本發明涉及組織培養
技術領域：
，特別涉及一種大花月季組織培養的培養基及方法。
背景技術：
：大花月季，別名香水月季、壯花月季、觀賞月季，是薔薇屬植物，適宜在陽光充足、空氣流通的環境中生長，它對土壤要求不嚴。品種眾多，是現代月季的主體部分。其特征是：植株健壯，單朵或群花，花朵大，花型高雅優美，花色眾多、鮮艷明快，具有芳香氣味，觀賞性強。主產地為河南省南陽市，山東、云南、江蘇、北京、上海等地也有生產。大花月季比較常見的繁殖方式是嫁接、扦插。月季嫁接苗的優點是月季嫁接苗一般比扦插苗生長快3倍以上，當年就可以發育成粗壯的大株，開出標準的花朵。缺點是壽命較短，5年以上植株開始衰老，而且經常萌發砧芽。月季扦插苗的優點是扦插苗屬無性繁殖，取其枝條便可生根形成一個獨立的個體，其性狀與母本的花色，株形，習性表現一致。但有些品種的月季很難扦插生根，或根系不發達。大花月季的組織快繁技術，在保持母本的優良性狀基礎上，并能快速、大量成苗。大花月季組培的關鍵技術就是月季外植體的消毒殺菌，及不同階段培養基的選擇。公開號為CN102422815A的中國專利公開了一種以大花香水月季莖段為外植體的植株再生方法，通過對大花香水月季中部枝條，切段、滅菌后進行繼代培養一個月，再將大花香水月季無菌苗的葉片橫切數刀，接種到愈傷誘導培養基上，待長出胚性愈傷組織，再在分化培養基上培養待胚性愈傷組織分化出不定芽，然后接種到壯苗培養基上，長高后接種到生根培養基上培養即形成完整植株。公開號為CN105309306A的中國專利公開了一種香水月季擴繁技術，包括：剪取香水月季的健壯枝條中部，剪成帶芽的小段1～3cm長；用牙刷粘洗衣粉輕輕刷去莖段表面的泥漬，置于流水沖洗45min，置于無菌環境下用75％酒精浸泡15～30s，并用無菌水沖洗一遍；次氯酸鈉溶液消毒后，切去莖段頭尾兩端，接種于含有6-BA、NAA的MS培養基上，然后在增殖、壯苗、生根、開花培養基上培養。但采用上述分化、繼代及生根培養基對大花月季進行組織培養的誘導分化率、外植體增殖系數及生根率較低。因此，研發一種可提高大花月季誘導分化率、外植體增殖系數及生根率的組織培養的培養基具有重要的現實意義。技術實現要素：有鑒于此，本發明提供了一種大花月季組織培養的培養基及方法。該培養基配方可顯著提高大花月季的誘導分化率、外植體增殖系數及生根率。為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：本發明提供了一種大花月季組織培養的培養基，包括分化培養基、繼代培養基和生根培養基；分化培養基為：含有0.5～2.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、0.1～0.3mg/LTDZ、20～30g/L蔗糖和7～8g/L瓊脂的MS培養基，pH值為5.8；繼代培養基為：含有1.0mg/L6-BA和0.1～0.5mg/LNAA、20～30g/L蔗糖和7～8g/L瓊脂的MS培養基，pH值為5.8；生根培養基為：含有0.2～1.0mg/LNAA、20～30g/L蔗糖和7～8g/L瓊脂的MS培養基，pH值為5.8。6-BA是6-芐氨基腺嘌呤，為人工合成細胞分裂素，具有抑制植物葉內葉綠素、核酸、蛋白質分解，保綠防老；氨基酸、生長素、無機鹽等向處理部位調運等多種效能，廣泛用農業、樹和園藝作物從發芽收獲各階段。萘乙酸(1-Naphthylaceticacid)，簡稱NAA，是一種有機化合物，它是植物生長調節劑中的生長素類似物，常用于商用的發根粉或發根劑中，在植物使用扦插法繁殖時使用。它也可用于植物組織培養。其是廣譜型植物生長調節劑，能促進細胞分裂與擴大，誘導形成不定根增加座果，防止落果，改變雌、雄花比率等。可經葉片、樹枝的嫩表皮，種子進入到植株內，隨營養流輸導到全株。塞苯隆，英文通用名thidiazuron，其他名稱：脫葉靈、脫葉脲、Dropp、TDZ，是一種新型高效的細胞分裂素用于組培能更好的促進植物的芽分化。本發明將上述3種激素以特定比例添加到MS培養基中，制得分化培養基、繼代培養基和生根培養基，對大花月季外植體進行組織培養時，可顯著提高大花月季的誘導分化率、增殖系數及生根率，效果好于現有報道的培養基種類。優選地，本發明提供的分化培養基為：含有1.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、0.1～0.3mg/LTDZ、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂的MS培養基；繼代培養基為：含有1.0mg/L6-BA、0.3mg/LNAA、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂的MS培養基；生根培養基為：含有0.6mg/LNAA、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂的MS培養基。