專利名稱：一株降解金霉素的木霉菌lj245的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株能降解金霉素的木霉菌LJ245,屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
金霉素為廣譜型抗生素，主產(chǎn)我國。在金霉素發(fā)酵生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量金霉素菌渣和廢水。菌渣中因含有金霉素殘留等原因，被國家列入《國家危險廢物名錄》，只能采用焚燒和填埋方法處置。焚燒需耗費大量能源，而且燃燒氣體有可能造成二次污染。填埋則需要占用大量土地，且存在著抗生素物質(zhì)發(fā)生滲露的潛在風險，對環(huán)境及人類健康構(gòu)成潛在危害。廢水中殘留的金霉素，若排入周邊水體和土壤，會對水體和土壤中的多種微生物產(chǎn)生抑制作用，破壞水體生態(tài)環(huán)境，影響土壤的養(yǎng)分循環(huán)，甚至有可能誘導出耐藥性菌及耐藥基因。因此，金霉素廢棄物中抗生素殘留的去除問題已成為我國環(huán)境熱點問題之一，也是金霉素生產(chǎn)企業(yè)亟待解決的棘手問題。利用生物降解金霉素殘留是一種高效、快速、經(jīng)濟、安全和具有良好應(yīng)用前景的一種污染處理方法。目前，國內(nèi)外對金霉素高效降解菌株的篩選與利用高效菌株降解金霉素殘留的研究剛剛起步，報導極少。2005年，何瑜利用篩選得到一株紅曲霉B3菌株對金霉素生產(chǎn)廢水進行了降解率研究，在以金霉素為唯一碳源條件下，其降解率為10%左右；在添加其它碳源和最適條件下培養(yǎng)，其對金霉素的降解率可達到51. 5%。本專利涉及的菌株 LJ245為哈茨木霉(Hypocrea lixii),而有關(guān)哈茨木霉Hypocrea Iixii具有降解金霉素功能的研究，國內(nèi)外尚未見到報導。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株金霉素降解菌株LJ245。本發(fā)明所提供的金霉素降解菌株LJ245,為哈茨木霉(Hypocrea lixii)。該菌株于 2012年2月14日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)， 保藏號CGMCC No. 5753。該菌株rDNA-ITS全序列如下CCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAAC60
TGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCC120
GGAGGACCAACCAAAACTCTTTTTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTATAATCTGAGCCT180
TCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTT240
GGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTC300
AGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCT360
GTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCT420
GCCTCTTGGCGGTGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCG480
CAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACT540
TCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA598 上述rDNA-ITS序列全長598個核苷酸。
本發(fā)明中的菌株LJ245的菌落形態(tài)為菌株LJ245在馬丁氏平板培養(yǎng)基上生長快，菌絲層較厚，呈白色柔毛狀，平坦，初期為白色，后期因產(chǎn)生分生孢子而呈黃綠色，產(chǎn)孢區(qū)常排列成同心輪紋狀。菌絲透明，有隔， 分生孢子梗由菌絲直立生出，無色，分生孢子球形。本發(fā)明中的菌株LJ245可以在以金霉素為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長，尤其是在金霉素濃度為O. Olg/L-5. 00g/L的低、中濃度條件下生長較好，可最大限度降低金霉素殘留量；菌株LJ245在以金霉素唯一碳源且金霉素含量為4. Og/L的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),該菌株對金霉素的降解率可達35. 19%。本發(fā)明中的菌株LJ245對金霉素生產(chǎn)廢水中的金霉素有很好的去除效果，接種菌株LJ245于金霉素生產(chǎn)廢水中培養(yǎng)4天，廢水中金霉素去除率比對照提高了 36. 38%。本發(fā)明中的菌株LJ245接種到pH約為2. O的新鮮菌渣中，能快速生長，耐酸性能高，在室溫條件下，對菌渣中金霉素的降解率可達到50. 09%。本發(fā)明的有益效果菌株LJ245具有降解菌渣與廢水中殘留金霉素的作用，可應(yīng)用于金霉素生產(chǎn)企業(yè)廢棄物的處理，也可望應(yīng)用于金霉素污染環(huán)境的生物修復(fù)。特別是菌株LJ245在金霉素為唯一碳源且金霉素濃度為O. 01g/L的低濃度條件下能夠很好生長，對最大限度地降低金霉素殘留具有重要作用。菌株LJ245使用方便，還可作為金霉素降解菌劑的制備原料。


