本發明涉及植物組織培養，尤其是涉及一種苤藍組織培養快速繁殖方法。
背景技術：
苤藍(Brassica oleracea L.var.caulorapa DC.)，又名球莖甘藍、擘藍和芥藍頭等，是十字花科蕓薹屬二年生草本植物。原產于歐洲地中海至北海沿岸，由葉用甘藍變異而來，食用部分為膨大的肉質球莖。苤藍有很高的營養價值和藥用功效，不僅富含鈣、磷、鐵等微量元素，而且所含的硫代蘿卜素，能促進動物和人體細胞產生抗癌的酶。近期研究表明，苤藍皮作為吸附劑用于處理染料廢水，吸附過后可作無害化焚燒處理，避免產生二次污染，發展前景廣闊。
自然條件下，苤藍以種子繁殖，植株通過抽薹開花結子，不但生產周期較長，結實部位因繁殖生長而失去商品性，使其經濟效益下降。由于對高溫敏感，華南地區種植的苤藍在溫度較高的4～10月，常無法抽薹、不產生花粉，影響結實的產量；而且，苤藍未熟抽薹問題嚴重，不僅使商品球莖質量下降，而且造成種子不育、敗育，給種子生產造成重大損失。因此，在華南地區，苤藍的制種難度大、存在嚴重制約因素。
植物組織培養也叫植物離體培養或無菌培養，是根據植物細胞具有全能性的理論，在無菌條件下，將離體的植物器官誘導產生愈傷組織、不定芽、不定根，最后形成完整植株的一種技術。由于植物組織培養不受外在環境因子的影響可終年進行，并且可重復進行，所以能節省大量的時間和空間。組織培養再生植株為加速種苗的繁殖與推廣提供了有效手段。利用苤藍的有效組織快繁技術，可以克服苤藍的制種難題。
在華南地區種植苤藍，由于對高溫、高濕敏感，在春、夏、秋季，苤藍肉質球莖常發生軟腐病，大規模種植苤藍也存在困難。因此，選擇高抗“軟腐病”、生長期短、品質優良的品種，則是在華南地區的優先種植品種。篩選出的優良品種，則需通過無性繁殖方式才能保存其優良品質。
倪春鋒等(倪春鋒、蔣明、胡齊贊，紫苤藍組織培養快繁技術，浙江農業科學，2010(3))應用紫苤藍種子無菌萌發苗的葉柄、胚軸、子葉、葉柄和葉片為外植體材料，成功進行愈傷組織誘導培養，并且報道葉柄的出愈率最高，達96％。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種苤藍組織培養快速繁殖方法。
本發明包括以下步驟：
1)采用苤藍球莖頂端簇生葉的基部芽叢和球莖側葉基部腋芽作為外植體，留取部分膨大塊莖，去除葉片后清洗；
在步驟1)中，所述清洗可先用水沖洗，再用50％洗潔精進行超聲清洗，最后用水將洗潔精洗凈。
2)試材移至超凈工作臺，將清洗后的苤藍組織小塊消毒；
在步驟2)中，所述消毒的具體方法可為：將清洗后的苤藍組織小塊浸于75％乙醇消毒30s，無菌水沖洗3遍，瀝干水分，再浸于加2滴吐溫80的0.1％升汞中消毒5～10min，取出無菌水沖洗3～5遍，再瀝干水分。
3)將經過消毒的帶頂芽或腋芽的苤藍莖塊切成組織小塊作為外植體，接種于培養基中進行愈傷誘導；
在步驟3)中，所述切成組織小塊可切成1.0～1.5cm組織小塊；所述培養基的組成可為改良MS培養基+細胞分裂素6-芐基腺嘌呤(6-BA)(1.0～2.0)mg/L+生長素a-萘乙酸(NAA)(0.1～0.5)mg/L+蔗糖(25～30)g/L+瓊脂(6.5～8)g/L，培養基的pH值為(5.8～6.2)愈傷誘導；所述愈傷誘導的條件可為：培養周期(10～20)d，培養溫度(20～26)℃，光照強度1500lux左右，光照時間12h/d。
4)愈傷形成后，移入增殖培養基中培養，使誘導芽形成，叢芽增殖；