更優選地，分化培養基為：含有1.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、0.2mg/LTDZ、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂的MS培養基；繼代培養基為：含有1.0mg/L6-BA、0.3mg/LNAA、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂的MS培養基；生根培養基為：含有0.6mg/LNAA、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂的MS培養基。本發明還提供了一種大花月季的組織培養方法，包括如下步驟：將大花月季外植體接種到分化培養基，誘導帶腋芽的外植體分化；待腋芽長至4～6cm，切成帶腋芽的莖段，轉接到繼代培養基進行繼代培養；待外植體粗壯后轉接到生根培養基進行生根培養，得到組培苗；分化培養基為：含有0.5～2.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、0.1～0.3mg/LTDZ、20～30g/L蔗糖和7～8g/L瓊脂的MS培養基，pH值為5.8；繼代培養基為：含有1.0mg/L6-BA和0.1～0.5mg/LNAA、20～30g/L蔗糖和7～8g/L瓊脂的MS培養基，pH值為5.8；生根培養基為：含有0.2～1.0mg/LNAA、20～30g/L蔗糖和7～8g/L瓊脂的MS培養基，pH值為5.8。優選地，本發明提供的分化培養基為：含有1.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、0.1～0.3mg/LTDZ、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂的MS培養基；繼代培養基為：含有1.0mg/L6-BA、0.3mg/LNAA、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂的MS培養基；生根培養基為：含有0.6mg/LNAA、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂的MS培養基。更優選地，分化培養基為：含有1.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、0.2mg/LTDZ、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂的MS培養基；繼代培養基為：含有1.0mg/L6-BA、0.3mg/LNAA、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂的MS培養基；生根培養基為：含有0.6mg/LNAA、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂的MS培養基。在本發明提供的一些實施例中，將大花月季外植體接種到分化培養基之前還包括：采取大花月季枝條進行消毒處理，切成1～1.5cm的帶腋芽的莖段，得到大花月季外植體。作為優選，大花月季外植體的采取時間為每年4月上旬至5月上旬。采摘的時間早，外植體太嫩，后期組培瓶苗長勢弱，采摘時間晚，外植體木質化，接種后易長菌且生長緩慢。作為優選，大花月季外植體選擇幼嫩的枝條，避免采取花芽、腋芽已經開始分化的外植體。作為優選，消毒處理具體為：將大花月季枝條用水和NaClO溶液清洗，然后用酒精和HgCl溶液消毒，再用水清洗。作為優選，NaClO溶液的質量百分濃度0.1％，浸泡時間為30min；酒精的體積百分濃度為75％，酒精消毒的時間為2min；HgCl溶液的質量百分濃度為0.1％，HgCl溶液的消毒時間為30s。作為優選，大花月季組織培養的光照周期為12h/d，光照強度為2500～3500lx，培養溫度為24～26℃，相對濕度為45％～50％，每3d用紫外燈滅菌10～15min。優選地，大花月季組織培養的光照周期為12h/d，光照強度為3500lx，培養溫度為25℃，相對濕度為65％，每3d用紫外燈滅菌15min。作為優選，得到組培苗后還包括煉苗的步驟。