本發明涉及一種高密度生產棕色蘑菇液體菌種的方法。
背景技術：
棕色蘑菇(Agaricus brunnescens Peck)是蘑菇中的珍稀類品種，屬于擔子菌綱(Basidiomycotina)、傘菌目(Agaritales)、蘑菇科(Agaricaceae)、蘑菇屬(Agaricus)，也稱為棕蘑、變褐蘑菇、有色蘑菇、洋菇、美味蘑菇等。
棕色蘑菇菌蓋呈天然棕褐色，菌柄白色，因其菌蓋色澤而得名，該品種肉質致密、緊實、口感鮮嫩。棕色蘑菇與雙孢蘑菇相比，在菇質、抗性、營養等方面都具有一定的優勢。棕色蘑菇菇質結實、口感韌性強、香味濃郁，更接近于野生口蘑，與雙孢蘑菇相比，其菌蓋不會隨時間延長而氧化褐變導致商品性狀的下降，因此無需使用化學護色、漂白劑等處理，食品的營養和安全性更能得到保障。
由于消費需求，棕色蘑菇在國內外市場上的份額呈逐年增加的趨勢，在亞洲的日本、韓國也有栽培。在我國由于其色澤和氣味偏重，一直未被市場廣泛接受，僅有福建等地有少量栽培，產品均外銷。近些年來，由于棕色蘑菇抗病性強、耐儲存、保鮮期長、基本無農藥殘留等優勢，受到市場的歡迎，我國山東、新疆、湖北、寧夏、天津等地也開始進行種植。
棕色蘑菇的培養周期很長，大約6個月左右，因此大大影響了其工業化效率。為了縮短棕色蘑菇的培養周期，可以采用液態棕色蘑菇種子。液態棕色蘑菇種子與傳統麥粒種接種方式相比，可以縮短棕色蘑菇種子培育時間大約一個半月，因此在工業化生產中具有巨大的經濟價值。
因此本專利獲得的高密度生產棕色蘑菇液態菌種的方法具有廣闊的市場前景。
技術實現要素：
本發明的目的在于提出了一種新型的棕色蘑菇液態菌種的高密度生產方法。
本發明的目的通過以下技術方案實現：
一種棕色蘑菇液態菌種的高密度生產方法，包括以下步驟：
1)菌種活化：將棕色蘑菇菌種轉接入試管固體培養基斜面中，放入恒溫培養箱25℃培養至滿管。
2)種子液的制備：取3塊0.5cm2新鮮斜面菌種接種于種子培養基(100mL/500mL三角瓶)中，25℃，150r/min搖床培養5d。
所述斜面培養基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨2，磷酸二氫鉀1，七水硫酸鎂1.5，菜園土600，麥粒100，瓊脂25。
所述種子培養基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨2，磷酸二氫鉀2，七水硫酸鎂1，谷氨酰胺0.1。
所述發酵培養基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，磷酸二氫鉀2，七水硫酸鎂1。
以上培養基配好后，121℃滅菌20min。
3)高密度發酵棕色蘑菇液體菌種：采用5L全自動發酵罐，裝液量為3L，初始葡萄糖為50g/L，接種量3％，25℃；在發酵過程，通過自動控制流加2mol/L的氫氧化鈉將發酵過程的pH恒定為6.0；第一階段0-24h結合自動控制通氣量調整溶氧控制在50％，攪拌控制在100轉/分鐘，；第二階段24h之后停止攪拌，通過控制通氣量來實現溶氧控制，溶氧控制在30％，總培養時間100-160小時。
在pH恒定，二階式控制溶氧策略下，最大菌球數與不控制發酵參數相比提高了300％以上。
有益效果：
本發明利用低轉速攪拌結合通氣的方式進行高密度發酵，優點在于，棕色蘑菇的菌絲非常脆弱。前期實驗證明，轉速高于150轉/分鐘，不銹鋼攪拌槳會打碎棕色蘑菇菌絲，造成菌絲死亡，無法繼續生長。而0-24小時采用100轉/分鐘的攪拌速度既可以滿足菌絲生長的對氧氣、營養傳遞的需要，同時不至于大量打斷菌絲體，造成菌絲死亡。第二階段的培養過程中，由于對溶氧的需求較低，因此停止攪拌，僅通過控制通氣量邊可以實現溶氧控制。這樣既滿足了溶氧和營養傳遞的需要，又減少了菌絲的損傷，利于實現高密度培養；發酵過程中在pH恒定，二階式控制溶氧策略下，最大菌球數與不控制發酵參數相比提高了300％以上。
附圖說明
圖1為棕色蘑菇在二階式溶氧控制策略下MPN的動力學。
具體實施方式
下面的實施例可以使本領域技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
實施例1：
一種新型的棕色蘑菇液態菌種的高密度生產方法。包括以下步驟：
1)菌種活化：將棕色蘑菇菌種(中國農業微生物菌種保藏管理中心ACCC51579)轉接入試管固體培養基斜面中，放入恒溫培養箱25℃培養至滿管。