圖I為金霉素降解菌株LJ245的基因組DNA凝膠電泳圖(從左向右第一泳道為 Marker，第二泳道、第三泳道為LJ245的基因組DNA)；圖2為金霉素降解菌株LJ245的rDNA-ITS片段PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖(從左向右第一泳道為Marker，第二泳道為LJ245的ITS序列的PCR產(chǎn)物)；圖3為金霉素降解菌株LJ245的菌落形態(tài)圖；圖4為金霉素降解菌株LJ245的顯微形態(tài)圖。
具體實施例方式實施例I—、一株金霉素降解菌株LJ245的篩選方法I、材料準備菌樣品來源采自金霉素生產(chǎn)企業(yè)含活性污泥的廢水。培養(yǎng)基無機鹽固體培養(yǎng)基(NH4)2S04 2. 0g, K2HPO4 O. 5g，KH2PO4 O. 5g，MgSO4 · 7H200. 5g， NaCl 0. 2g, CaCl2 0. IgjFeSO4 0. 01g,EDTA 0. 015g，瓊脂 13g，葡萄糖 2g/L，溶于 1000ml 蒸懼水中。115 °C濕熱滅菌20min后,添加2. Og/L金霉素。馬丁氏培養(yǎng)基蛋白胨6g，葡萄糖 10g，KH2PO4 I. 0g, MgSO4 · 7H20 0. 5g，溶于 1000ml蒸懼水中。115°C濕熱滅菌20min。活性測定培養(yǎng)基(NH4)2S042. 0g, K2HPO4O. 5g, KH2PO4O. 5g, MgSO4 · 7H20 0. 5g, NaCl
0.2g, CaCl2O. lg, FeSO4O. Olg, EDTA 0. 015g，溶于 1000ml 蒸餾水中。115°C濕熱滅菌 20min后，添加4g/L金霉素。2、實驗儀器與設(shè)備島津LC-20A高效液相色譜儀，UNICO UV-2600A紫外可見光分光光度計，Mettler Toledo ML204 分析天平、Mettler Toledo pH 計、YT-CJ-IND 超凈工作臺、HZQ-F160 全溫振蕩培養(yǎng)箱、TG16-W高速離心機、YX-280D手提式壓力蒸汽滅菌器、Nicon Eclipse 80i熒光顯微鏡、DNA Engine PCR儀、DcodeTM變性梯度凝膠電泳儀、DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱、 BOSCH冰箱、Champ Gel-3200凝膠成像系統(tǒng)等。3、菌株篩選操作步驟如下I)菌株分離與純化 采用平板劃線法進行分離與純化。吸取400 μ L含活性污泥廢水樣，涂布于無機鹽固體培養(yǎng)基平板上，置于28-30°C條件下遮光培養(yǎng)2-7天，得到不同菌落。然后，挑起單菌落，在無機鹽固體培養(yǎng)基上劃線進一步分離與純化。此步驟重復(fù)1-2次，直至得到單一菌落。2)初篩將步驟I)得到單一菌落依次在以金霉素為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基平板上劃線，28-30°C，培養(yǎng)2-6天。保存能夠生長的菌株。3)復(fù)篩將步驟2)得到菌株接入馬丁氏培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)，然后將活化的菌液按2% 的接種量轉(zhuǎn)接到的活性測定培養(yǎng)基中，28-300C，170r/min震蕩暗培養(yǎng)，第3天和6天用高效液相色譜法測定各菌株對金霉素的降解率，獲得了降解率較高菌株LJ245。二、金霉素降解菌株LJ245的分子生物學鑒定鑒定步驟如下I、基因組DNA的提取菌絲體DNA的提取采用CTAB法，具體方法如下I)菌種活化配制馬鈴薯汁培養(yǎng)基，分裝高壓滅菌，吸取500 μ L甘油管中保藏菌種至三角瓶中，28°C，170r/min培養(yǎng)24h。再將活化菌種轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)基中28°C，170r/min 培養(yǎng)48h。2)將步驟I)培養(yǎng)的菌球放入研缽中用液氮充分研磨，將研磨后的粉末轉(zhuǎn)入新的
I.5ml EP 管中，加 600 μ I 65°C 的 CTAB 于水浴鍋中 65°C保溫 15_30min。3)向EP管中加等體積(600 μ I)氯仿/異戊醇混合液(24 I)，使之充分混勻， 4°C, 10000r/min離心5min,取上清液至新EP管中。4)向上清中加入1/10體積的3M NaAc和2. 5倍體積的無水乙醇，-20 V沉淀 IOmin0 4°C，10000r/min 離心 5min,棄上清。5) 70%冰乙醇(或無水乙醇)500 μ I洗滌DNA2-3次(洗滌時輕轉(zhuǎn)EP管)，倒置晾干，加入100 μ I I X TE溶解。6)用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測。7)凝膠成像系統(tǒng)觀測，照相。圖I為菌株LJ245基因組DNA的凝膠電泳圖(從左向右第一泳道為Marker，第二泳道、第三泳道為LJ245的基因組DNA)。-20°C或_70°C保存提取的DNA。2、ITS區(qū)序列擴增「采用通用引物ITSl和ITS4，對菌株LJ245的rDNA基因的ITS片段進行PCR 擴增。PCR擴增序列采用50 μ L反應(yīng)體系Mix 25yL，引物ITSl(10mmol/L)lyL，引物 ITS4 (IOmmoI/L) I μ L,模板(約 25mmol/L) 2 μ L, ddH20 21 μ L。PCR 反應(yīng)條件為94 °C 預(yù)熱 5min，94 °C 30S, 55 °C 45S, 72 °C Imin，循環(huán) 30 次， 72°C IOmin0擴增后的PCR產(chǎn)物通過I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用凝膠成像系統(tǒng)照相。圖 2為金霉素降解菌株LJ245的rDNA-ITS片段PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖(從左向右第一泳道為 LJ245的ITS序列的PCR產(chǎn)物，第二泳道為Marker)；3、ITS區(qū)序列的測定將擴增的ITS序列送北京諾賽基因組研究中心測序，得到菌株LJ245的ITS全序列如下CCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAAC60
TGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCC120
GGAGGACCAACCAAAACTCTTTTTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTATAATCTGAGCCT180
TCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTT240
GGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTC300
AGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCT360
GTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCT420
GCCTCTTGGCGGTGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCG480
CAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACT540
TCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA598三、菌落形態(tài)特征觀察菌株LJ245在馬丁氏平板培養(yǎng)基上生長快，30°C培養(yǎng)三天，菌絲可鋪滿整個平板， 菌絲層較厚，呈白色柔毛狀，平坦，后期產(chǎn)孢子，孢子為黃綠色，產(chǎn)孢區(qū)排列成同心輪紋狀， 菌落背面白色。顯微鏡觀察菌絲透明，有隔，菌絲分枝多且不規(guī)則，整體像樹枝，菌絲間相互交叉覆蓋。分生孢子梗由菌絲直立生出，無色，孢子梗瓶形，基部細，中間膨大。分生孢子球形。金霉素降解菌株LJ245菌落形態(tài)和顯微形態(tài)見圖3和圖4。四、菌株LJ245鑒定為一種新功能菌株將測序結(jié)果與NCBI中的GenBank進行Blast比對,得到菌株LJ245與Hypocrea lixii的ITS序列的同源性為100%。根據(jù)菌株LJ245ITS序列分析結(jié)果以及形態(tài)特征，將其鑒定為哈茨木霉(Hypocrea lixii)。該菌株已于2012年2月14日保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心(簡稱CGMCC)，保藏號CGMCC No. 5753，保藏日期為2012年2月14 日。目前，國內(nèi)外尚沒有文獻報導Hypocrea Iixii具有降解金霉素的功能。因此，LJ245為一種新功能菌株。實施例2菌株LJ245對金霉素為唯一碳源的利用與降解實驗制備以金霉素為唯一碳源且金霉素濃度分別為O. 01g/L,0. 05g/L,0. 10g/L, O. 50g/L，5. OOg/L, 10. OOg/L, 15. OOg/L的無機鹽固體培養(yǎng)基。挑取LJ245菌落少許，在無機鹽固體培養(yǎng)基平板上劃線，置于30°C條件下避光培養(yǎng)2-6天。經(jīng)觀察得知，在培養(yǎng)第2 天，在金霉素濃度為O. 01g/L, O. 05g/L, O. lg/L，O. 5g/L和5. Og/L的培養(yǎng)基平板上長出了菌絲，且生長良好。說明菌株LJ245可以對極低濃度O. O lg/L至中濃度5. Og/L金霉素起到較好的利用與降解效果。菌株LJ245能夠利用低濃度乃至貧營養(yǎng)級濃度的金霉素，可以最大限度地降低金霉素殘留量。將菌株LJ245接入以金霉素為唯一碳源且金霉素含量為4. Og/L的無機鹽液體培養(yǎng)基中，進行搖瓶培養(yǎng)，定時取樣測定培養(yǎng)液中金霉素含量。測定方法為，取ImL培養(yǎng)液,加入5mL的甲醇，8000r/min離心5min,取上清液用22 μ m的濾膜過濾,通過高效液相色譜儀測定和計算得知LJ245對金霉素的降解率可達35. 19%。實施例3 菌株LJ245對金霉素廢水處理實驗用馬丁氏培養(yǎng)基對菌株LJ245進行活化培養(yǎng)，然后按照1%的接種量加入金霉素企業(yè)生產(chǎn)廢水中，并以不接種微生物的原廢水作為對照，分別置于28°C，170r/min的搖床中培養(yǎng)4天，測定廢水中金霉素的殘留量。經(jīng)測定得知，接種菌株LJ245對金霉素去除率比對照提高了 36. 38%。實施例4
菌株LJ245對金霉素菌渣處理實驗
I)菌渣處理
用馬丁氏培養(yǎng)基活化菌株LJ245，按3%的接種量接種到菌渣中，室溫條件下進行暗培養(yǎng)。
2)菌渣中金霉素提取與測定
準確稱取上述處理后的菌渣少許，用提取液充分提取。提取液組成為丙酮鹽酸
溶液(4mol/L):水=13 : I : 6。提取液經(jīng)8000r/min離心5min后,取上清液,用22 μ m 的濾膜過濾后，用高效液相色譜儀測定濾液中金霉素含量，LJ245在第5天對金霉素的降解率為 50. 09%。
