本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型石斛培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是蘭科石斛屬多年生附生草本植物，是一種名貴的中藥材，具有悠久的應(yīng)用歷史，被列為九大仙草之首，是藥中黃金。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載：“石斛除痹下氣，補五臟虛勞羸瘦，強陰益精，久服厚腸胃”。金元四大名醫(yī)之一朱丹溪稱石斛有卓著的滋陰健陽功效，并且在中醫(yī)補陰藥物中，石斛是獨樹一幟的。古往今來石斛被稱為滋陰補腎、養(yǎng)生保健之上品，一年四季皆可服用，且對各臟器的陰虛之證有通補之效。長期的臨床試驗和科學研究的結(jié)果表明石斛具有補陰強身、健壯筋骨，延緩衰老、潤膚養(yǎng)顏，治療眼疾、降低血糖、滋養(yǎng)肝陰、利膽溶石等多種功效，同時這些功效與石斛中所含的豐富的營養(yǎng)成分密切相關(guān)，現(xiàn)代醫(yī)學研究表明：鐵皮石斛中所含有的石斛多糖，氨基酸、生物堿及菲類化合物等具有較高的醫(yī)療保健作用，能夠提高機體免疫力。
長期以來，應(yīng)用鐵皮石斛主要以采集野生資源為主。近年來，隨著人們對鐵皮石斛藥用價值認識的日益提高，鐵皮石斛的需求量也不斷提高，傳統(tǒng)的野生資源已不能滿足人們的需求量，甚至有些地區(qū)的野生資源面臨枯竭。為了更好地保護和利用鐵皮石斛資源，越來越多的科研工作者開始響應(yīng)國家號召，開始關(guān)注于鐵皮石斛的研發(fā)工作，包括鐵皮石斛人工馴化栽培，無性繁殖等，鐵皮石的組織培養(yǎng)技術(shù)是鐵皮石斛繁殖的一種重要手段，也是大力推廣鐵皮石斛種植、繁殖苗木的關(guān)鍵途徑，但是一般組織培養(yǎng)過程中幼苗生長周期較長，消耗大量資源，增加組培生產(chǎn)成本，且所得的培育的過程中容易發(fā)生病蟲害，所得的石斛品質(zhì)也很難保證。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新型石斛培養(yǎng)方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
一種新型石斛培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
S1、將成熟鐵皮石斛種子置于浸種劑消毒浸泡20～40min，所述浸種劑由以下重量份的原料制備而成：
0.1-0.3份MnSO4粉末、0.05-0.15份CuSO4粉末、0.1-0.3份ZnSO4粉末、0.2-0.4份NiSO4粉末、0.2-0.5份(NH4)6Mo7O24.4H2O粉末、3～5份多菌靈、10～20份EM原露100倍稀釋液；
S2、將消毒浸種完成后的種子播種于自制培養(yǎng)基中培養(yǎng)15-20天，經(jīng)過種胚膨大、萌發(fā)形成綠色圓球莖；培養(yǎng)條件為27-30℃，光照為1800-2300lx，光照時間為13-14h/d；
S3、將圓球莖轉(zhuǎn)入加蕨根發(fā)酵粉的自制培養(yǎng)基中培養(yǎng)23-28天，使得圓球莖堆積在培養(yǎng)基中，并出現(xiàn)葉原基和分化苗；培養(yǎng)條件：溫度25-26℃，光照度1700-2100lx，光照時間為13-14h/d；
