本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及一種植物組織的顯微觀察方法。

背景技術(shù)：

隨著功能基因組學、分子生物學研究的不斷深入，特定基因在植物體內(nèi)的表達部位其在特定發(fā)育時期的功能得到了廣泛關(guān)注。熒光顯微觀察和三維成像技術(shù)為植物表型分析、植物與病原菌互作以及基因表達模式分析提供了重要工具。與動物細胞相比，植物細胞壁與細胞質(zhì)折射率不同，而且細胞中含量豐富的色素和芳香類物質(zhì)使獲取的圖像信噪比降低。因此，以往對植物細胞的顯微觀察僅限于深度大約為30μm左右的幾層細胞，極大地影響了植物細胞結(jié)構(gòu)和功能的解析。

為了觀察植物體更深層的內(nèi)部結(jié)構(gòu)或亞細胞結(jié)構(gòu)，往往需要經(jīng)過特殊處理，使植物樣品減少厚度及體積，使光線透過樣品才能進行顯微觀察。處理后的材料要求小而薄、完整、透明、保持原結(jié)構(gòu)，又具有顏色容易辨認。為達到上述要求，需要采取不同的制片方法或者在成像之前對植物材料進行透明，以方便觀察組織較厚的植物樣品，例如煙草和番茄葉片、沙蔥葉片等。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明一個目的是提供一種植物組織顯微鏡檢測前處理的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟A：

1)將植物組織用固定液固定，得到固定后的植物組織；

2)將所述固定后的植物組織用氫氧化鉀消化，得到消化后的植物組織；

3)將消化后的植物組織用PHEM溶液洗滌，得到洗滌后植物組織；

4)將所述洗滌后植物組織在透明液中浸沒處理，得到透明后的植物組織，實現(xiàn)植物組織顯微鏡檢測前處理；

所述PHEM溶液包括PIPES(對二氮己環(huán)-1,4-二(2-乙磺酸))、HEPES(羥乙基哌嗪乙硫磺酸)、EGTA和MgCl₂；

所述透明液由尿素、丙三醇、Triton X-100和所述PHEM溶液組成；

上述方法中，

所述PIPES、所述HEPES、所述EGTA和所述MgCl₂的摩爾的量比為40-80：15-35：5-15：1-3；

或所述PIPES、所述HEPES、所述EGTA和所述MgCl₂的摩爾的量比為60：25：15：2；

或所述PIPES、所述HEPES、所述EGTA和所述MgCl₂的摩爾的量比為60：25：10：2；

或所述PIPES、所述HEPES、所述EGTA和所述MgCl₂的摩爾的量比為40：15：5：1；

或所述尿素、所述丙三醇、所述Triton X-10的配比為4-8mol：20-40ml：0.05-0.15g；

或所述尿素、所述丙三醇、所述Triton X-10的配比為6mol：20ml：0.1g；

或所述尿素、所述丙三醇、所述Triton X-10的配比為6mol：30ml：0.1g；

或所述尿素、所述丙三醇、所述Triton X-10的配比為4mol：20ml：0.1g。

上述方法中，

所述PHEM溶液由終濃度為40-80mM PIPES、終濃度為15-35mM HEPES、終濃度為5-15mM EGTA、終濃度為1-3mM MgCl₂和水組成；