在本發明提供的實施例中，煉苗為：取出組培苗，洗掉根部附著的培養基，晾干水分后栽植至培養土中，噴施含有多菌靈和代鋅蒙森混合液，放置背光處，覆膜保濕，保持溫度在15～20℃之間；待長出新葉后將苗挪至向陽處，并逐漸去掉覆膜，30d后轉入正常養護。本發明提供了一種大花月季組織培養的培養基及方法。該大花月季組織培養的培養基包括分化培養基、繼代培養基和生根培養基；分化培養基為：含有0.5～2.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、0.1～0.3mg/LTDZ、20～30g/L蔗糖和7～8g/L瓊脂的MS培養基，pH值為5.8；繼代培養基為：含有1.0mg/L6-BA和0.1～0.5mg/LNAA、20～30g/L蔗糖和7～8g/L瓊脂的MS培養基，pH值為5.8；生根培養基為：含有0.2～1.0mg/LNAA、20～30g/L蔗糖和7～8g/L瓊脂的MS培養基，pH值為5.8。本發明至少具有如下優勢之一：采用本發明提供的培養基配方可顯著提高大花月季的誘導分化率、外植體增殖系數及生根率，利用植物組織培養的方法，使具有優良性狀的大花月季得以快速繁殖；本發明首次對大花月季的取材及消毒方法進行了改進，降低了接種的污染率。具體實施方式本發明公開了一種大花月季組織培養的培養基及方法，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。本發明提供的大花月季組織培養的培養基及方法中所用培養基組分均可由市場購得。6-BA是6-芐氨基腺嘌呤，細胞分裂素，稱0.1g6-BA溶于20ml1mol/L的NaOH中，再用容量瓶定容到100ml，倒到瓶中，放在冰箱備用；NAA是萘乙酸，0.1gNAA溶于20ml水中，再用容量瓶定容到100ml，倒到瓶中，放在冰箱備用；TDZ是噻苯隆，植物生長調節劑，具有很強的細胞分裂素活性，稱0.1gTDZ溶于20ml1mol/L的NaOH中，完全溶解后再用容量瓶定容到100ml，倒到瓶中，放在冰箱備用。上述三種激素都可以高溫蒸汽滅菌。下面結合實施例，進一步闡述本發明：實施例11、生長環境(1)采用MS固體培養基，其中再加瓊脂質量濃度7g/L，蔗糖質量濃度30g/L，pH值為5.8，所配培養基經過高壓高溫蒸汽滅菌(溫度126℃，0.145MPa，5min)。(2)組培室，光照時間12h/d，光照強度3500lx，培養溫度為25℃，相對濕度65％，每3d用紫外燈滅菌15min。MS培養基高壓蒸汽滅菌時，采用溫度126℃，5min，不同于傳統的121℃，30min。經過此法滅菌的培養基在經過7天的光照培養箱(38℃，無光照)培養后，發現并未出現菌落。證明此種條件下，完全可以達到滅菌效果。試驗所用滅菌鍋功率為2kw，對比傳統方法節省時間0.5h，每次滅菌可節省1度電。2、大花月季外植體的采取(1)采取時間為3月20日到5月31日之間。(2)采取時，選擇幼嫩無病蟲害的枝條。(3)避免采取頂芽是花芽的或者側芽是花芽的外植體，腋芽已經開始分化的外植體也不要。外植體采集時間的確認，本申請從3月20日開始到5月31日進行連續接種試驗，以下是大花月季接種后第5天的染菌情況：表1大花月季接種后第5天的染菌情況從表中可以看出，在4月1日到5月10日這期間的大花月季帶腋芽的莖段接種后，染菌率在5％以下，且通過觀察，大花月季組培苗長勢快，且后期生長良好。3、正常環境的清洗殺菌(1)大花月季外植體采回后，摘去葉片，留下腋芽，莖上皮刺不需做其他處理。(2)將大花月季切成帶腋芽的小段。(3)外植體用雙層紗布包住，在流水下沖洗30min。(4)之后在0.1％NaClO中浸泡30min。4、無菌環境中消毒殺菌(1)外植體在無菌工作臺內用75％酒精浸泡2min，這之間要不停的晃動。(2)之后用0.1％HgCl消毒30s。(3)消毒完成后，用無菌水沖洗6遍，每次浸泡時間要求長于3min。用此種方法消毒，0.1％NaClO、75％酒精、0.1％HgCl等消毒液可反復利用，出現明顯渾濁物時重新配置。5、大花月季的接種(1)在無菌工作臺內，將消毒好的大花月季帶腋芽外植體下端切掉，切成1-1.5cm的小段。(2)將切好的小段接種到固體培養基中，每瓶1個外植體。6、培養基的選擇(1)誘導帶腋芽的外植體分化時，用MS+6-BA0.5～2.0mg/L+NAA0.1mg/L+TDZ0.1～0.3mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH5.8的培養基。