S4、將圓球莖分化苗用清水沖洗后轉(zhuǎn)入改良1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-30天，經(jīng)誘導產(chǎn)生葉原基；
S5、將步驟S4中產(chǎn)生的小苗轉(zhuǎn)入改良MS培養(yǎng)基中進行壯苗，經(jīng)過60-70天壯苗培養(yǎng)，高度達到1.5-2.5cm的幼苗出現(xiàn)，培養(yǎng)條件：溫度25-26℃，光照度1700-2100lx，光照時間為13-14h/d；
S6、將步驟S5得到的幼苗轉(zhuǎn)入加花寶1號和2號的改良培養(yǎng)基進行誘導生根；
S7、將步驟S6得到的生根苗進行煉苗馴化。
優(yōu)選地，所述自制培養(yǎng)基通過以下步驟制備所得：
步驟一、取苔蘚泥炭土36-48份、酒糟8-10份、樹皮塊18-22份、硝酸鉀0.5-0.9份、碳酸鈣纖維2-3份、蔗糖1-2份、磷酸二氫鉀0.5-1.5份、尿素0.2-0.4份、醋糟8-12份、豆餅粉8-12份分別進行粉碎后混合攪拌均勻，加水，使其含水量達60％-70％，攪拌20-40分鐘，pH控制在7.0-7.5，其顆粒大小在5mm以下，顆粒粗細度均勻；
步驟二、將拌勻后的原料堆積發(fā)酵，做成高1.1-1.3米、底寬1.3-1.7米、長度不限的梯形堆，在其上打一些通氣孔，發(fā)酵9-10天，發(fā)酵結(jié)束后再加入適量的水，拌勻，調(diào)節(jié)含水量在60-70％之間；
步驟三、常壓下先將溫度升至110-115℃，保溫20-25min；然后將溫度上升至120-125℃，保溫60-70min；再將溫度升至130-145℃，在壓力為0.13-0.14MPa的情況下保溫60-70min，最后再悶置30-35min，停止加熱，讓其自然冷卻到25℃以下，得自制培養(yǎng)基。
優(yōu)選地，所述加蕨根發(fā)酵粉的自制培養(yǎng)基由以下重量份的原料制備而成：
苔蘚泥炭土36-48份、酒糟8-10份、樹皮塊18-22份、硝酸鉀0.5-0.9份、碳酸鈣纖維2-3份、蔗糖1-2份、磷酸二氫鉀0.5-1.5份、尿素0.2-0.4份、醋糟8-12份、豆餅粉8-12份、蕨根發(fā)酵粉為10-20份。
優(yōu)選地，所述步驟S4中的改良1/2MS培養(yǎng)基的配方為硝酸鉀19000mg/L、硝酸銨16500mg/L、磷酸二氫鉀1700mg/L、氨基酸螯合鎂3700mg/L、碘酸鈣4400mg/L、碘化鉀166mg/L、硼酸1240mg/L、硫酸錳2230mg/L、硫酸鋅860mg/L、鉬酸鈉50mg/L、硫酸銅5mg/L、三氯化六氨合鈷5mg/L、硫酸亞鐵2780mg/L、乙二胺四乙酸二鈉3730mg/L、肌醇20000mg/L、甘氨酸400mg/L、鹽酸硫胺素100mg/L、鹽酸吡哆醇100mg/L、煙酸100mg/L、蕨根發(fā)酵粉15g/L、蔗糖30g/L、瓊脂6.5-8g/L。
優(yōu)選地，所述步驟S5中的改良MS培養(yǎng)基的配方為：硝酸鉀38000mg/L、硝酸銨33000mg/L、磷酸二氫鉀3400mg/L、氨基酸螯合鎂7400mg/L、碘酸鈣8800mg/L、碘化鉀166mg/L、硼酸1240mg/L、硫酸錳4460mg/L、硫酸鋅1720mg/L、鉬酸鈉50mg/L、硫酸銅5mg/L、三氯化六氨合鈷5mg/L、硫酸亞鐵5560mg/L、乙二胺四乙酸二鈉7460mg/L、肌醇20000mg/L、甘氨酸400mg/L、鹽酸硫胺素100mg/L、鹽酸吡哆醇100mg/L、煙酸100mg/L、NAA6ml/L、蕨根發(fā)酵粉15g/L、蔗糖30g/L、瓊脂6.5-8g/L。