或所述PHEM溶液由終濃度為60mM PIPES、終濃度為25mM HEPES、終濃度為15mM EGTA、終濃度為2mM MgCl₂和水組成；

或所述PHEM溶液由終濃度為60mM PIPES、終濃度為25mM HEPES、終濃度為10mM EGTA、終濃度為2mM MgCl₂和水組成；

或所述PHEM溶液由終濃度為40mM PIPES、終濃度為15mM HEPES、終濃度為5mM EGTA、終濃度為1mM MgCl₂和水組成；

或所述透明液由終濃度為4-8M尿素、體積百分比20-40％丙三醇、質(zhì)量百分含量0.05-0.15％Triton X-100和PHEM溶液組成；

或所述透明液由終濃度為6M尿素、體積百分比20％丙三醇、體積百分比0.1％Triton X-100和PHEM溶液組成；

或所述透明液由終濃度為6M尿素、體積百分比30％丙三醇、體積百分比0.1％Triton X-100和PHEM溶液組成；

或所述透明液由終濃度為4M尿素、體積百分比20％丙三醇、體積百分比0.1％Triton X-100和PHEM溶液組成。

上述方法中，

所述PHEM溶液的pH值為6.9；

上述方法中，

所述將固定后的植物組織用氫氧化鉀消化的方式為將固定后的植物組織浸在濃度為質(zhì)量百分比10-15％的氫氧化鉀水溶液中；

或所述將消化后的植物組織用PHEM溶液洗滌的方式為將所述消化后的植物組織浸沒在所述PHEM溶液中。

上述方法中，

所述固定采用的固定液由戊二醛、多聚甲醛和所述PHEM溶液組成，

所述戊二醛和所述多聚甲醛的配比為4-8ml：4-8g；

或所述固定液由體積百分含量為4-8％戊二醛、質(zhì)量百分比為4-8％多聚甲醛和所述PHEM溶液組成。

上述方法中，

所述固定的溫度為0-4℃，所述固定的時間為10-16小時；

或所述消化的時間為6-8小時；

或所述洗滌的方式為洗滌3-5次，每次5-10分鐘；

或所述浸沒處理的時間為5-10，所述浸沒處理的方式為每隔1天更換一次所述透明液。

上述方法中，

所述植物組織為長度為0.5-1cm²的植物葉片或0.5-1cm長的植物組織。

本發(fā)明第二個目的是提供一種植物組織的顯微觀察方法。

本發(fā)明提供的方法，包括上述步驟A。

本發(fā)明第三個目的是提供一種植物組織顯微鏡檢測的試劑盒。

本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述的步驟A的所述PHEM溶液和/或所述透明液。

本發(fā)明提供的植物組織的顯微觀察方法，其具有以下優(yōu)點：1)操作簡單、快速：縮短了酶解和透明等前期處理的時間；2)固定處理后再使用氫氧化鉀進行消化，避免了酶解或其它操作，節(jié)省了成本；3)透明效果好，與熒光染色和標記操作兼容性好：可通過熒光染色在熒光顯微鏡下清晰地觀測到植物深層組織的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

實驗證明，采用本發(fā)明提供的方法對植物組織進行顯微觀察，觀察深度顯著提高；纖維素酶等的用量減少，達到節(jié)省成本的目的；為深入研究植物基因表達模式和深層組織結(jié)構(gòu)提供了重要工具。由此可見，消化處理結(jié)合透明技術(shù)對植物深層組織進行顯微觀察的方法為高等植物表型鑒定以及基因表達模式的深入研究奠定了基礎，尤其在植物深層組織結(jié)構(gòu)進行觀察的研究中發(fā)揮重要作用，實際應用價值高。

附圖說明

圖1為在熒光顯微鏡下觀察到的擬南芥葉片中Remorin1.2蛋白的分布情況。

圖2為在普通光學顯微鏡下觀察到的沙蔥葉片中葉綠體的分布情況。

圖3為在熒光顯微鏡下觀察到的煙草葉片中Remorin蛋白的分布情況。

圖4為對比例在熒光顯微鏡下觀察到的煙草葉片情況。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所述百分含量如無特別說明均為質(zhì)量百分含量。

實施例1、擬南芥葉片的透明處理及顯微鏡觀測

一、葉片的透明處理所需試劑

固定液由戊二醛、多聚甲醛和PHEM溶液組成，其中戊二醛的體積百分比為4％，多聚甲醛的質(zhì)量百分比為4％。

PHEM溶液由終濃度為40mM PIPES、15mM HEPES、5mM EGTA、1mM MgCl₂和水組成，pH值為6.9；

透明液由終濃度為4M尿素、20％丙三醇(體積百分比)、體積百分比0.1％Triton X-100和PHEM溶液組成。

二、擬南芥葉片的透明處理及顯微鏡觀測

1、擬南芥葉片的透明處理

將擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)種子種植于1/2MS培養(yǎng)基上，0-4℃春化兩天后，置23±2℃培養(yǎng)箱中萌發(fā)，五天后移至培養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)20-30天，于抽臺前剪取蓮座葉葉片。

1)將上述蓮座葉葉片切成0.5cm²見方的小塊，用去離子水洗滌至去除雜質(zhì)；

2)將步驟1)獲得的0.5cm²見方的小塊轉(zhuǎn)移至固定液中浸沒，得到固定后擬南芥葉片；固定的溫度為4℃，固定的時間為12小時；固定采用搖床轉(zhuǎn)速50rpm，旋轉(zhuǎn)半徑為50mm。

3)將固定后擬南芥葉片置于質(zhì)量百分比10％的氫氧化鉀水溶液中浸沒，消化，消化時間為4小時，得到消化后的擬南芥葉片；

4)將消化后的擬南芥葉片在上述PHEM溶液浸沒5分鐘，重復3次，得到洗滌后的擬南芥葉片；

5)將洗滌后的擬南芥葉片在透明液中浸沒進行透明處理3天，每隔1天更換一次透明液；得到透明后的擬南芥葉片。

2、顯微鏡觀測

將上述1得到的透明后的擬南芥葉片在激發(fā)波長為488nm的熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖1所示，從圖1中可以觀察到表皮細胞和葉肉細胞，可以看出擬南芥葉片中Remorin蛋白主要分布在細胞質(zhì)膜，可見細胞內(nèi)部存在少量小泡狀結(jié)構(gòu)。