誘導帶腋芽的外植體分化時，采用MS培養基，6-BA的濃度分別取0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L，TDZ分別取0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L，NAA加0.1mg/L，外植體接到以上12種培養基中后，每5天觀察記錄生長情況，以下是25d后的生長狀況：表2誘導帶腋芽的外植體分化后的生長狀況處理1234567891011126-BA(mg/L)0.50.50.51.01.01.01.51.51.52.02.02.0TDZ(mg/L)0.10.20.30.10.20.30.10.20.30.10.20.3莖長(cm)3.22.43.75.65.86.34.74.94.15.14.94.6增殖系數1116.77.67.1111111大花月季外植體接在MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+TDZ0.1～0.3mg/L的培養基上生長最好，由于培養基中加入了TDZ，在誘導分化時，其中MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+TDZ0.2mg/L的增殖系數出現高達7.6的情況。(2)待腋芽長至4～6cm時，約25天左右，將芽切下來，再切成帶腋芽的小段，用繼代培養基MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1～0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH5.8。繼代培養基采用MS培養基，6-BA1.0mg/L，NAA取0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L，經過20d的培養，觀察莖段粗度為：表3繼代培養20d的莖段粗度處理12345NAA(mg/L)0.10.20.30.40.5莖段粗度(cm)0.50.61.20.80.4可見MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L的莖段最粗，為1.2cm。(3)約20d后，等外植體粗壯后轉入生根培養基MS+NAA0.2～1.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH5.80中培養，長出須根后，即可進入煉苗期。生根培養時，用傳統的1/2MS+NAA0.1～0.5mg/L、1/2MS+IBA0.1～0.5mg/L培養基時，大花月季組培苗會出現葉片干枯掉落，經過30d觀察，發現沒有生根的現象。本技術用MS+NAA0.2～1.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH5.8，做生根培養基，NAA分別取0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L，經過20d的培養觀察，試驗結果如下：表4生根培養試驗結果處理12345NAA(mg/L)0.20.40.60.81.0生根率(％)27％85％100％72％10％上述試驗結果表明，配方為MS+NAA0.6mg/L，生根率達100％，葉片正常生長，且莖段下能長出根原基，正常長出5～7條須根。7、煉苗取出大花月季組培苗，洗掉根部附著的培養基，晾干水分后栽植至培養土中，噴施含有多菌靈和代鋅蒙森混合液，放置背光處，覆膜保濕，保持溫度在15～20℃之間；待長出新葉后將苗挪至向陽處，并逐漸去掉覆膜，30d后轉入正常養護。實施例21、生長環境(1)采用MS固體培養基，其中再加瓊脂質量濃度7g/L，蔗糖質量濃度30g/L，pH值為5.8，所配培養基經過高壓高溫蒸汽滅菌(溫度126℃，0.145MPa，5min)。(2)組培室，光照時間12h/d，光照強度3500lx，培養溫度為25℃，相對濕度65％，每3d用紫外燈滅菌15min。MS培養基高壓蒸汽滅菌時，采用溫度126℃，5min，不同于傳統的121℃，30min。經過此法滅菌的培養基在經過7天的光照培養箱(38℃，無光照)培養后，發現并未出現菌落。證明此種條件下，完全可以達到滅菌效果。試驗所用滅菌鍋功率為2kw，對比傳統方法節省時間0.5h，每次滅菌可節省1度電。2、大花月季外植體的采取(1)采取時間為4月10日。(2)采取時，選擇幼嫩無病蟲害的枝條。(3)避免采取頂芽是花芽的或者側芽是花芽的外植體，腋芽已經開始分化的外植體也不要。3、正常環境的清洗殺菌(1)大花月季外植體采回后，摘去葉片，留下腋芽，莖上皮刺不需做其他處理。