但因椰子汁取材比較困難，綜合考慮材料來(lái)源、價(jià)格、成本等因素，在條件不允許的地區(qū)也可以使用香蕉和馬鈴薯的混和有機(jī)添加物。
表4不同有機(jī)添加物對(duì)石蟬草帶芽莖段誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)中芽的萌發(fā)情況比較
注:同一列上不同的字母,分別表示在P<0.05水平上的差異顯著性；表中數(shù)據(jù)為5個(gè)重復(fù)的平均數(shù)。
化血膽帶帶芽莖段誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)培養(yǎng)條件的研究
為了摸清化血膽帶芽莖段枝誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)最適宜的培養(yǎng)條件。本研究以帶節(jié)嫩莖枝為接種材料，設(shè)置5種不同的培養(yǎng)溫度(18℃、20℃、22℃、24℃、26℃)、2種光照強(qiáng)度(1500～2000lx、2500～3000lx)進(jìn)行培養(yǎng)。在各處理中都添加相同培養(yǎng)基MS+6-BA1.0mg/L+椰子汁130g/L+25g/L蔗糖+8g/L瓊脂，培養(yǎng)基pH值為5.8；每處理接種5瓶，每瓶接種3個(gè)0.3-0.5cm帶1個(gè)節(jié)嫩莖枝；接種后都在光照10h/d，30d時(shí)觀察比較各處理的萌發(fā)時(shí)間、萌發(fā)情況和芽的生長(zhǎng)情況。
通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，處理3、處理4和處理5萌發(fā)增殖效果最佳，單莖平均增殖數(shù)和芽生長(zhǎng)顯著高于其它處理，表現(xiàn)為接種后9-11天就開(kāi)始萌發(fā)，接種單莖萌發(fā)數(shù)可達(dá)6-8個(gè)，接種30d主枝平均長(zhǎng)到時(shí)3-5cm，三者之間無(wú)顯著差異；其次為處理6和2，也表現(xiàn)出較好萌發(fā)增殖效果，但與處理3相比，同時(shí)萌發(fā)芽數(shù)量減少，出現(xiàn)叢生芽，且新芽生長(zhǎng)速度減慢，少數(shù)會(huì)出現(xiàn)新稍枯黃；效果最差為處理1、處理9和10處理，雖然也能增殖萌發(fā)，但萌發(fā)芽數(shù)量和新芽生長(zhǎng)速度顯著低于其它處理。由以上結(jié)果說(shuō)明石蟬草帶芽莖段誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)，其最佳培養(yǎng)溫度為20～22℃，其最適應(yīng)的光照強(qiáng)度為1500～2000LX，溫度過(guò)高或過(guò)低，光照過(guò)強(qiáng)也會(huì)顯著抑制芽的誘導(dǎo)增殖效果。
表5不同培養(yǎng)條件對(duì)石蟬草帶芽莖段導(dǎo)增殖培養(yǎng)中芽的萌發(fā)情況比較
9注:同一列上不同的字母,分別表示在P<0.05水平上的差異顯著性；表中數(shù)據(jù)為5個(gè)重復(fù)的平均數(shù)。
石蟬草生根培養(yǎng)中生長(zhǎng)素種類和濃度的篩選研究
為了篩選出化血膽帶芽莖段生根培養(yǎng)中最佳生長(zhǎng)素種類和濃度。本研究以帶芽莖段為接種材料，設(shè)置3種不同的生長(zhǎng)素種類(2,4-D、NAA、IAA)，4種不同濃度(0.3mg/L、0.6mg/L、0.9mg/L、1.2mg/L)進(jìn)行培養(yǎng)。在各處理都添加相同1/2MS+Pt50g/L+Bn100g/L+25g/L蔗糖+0.2g/LCN+8g/L瓊脂，培養(yǎng)基pH值為5.8；每處理接種5瓶，每瓶接種3個(gè)0.3-0.5cm帶1個(gè)節(jié)嫩莖枝；接種后的材料在光照強(qiáng)度2000～3000lx，光照12h/d，溫度20℃下培養(yǎng)，40d時(shí)觀察比較各處理的發(fā)根時(shí)間、發(fā)根數(shù)、根系長(zhǎng)度和苗的生長(zhǎng)情況。