在步驟4)中，所述增殖培養基的組成可為：改良MS培養基+細胞分裂素6-芐基腺嘌呤(6-BA)(1.0～2.0)mg/L+生長素a-萘乙酸(NAA)(0.1～0.5)mg/L+蔗糖(25～30)g/L+瓊脂(6.5～8)g/L，培養基的pH值為5.8～6.2；所述培養的條件可為培養周期(20～30)d，培養溫度(20～26)℃，光照強度2500lux，光照時間12h/d。
5)將步驟4)得到的誘導芽和叢芽進行生根培養；
在步驟5)中，所述生根培養的生根培養基的組成可為：改良MS培養基+細胞分裂素6-芐基腺嘌呤(6-BA)(0.05～0.1)mg/L+生長素a-萘乙酸(NAA)(0.1～0.5)mg/L+蔗糖(15～25)g/L+瓊脂(6.5～8)g/L，培養基的pH值為5.8～6.2；所述生根培養的條件可為：培養周期(10～20)d，培養溫度(20～26)℃，光照強度2500lux，光照時間12h/d。
6)當幼苗的根系長出3～4根、長度為2～3cm，幼苗形體已顯健壯時，將幼苗取出，在清水中洗凈附著在根上的培養基，將洗凈的幼苗排好，用清水噴濕，然后分別以珍珠巖和腐殖土為基質進行煉苗后，將幼苗移栽定植即可。
在步驟6)中，所述煉苗的條件可在溫度20～25℃，濕度60％～80％的條件下煉苗7～15d。
本發明提供一種更適于苤藍增殖生長的改良MS培養基，改變了其中的大量元素的組成和含量，減少了基本培養基中鹽分的總摩爾數，提高了外植體的增殖率，消除了植株玻璃化現象。以植株基部芽叢或球莖側葉基部腋芽作為外植體材料，適用于新品種選育、優良單株或無性系保育、雄性不育株的保存與利用等方面，可大量、快速獲得無性組培苗，應用于商業化生產。
與倪春鋒等人在《浙江農業科學》2010年第3期發表的《紫苤藍組織培養快繁技術》相比，本發明具有以下優點：
1)本發明的材料是以成株的頂芽或腋芽為外植體，倪春鋒等人以種子無菌萌發苗為材料。
2)本發明不需要倪春鋒等人提出的種子培養過程。
3)本發明的愈傷和增殖培養基是改良MS基本培養基(4/5大量元素)+6-BA1.0～2.0mg/L+NAA0.1～0.5mg/L+蔗糖25～30g/L+瓊脂6.5～8g/L，倪春鋒等人報道的愈傷培養基是MS+6-BA 4mg/L+NAA 0.02mg/L；本發明的生根培養基是改良MS基本培養基+6-BA 0.05-0.1mg/L+NAA0.1-0.5mg/L+蔗糖15-25g/L+瓊脂6.5-8g/L；倪春鋒等人報道的生根培養基是MS+6-BA 4mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L；倪春鋒等人的增殖和生根培養基區別，是NAA濃度的變化；本發明的增殖和生根培養基區別，是6-BA和蔗糖的濃度變化。
4)本發明解決苤藍成年植株的組織培養問題，而倪春鋒等人研究是解決紫苤藍(苤藍的一個品種)種子無菌苗組織培養問題。
本發明以苤藍芽點為外植體，誘導愈傷組織，進而分化誘導叢生芽的形成，在大量繁殖后，進行煉苗移栽。采用本發明植物組織培養法外植體繁殖系數高，短時間(30天)內便可獲得大量優質種苗，同時減少了基本培養基中鹽分的總摩爾數，不但可以解決長期瓶苗轉接的瓶苗質量退化問題，而且能夠有效防止瓶苗玻璃化現象的發生，盡早播種還降低了田間栽培的早抽薹現象。
本發明的有益效果是：
1)高效性：本發明可快速獲得苤藍的大量組培苗，能滿足大量生產的需要。
2)周期短：利用本發明組織培養的苤藍組培苗，成苗和采收周期短，煉苗后種植40－50天便可采收球莖。
3)技術先進性：本發明中提供一種更適于苤藍增殖生長的改良MS培養基，改變了其中的大量元素的組成和含量，減少了基本培養基中鹽分的總摩爾數，提高了外植體的增殖率，消除了植株玻璃化現象。