(2)將大花月季切成帶腋芽的小段。(3)外植體用雙層紗布包住，在流水下沖洗30min。(4)之后在0.1％NaClO中浸泡30min。4、無菌環境中消毒殺菌(1)外植體在無菌工作臺內用75％酒精浸泡2min，這之間要不停的晃動。(2)之后用0.1％HgCl消毒30s。(3)消毒完成后，用無菌水沖洗5-6遍，每次浸泡時間要求長于3min。用此種方法消毒，0.1％NaClO、75％酒精、0.1％HgCl等消毒液可反復利用，出現明顯渾濁物時重新配置。5、大花月季的接種(1)在無菌工作臺內，將消毒好的大花月季帶腋芽外植體下端切掉，切成1-1.5cm的小段。(2)將切好的小段接種到固體培養基中，每瓶1個外植體。6、培養基的選擇(1)誘導帶腋芽的外植體分化試驗組1：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+TDZ0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH5.8；試驗組2：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+TDZ0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH5.8；試驗組3：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+TDZ0.3mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH5.8；對照組1：MS+NAA0.1mg/L+GA31.0mg+TDZ1.0mg/L+30g/L葡萄糖+3.0g/L植物凝膠，pH5.8；(CN102422815A中實施例4公開的分化培養基)對照組2：MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.1mg/L+1.5％的蔗糖+0.75％瓊脂；(CN105309306A中實施例1公開的分化培養基)外植體接到上述培養基中后，每5天觀察記錄生長情況，以下是25d后的生長狀況：表5誘導帶腋芽的外植體分化后的生長狀況組別莖長(cm)增殖系數試驗組15.66.7試驗組25.87.6試驗組36.37.1對照組12.35.6對照組24.16.2大花月季外植體接在試驗組1～3的培養基上生長最好，且增殖系數較對照組兩個較高。(2)待腋芽長至4～6cm時，約25天左右，將芽切下來，再切成帶腋芽的小段，用繼代培養基培養。試驗組1：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH5.8；對照組1：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.02mg/L+GA30.3mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6.2g/L，pH值6.0；(CN102422815A中實施例4公開的繼代培養基)對照組2：MS+IBA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+1.5％的蔗糖+0.75％瓊脂；(CN105309306A中實施例1公開的繼代培養基)經過20d的培養，觀察大花月季莖段粗度為：表6繼代培養20d的增殖系數組別莖段粗度(cm)試驗組11.2對照組10.8對照組21.0可見試驗組1的莖段粗度最粗，為1.2cm。(3)約20d后，等外植體粗壯后轉入生根培養基培養，長出須根后，即可進入煉苗期。試驗組1：MS+NAA0.6mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH5.8；對照組1：1/2MS+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6.5g/L，pH值6.1；(CN102422815A中實施例4公開的生根培養基)對照組2：1/2MS+1.5％的蔗糖+0.75％瓊脂+0.5g/L活性炭；(CN105309306A中實施例1公開的生根培養基)經過20d的培養觀察，試驗結果如下：表7生根培養試驗結果組別生根率(％)試驗組1100對照組117對照組223上述試驗結果表明，試驗組1的生根率達100％，葉片正常生長，且莖段下能長出根原基，正常長出5～7條須根。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。當前第1頁1 2 3