2)種子液的制備：取3塊0.5cm2新鮮斜面菌種接種于種子培養基(100mL/500mL三角瓶)中，25℃，150r/min搖床培養5d。
斜面培養基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨2，磷酸二氫鉀1，七水硫酸鎂1.5，菜園土600，麥粒100，瓊脂25。
種子培養基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨2，磷酸二氫鉀2，七水硫酸鎂1，谷氨酰胺0.1。
發酵培養基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，磷酸二氫鉀2，七水硫酸鎂1。
以上培養基配好后，121℃滅菌20min。
3)高密度發酵棕色蘑菇液體菌種：采用5L全自動發酵罐，裝液量為3L，初始葡萄糖為50g/L，接種量3％，25℃。在發酵過程，通過自動控制流加2mol/L的氫氧化鈉將發酵過程的pH恒定為6.0。第一階段0-24h溶氧控制在50％(攪拌控制在100轉/分鐘，結合自動控制通氣量調整溶氧。)，第二階段24h之后溶氧控制在30％，總培養時間120小時。
在pH恒定，二階式控制溶氧策略下，最大菌球數達到了116×103個/L，與不控制發酵參數相比，提高了338％。
實施例2
一種棕色蘑菇液態菌種的高密度生產方法，包括以下步驟：
菌種活化：將棕色蘑菇菌種(中國農業微生物菌種保藏管理中心ACCC51614)轉接入試管固體培養基斜面中，放入恒溫培養箱25℃培養至滿管。
種子液的制備：取3塊0.5cm2新鮮斜面菌種接種于種子培養基(100mL/500mL三角瓶)中，25℃，150r/min搖床培養5d。
斜面培養基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨2，磷酸二氫鉀1，七水硫酸鎂1.5，菜園土600，麥粒100，瓊脂25。
種子培養基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨2，磷酸二氫鉀2，七水硫酸鎂1，谷氨酰胺0.1。
發酵培養基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，磷酸二氫鉀2，七水硫酸鎂1。
以上培養基配好后，121℃滅菌20min。
高密度發酵棕色蘑菇液體菌種：采用5L全自動發酵罐，裝液量為3L，初始葡萄糖為50g/L，接種量3％，25℃，通氣量為1L/min發酵。在發酵過程，通過自動控制流加2mol/L的氫氧化鈉將發酵過程的pH恒定為6.0。第一階段0-24h溶氧控制在50％(攪拌控制在100轉/分鐘，結合自動控制通氣量調整溶氧。)，第二階段24h之后溶氧控制在30％，總培養時間100小時。
在pH恒定，二階式控制溶氧策略下，最大菌球數達到了111×103個/L，與不控制發酵參數相比，提高了338％。
實施例3
一種棕色蘑菇液態菌種的高密度生產方法，包括以下步驟：
菌種活化：將棕色蘑菇菌種(中國農業微生物菌種保藏管理中心ACCC52355)轉接入試管固體培養基斜面中，放入恒溫培養箱25℃培養至滿管。
種子液的制備：取3塊0.5cm2新鮮斜面菌種接種于種子培養基(100mL/500mL三角瓶)中，25℃，150r/min搖床培養5d。
斜面培養基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨2，磷酸二氫鉀1，七水硫酸鎂1.5，菜園土600，麥粒100，瓊脂25。
種子培養基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨2，磷酸二氫鉀2，七水硫酸鎂1，谷氨酰胺0.1。
發酵培養基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，磷酸二氫鉀2，七水硫酸鎂1。
以上培養基配好后，121℃滅菌20min。
高密度發酵棕色蘑菇液體菌種：采用5L全自動發酵罐，裝液量為3L，初始葡萄糖為50g/L，接種量3％，25℃，通氣量為1L/min發酵。在發酵過程，通過自動控制流加2mol/L的氫氧化鈉將發酵過程的pH恒定為6.0。第一階段0-24h溶氧控制在50％(攪拌控制在100轉/分鐘，結合自動控制通氣量調整溶氧。)，第二階段24h之后溶氧控制在30％，培養時間160小時。
在pH恒定，二階式控制溶氧策略下，最大菌球數達到了119×103個/L，與不控制發酵參數相比，提高了338％。