4)取材容易：本發明采用苤藍的芽點作為外植體，對于所有的苤藍植株均適用，普遍性強，取材容易。
5)適用性廣：本發明適用于變異植株的保存、新品種的選育、優良單株或無性系的保育、雄性不育株的保存和利用，適用性廣。
具體實施方式
以下實施例對本發明作進一步說明。
實施例1
一、采用苤藍球莖頂端簇生芽叢作為外植體，留取部分塊莖，去除葉片，清水(自來水)下沖洗10min，在超聲波清洗機中加洗潔精進行清洗10min，用清水將洗潔精洗凈。
二、試材移至超凈工作臺，將清洗完成的苤藍組織小塊浸于75％乙醇消毒30s，無菌水沖洗3遍，瀝干水分，再浸于加2滴吐溫80的0.1％升汞中消毒8min，取出無菌水沖洗5遍，瀝干水分備用；
三、將經過消毒的帶頂芽的苤藍莖塊切成0.5～1.0cm組織小塊作為外植體，接種于改良MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖25g/L+瓊脂7g/L，培養基的pH值為6.0進行愈傷誘導。培養周期15d，培養溫度25℃左右，光照強度1500lux左右，光照時間12h/d。
四、愈傷組織形成后，移入增殖培養基，增殖培養基為改良MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.3mg/L+蔗糖25g/L+瓊脂7g/L，培養基的pH值為6.0，誘導芽形成及叢芽的增殖；培養周期15天，培養溫度20～26℃，光照強度2500lux，光照時間12h/d。
五、生根培養基選用改良MS培養基+細胞分裂素6-芐基腺嘌呤(6-BA)(0.05～0.1)mg/L+生長素a-萘乙酸(NAA)0.1mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂7g/L，培養基的pH值為6.0，培養周期15d，培養溫度20～26℃，光照強度1500lux，光照時間12h/d。
六、當幼苗的根系長出3～4根、長度為2～3cm，幼苗形體已顯健壯時，將幼苗取出，在清水中洗凈附著在根上的培養基，然后以珍珠巖︰腐殖土＝1︰1為基質，在溫度25℃左右，濕度60％～80％的條件下煉苗15～30d，將幼苗移栽定植即可。
實施例2
一、以苤藍球莖上的腋芽作為外植體，留取部分塊莖及葉柄，去除葉片，清水(自來水)下沖洗5min，在超聲波清洗機中加50％洗潔精進行清洗10min，用清水將洗潔精洗凈。
二、試材移至超凈工作臺，將清洗完成的苤藍組織小塊浸于75％乙醇消毒30s，無菌水沖洗3遍，瀝干水分，再浸于加2滴吐溫80的0.1％升汞中消毒5min，取出無菌水沖洗5遍，瀝干水分備用。
三、將經過消毒苤藍腋芽莖塊切成1.0～1.5cm組織小塊作為外植體，接種于進行愈傷誘導及叢生芽培養。培養周期15d，培養溫度25℃左右，光照強度2500lux左右，光照時間12h/d。
四、將苤藍叢生芽單株分離，回接原誘導培養基，即改良MS+6-BA 1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖25g/L+瓊脂7g/L，培養基的pH值為5.8～6.2，進行重復增殖培養，培養周期15天，培養溫度20～26℃，光照強度2500lux，光照時間12h/d。
五、選用單株莖直立粗壯，且幼苗的根系長出3～4根、長度為2～3cm的植株，將幼苗取出，在清水中洗凈附著在根上的培養基，然后以珍珠巖︰腐殖土＝1︰1為基質，在溫度25℃左右，濕度60％～80％的條件下煉苗7～15d，將幼苗移栽定植即可。