權(quán)利要求
1.一株降解金霉素的木霉菌LJ245，其特征在于通過基因組DNA提取、rDNA-ITS序列擴增與比對，菌株LJ245為哈茨木霉(Hypocrea lixii)，CGMCCNo. 5753。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一株降解金霉素的木霉菌LJ245，其特征在于菌株LJ245的菌落形態(tài)為菌絲層較厚，呈白色柔毛狀，平坦，初期為白色，后期因產(chǎn)生分生孢子而呈黃綠色，產(chǎn)孢區(qū)常排列成同心輪紋狀；菌絲透明，有隔，分生孢子梗由菌絲直立生出，無色，分生孢子球形。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一株降解金霉素的木霉菌LJ245的基因，其特征在于ITS序列全長598個核苷酸，菌株的ITS全序列如下CCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAAC60TGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCC120GGAGGACCAACCAAAACTCTTTTTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTATAATCTGAGCCT180TCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTT240GGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTC300AGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCT360GTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCT420GCCTCTTGGCGGTGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCG480CAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACT540TCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA598上述rDNA-ITS序列全長598個核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一株降解金霉素的木霉菌LJ245的基因，其特征在于采用 BLAST分析法，對菌株LJ245的rDNA-ITS基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比較分析發(fā)現(xiàn)，菌株 LJ245 與 Hypocrea Iixii 的同源性為 100%
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一株降解金霉素的木霉菌LJ245的應(yīng)用，其特征在于該菌株LJ245用于金霉素的降解中。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一株降解金霉素的木霉菌LJ245的應(yīng)用，其特征在于將菌株接種于以金霉素為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中，其對金霉素的降解率達到35. 19%。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一株降解金霉素的木霉菌LJ245的應(yīng)用，其特征在于菌株 LJ245對金霉素生產(chǎn)廢水中的金霉素有很好的去除效果，接種菌株LJ245于金霉素生產(chǎn)廢水中培養(yǎng)4天，廢水中金霉素去除率比對照提高了 36. 38%。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一株金霉素降解菌株LJ245的應(yīng)用，其特征在于將菌株接種在pH為2. O的新鮮菌渣中，在室溫條件下，其對菌渣中金霉素的降解率達到50. 09%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株能降解金霉素的木霉菌LJ245，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。經(jīng)rDNA-ITS全序列測定，該菌株為哈茨木霉(Hypocrea lixii)，保藏編號為CGMCC No.5753。該菌株生長快，菌絲呈白色柔毛狀，后期因產(chǎn)生分生孢子而呈黃綠色；顯微觀察菌絲有隔，分生孢子梗由菌絲直立生出，無色，分生孢子球形。菌株LJ245具有降解菌渣與廢水中殘留金霉素的作用，可應(yīng)用于金霉素生產(chǎn)企業(yè)廢棄物的處理，也可望應(yīng)用于金霉素污染環(huán)境的生物修復(fù)，特別是在金霉素為唯一碳源，且金霉素濃度為0.01g/L的低濃度條件下仍然能夠很好生長，對最大限度地降低金霉素殘留具有重要作用。同時，該菌株使用方便，還可作為金霉素降解菌劑的制備原料。
文檔編號C12N15/11GK102604841SQ20121004993
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月29日
發(fā)明者張晴雯, 張愛平, 李艷菊, 楊世琦, 楊正禮, 肖思穎 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所, 北京理工大學