優(yōu)選地，所述步驟S6中的加花寶1號和2號的改良培養(yǎng)基的配方為：花寶1號2000mg/L、花寶2號2000mg/L、肌醇20000mg/L、甘氨酸400mg/L、鹽酸硫胺素100mg/L、鹽酸吡哆醇100mg/L、煙酸100mg/L、碘酵母100g/L、NAA5ml/L、IBA5ml/L、蔗糖30g/L、瓊脂6.5-8g/L。
優(yōu)選地，所述蕨根發(fā)酵粉通過以下步驟制備所得：
將洗凈后的蕨根瀝干，置于汽爆罐內(nèi)，先通入氮氣至汽爆罐內(nèi)壓力為0.7-1.5MPa，爆破處理7-23min；然后迅速通入蒸汽至汽爆罐內(nèi)壓力為1.5-2.1MPa，蒸汽爆破處理0.8-2.8min后，按照接種量1.5-1.7％的比例接種微生物發(fā)酵劑，保持溫度25-35℃，發(fā)酵48-54小時后，高溫滅菌，冷凍干燥，得蕨根發(fā)酵粉。
本發(fā)明具有以下有益效果：
本發(fā)明通過優(yōu)化和改進各個步驟的培養(yǎng)基對鐵皮石斛組織培養(yǎng)，可促進種子萌發(fā)并縮短萌發(fā)時間，為種子萌發(fā)提供充足的營養(yǎng)，鐵皮石斛萌發(fā)率高，且萌發(fā)時間短，加快了組培苗的生長速率，減少時間消耗，降低成本，且提高了所得鐵皮石斛的品質(zhì)。
具體實施方式
為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
本發(fā)明實施例提供了一種新型石斛培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
S1、將成熟鐵皮石斛種子置于浸種劑消毒浸泡20～40min，所述浸種劑由以下重量份的原料制備而成：
0.1-0.3份MnSO4粉末、0.05-0.15份CuSO4粉末、0.1-0.3份ZnSO4粉末、0.2-0.4份NiSO4粉末、0.2-0.5份(NH4)6Mo7O24.4H2O粉末、3～5份多菌靈、10～20份EM原露100倍稀釋液；
S2、將消毒浸種完成后的種子播種于自制培養(yǎng)基中培養(yǎng)15-20天，經(jīng)過種胚膨大、萌發(fā)形成綠色圓球莖；培養(yǎng)條件為27-30℃，光照為1800-2300lx，光照時間為13-14h/d；
S3、將圓球莖轉(zhuǎn)入加蕨根發(fā)酵粉的自制培養(yǎng)基中培養(yǎng)23-28天，使得圓球莖堆積在培養(yǎng)基中，并出現(xiàn)葉原基和分化苗；培養(yǎng)條件：溫度25-26℃，光照度1700-2100lx，光照時間為13-14h/d；
S4、將圓球莖分化苗用清水沖洗后轉(zhuǎn)入改良1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-30天，經(jīng)誘導產(chǎn)生葉原基；
S5、將步驟S4中產(chǎn)生的小苗轉(zhuǎn)入改良MS培養(yǎng)基中進行壯苗，經(jīng)過60-70天壯苗培養(yǎng)，高度達到1.5-2.5cm的幼苗出現(xiàn)，培養(yǎng)條件：溫度25-26℃，光照度1700-2100lx，光照時間為13-14h/d；
S6、將步驟S5得到的幼苗轉(zhuǎn)入加花寶1號和2號的改良培養(yǎng)基進行誘導生根；
S7、將步驟S6得到的生根苗進行煉苗馴化。
所述自制培養(yǎng)基通過以下步驟制備所得：