通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，處理6和處理7生根培養(yǎng)殖效果最佳，表現(xiàn)為接種后20-25天就開(kāi)始生根，平增多生根條數(shù)4-6條，根長(zhǎng)可達(dá)1-2cm，植株整體表現(xiàn)為植株健壯，生長(zhǎng)速度快，分枝多，葉厚茸毛多，莖桿較粗綠中帶紅，根系較粗，二者平均生根速度、根的條數(shù)和平均根長(zhǎng)無(wú)顯著差異；生根培養(yǎng)較果較好的處理為5、8、9、和10，但其生根培養(yǎng)效果顯著低于最佳的處理6和處理7，表現(xiàn)為平均生根時(shí)間推遲，根的條數(shù)減少，平均根較短，植物整體表現(xiàn)為生長(zhǎng)較慢、分枝少、葉薄且色淡、莖細(xì)、根系弱；在所有處理中處理1、2、3、4、12生根培養(yǎng)效果最差，說(shuō)明2,4-D不太適宜作為生根培養(yǎng)的添加生長(zhǎng)素類型。研究結(jié)果表明石蟬草生根培養(yǎng)基配方中最佳的生長(zhǎng)素種類為NAA,其較適宜的濃度為0.6-0.9mg/L。
表6不同生長(zhǎng)素對(duì)石蟬草帶芽莖段生根培養(yǎng)情況比較
注:同一列上不同的字母,分別表示在P<0.05水平上的差異顯著性；表中數(shù)據(jù)為5個(gè)重復(fù)的平均數(shù)。
石蟬草帶芽莖段生根培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)光照時(shí)間的篩選研究
為了摸清石蟬草帶節(jié)嫩莖枝生根培養(yǎng)的最適宜光照時(shí)間。本研究以帶節(jié)嫩莖枝為接種材料，在設(shè)置5種不同光照時(shí)間(8、10、12、14、16)種類進(jìn)行培養(yǎng)，各處理培養(yǎng)基都為1/2MS+NAA0.6mg/L+Pt50g/L+Bn100g/L+25g/L蔗糖+8g/L瓊脂+0.2g/L活性炭,培養(yǎng)基pH值為5.8；每處理接種5瓶，每瓶接種3個(gè)0.3-0.5cm帶1個(gè)節(jié)嫩莖枝；接種后的材料在光照強(qiáng)度2000-3000lx，溫度20℃下培養(yǎng)，40d時(shí)觀察比較各處理的發(fā)根時(shí)間、發(fā)根數(shù)、根系長(zhǎng)度和苗的生長(zhǎng)情況。
通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，處理2和處理3生根培養(yǎng)殖效果最佳，表現(xiàn)為接種后20-25天就開(kāi)始生根，平增多生根條數(shù)5-7條，根長(zhǎng)可達(dá)2-3cm，植株整體表現(xiàn)為生長(zhǎng)較快，分枝多，莖桿較粗，葉厚實(shí)色濃綠，茸毛多，根系較粗，有大量氣生根，苗健壯，其生根培養(yǎng)效果顯著好于其它處理，但二者無(wú)顯著差異；生根培養(yǎng)效果較好的處理為4，但其生根培養(yǎng)效果顯著低于最佳的處理2和3，表現(xiàn)為根的條數(shù)顯著減少，植株生長(zhǎng)緩慢，分枝少，苗節(jié)間密有矮化趨勢(shì)；在所有處理中處理1和5生根培養(yǎng)效果最差，表現(xiàn)為生長(zhǎng)慢，分枝少，莖細(xì)，苗較弱，葉色淡，嚴(yán)重黃化和玻璃化。研究結(jié)果表明石蟬草生根培養(yǎng)培養(yǎng)階段需要中等的光照時(shí)間，適宜光照時(shí)間為10～12h/d，因考慮成本的問(wèn)題，建議化血膽生根培養(yǎng)光照時(shí)間10h/d較為適宜。
表7不同有機(jī)添加物對(duì)石蟬草帶芽莖段生根培養(yǎng)情況比較
注:同一列上不同的字母,分別表示在P<0.05水平上的差異顯著性；表中數(shù)據(jù)為5個(gè)重復(fù)的平均數(shù)。
本發(fā)明利用石蟬草帶芽莖段進(jìn)行組織培養(yǎng)快速繁殖的方法。對(duì)于保護(hù)野生石蟬草資源，提高繁殖系數(shù)，促進(jìn)石蟬草資源可持續(xù)利具有現(xiàn)實(shí)意義。