實施例2、沙蔥葉肉細胞中葉綠體的分布

一、葉片的透明處理所需試劑

固定液由戊二醛、多聚甲醛和PHEM溶液組成，其中戊二醛的體積百分比為4％，多聚甲醛的質(zhì)量百分比為8％。

PHEM溶液由終濃度為60mM PIPES、25mM HEPES、10mM EGTA、2mM MgCl₂和水組成，pH值為6.9；

透明液由終濃度為6M尿素、30％丙三醇(體積百分比)、體積百分比0.1％Triton X-100和PHEM溶液組成。

二、沙蔥葉片的透明處理及顯微鏡觀測

將沙蔥培養(yǎng)至20-30cm高,取幼苗的地上部分；

1)將上述沙蔥葉片切成0.8cm長的小段，用去離子水洗滌至去除葉片上的土和其他雜質(zhì)；

2)將步驟1)獲得的20段沙蔥葉片轉(zhuǎn)移至固定液中浸沒；固定采用搖床轉(zhuǎn)速50rpm，旋轉(zhuǎn)半徑為50mm。

固定的溫度為4℃，固定的時間為12小時。

3)將固定后擬南芥葉片置于質(zhì)量百分比10％的氫氧化鉀水溶液中浸沒，消化，消化時間為8小時，得到消化后的沙蔥葉片；

4)將消化后的沙蔥葉片在上述PHEM溶液中浸沒5分鐘，重復3次，得到洗滌后的沙蔥葉片；

5)將洗滌后的沙蔥葉片在透明液中浸沒進行透明處理5天，每隔1天更換一次透明液，得到透明后的沙蔥葉片。

2、顯微鏡觀測

將上述1得到的透明后的沙蔥葉片在激發(fā)波長為488nm的熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖2所示，從圖2中可以觀察到表皮細胞和葉肉細胞，沙蔥葉肉細胞中葉綠體排列緊密，其間分布有少量氣孔。

實施例3、煙草葉肉細胞中REMORIN蛋白的分布

一、葉片的透明處理所需試劑

固定液由戊二醛、多聚甲醛和PHEM溶液組成，其中戊二醛的體積百分比為5％，多聚甲醛的質(zhì)量百分比為5％。

PHEM溶液由終濃度為60mM PIPES、20mM HEPES、10mM EGTA、2mM MgCl₂和水組成，pH值為6.9；

透明液由終濃度為6M尿素、20％丙三醇(體積百分比)、體積百分比0.1％Triton X-100和PHEM溶液組成。

二、煙草葉片的透明處理及顯微鏡觀測

將煙草種子于20-25℃下催芽，種子萌發(fā)后，置25±2℃溫室中花卉土種植，培養(yǎng)至株高5-10cm。

1)將攜帶REMORIN2基因的農(nóng)桿菌菌種振蕩培養(yǎng)至OD值為0.8(檢測波長660nm)，6000rpm室溫離心3分鐘收集菌體，以煙草葉片注射緩沖液重懸菌體；

2)將步驟1)獲得的菌液以1mL注射器注射至煙草葉片中，將上述煙草幼苗置25±2℃溫室中繼續(xù)培養(yǎng)36小時；

3)將上述注射后的葉片切成0.5cm²見方的小塊，用去離子水洗滌至去除雜質(zhì)；

4)將步驟1)獲得的0.5cm²見方的小塊轉(zhuǎn)移至固定液中浸沒，得到固定后煙草葉片；

固定的溫度為4℃，固定的時間為12小時，固定采用搖床轉(zhuǎn)速50rpm，旋轉(zhuǎn)半徑為50mm；

5)將固定后的煙草葉片置于質(zhì)量百分比10％的氫氧化鉀水溶液中浸沒，消化；消化時間為6小時，得到消化后的煙草葉片；

6)將消化后的煙草葉片在上述PHEM溶液浸沒5分鐘，重復3次，每次5分鐘，得到洗滌后的煙草葉片；

7)將洗滌后的煙草葉片在透明液中浸沒進行透明處理5天，每隔1天更換一次透明液；得到透明后的煙草葉片。

2、顯微鏡觀測

將上述1得到的透明后的煙草葉片在激發(fā)波長為488nm的熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖3所示，從圖3中可以觀察到表皮下深層的葉肉細胞，煙草葉肉細胞中Remorin蛋白主要分布在細胞質(zhì)膜。

對比例：常規(guī)材料透明方法與熒光蛋白標記不兼容，不能用于觀察熒光蛋白表達，因而僅能觀察樣品厚度較薄的材料，厚度較大的樣品不能被照明，觀察厚度僅為30μm左右的幾層細胞。圖4為常規(guī)方法觀察厚度為100μm煙草葉片深層葉肉細胞的結(jié)果。

本發(fā)明中使用的方法與熒光蛋白標記相兼容，熒光信號可以保持數(shù)月，而且可以觀察到厚度為100μm左右的深層細胞。