步驟一、取苔蘚泥炭土36-48份、酒糟8-10份、樹皮塊18-22份、硝酸鉀0.5-0.9份、碳酸鈣纖維2-3份、蔗糖1-2份、磷酸二氫鉀0.5-1.5份、尿素0.2-0.4份、醋糟8-12份、豆餅粉8-12份分別進行粉碎后混合攪拌均勻，加水，使其含水量達60％-70％，攪拌20-40分鐘，pH控制在7.0-7.5，其顆粒大小在5mm以下，顆粒粗細度均勻；
步驟二、將拌勻后的原料堆積發(fā)酵，做成高1.1-1.3米、底寬1.3-1.7米、長度不限的梯形堆，在其上打一些通氣孔，發(fā)酵9-10天，發(fā)酵結(jié)束后再加入適量的水，拌勻，調(diào)節(jié)含水量在60-70％之間；
步驟三、常壓下先將溫度升至110-115℃，保溫20-25min；然后將溫度上升至120-125℃，保溫60-70min；再將溫度升至130-145℃，在壓力為0.13-0.14MPa的情況下保溫60-70min，最后再悶置30-35min，停止加熱，讓其自然冷卻到25℃以下，得自制培養(yǎng)基。
所述加蕨根發(fā)酵粉的自制培養(yǎng)基由以下重量份的原料制備而成：
苔蘚泥炭土36-48份、酒糟8-10份、樹皮塊18-22份、硝酸鉀0.5-0.9份、碳酸鈣纖維2-3份、蔗糖1-2份、磷酸二氫鉀0.5-1.5份、尿素0.2-0.4份、醋糟8-12份、豆餅粉8-12份、蕨根發(fā)酵粉為10-20份。
所述步驟S4中的改良1/2MS培養(yǎng)基的配方為硝酸鉀19000mg/L、硝酸銨16500mg/L、磷酸二氫鉀1700mg/L、氨基酸螯合鎂3700mg/L、碘酸鈣4400mg/L、碘化鉀166mg/L、硼酸1240mg/L、硫酸錳2230mg/L、硫酸鋅860mg/L、鉬酸鈉50mg/L、硫酸銅5mg/L、三氯化六氨合鈷5mg/L、硫酸亞鐵2780mg/L、乙二胺四乙酸二鈉3730mg/L、肌醇20000mg/L、甘氨酸400mg/L、鹽酸硫胺素100mg/L、鹽酸吡哆醇100mg/L、煙酸100mg/L、蕨根發(fā)酵粉15g/L、蔗糖30g/L、瓊脂6.5-8g/L。
所述步驟S5中的改良MS培養(yǎng)基的配方為：硝酸鉀38000mg/L、硝酸銨33000mg/L、磷酸二氫鉀3400mg/L、氨基酸螯合鎂7400mg/L、碘酸鈣8800mg/L、碘化鉀166mg/L、硼酸1240mg/L、硫酸錳4460mg/L、硫酸鋅1720mg/L、鉬酸鈉50mg/L、硫酸銅5mg/L、三氯化六氨合鈷5mg/L、硫酸亞鐵5560mg/L、乙二胺四乙酸二鈉7460mg/L、肌醇20000mg/L、甘氨酸400mg/L、鹽酸硫胺素100mg/L、鹽酸吡哆醇100mg/L、煙酸100mg/L、NAA6ml/L、蕨根發(fā)酵粉15g/L、蔗糖30g/L、瓊脂6.5-8g/L。
所述步驟S6中的加花寶1號和2號的改良培養(yǎng)基的配方為：花寶1號2000mg/L、花寶2號2000mg/L、肌醇20000mg/L、甘氨酸400mg/L、鹽酸硫胺素100mg/L、鹽酸吡哆醇100mg/L、煙酸100mg/L、碘酵母100g/L、NAA5ml/L、IBA5ml/L、蔗糖30g/L、瓊脂6.5-8g/L。
所述蕨根發(fā)酵粉通過以下步驟制備所得：
將洗凈后的蕨根瀝干，置于汽爆罐內(nèi)，先通入氮氣至汽爆罐內(nèi)壓力為0.7-1.5MPa，爆破處理7-23min；然后迅速通入蒸汽至汽爆罐內(nèi)壓力為1.5-2.1MPa，蒸汽爆破處理0.8-2.8min后，按照接種量1.5-1.7％的比例接種微生物發(fā)酵劑，保持溫度25-35℃，發(fā)酵48-54小時后，高溫滅菌，冷凍干燥，得蕨根發(fā)酵粉。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。