本發明涉及一種果樹生物殺蟲劑的制備方法，屬于殺蟲劑制備技術領域。
背景技術：
我國作為世界栽培植物的八大起源中心之一，果樹具有栽培歷史悠久、資源豐富、種類品種繁多等顯著特點，已成為我國農作物事業的重要組成部分，然而果樹是害蟲發生極為頻繁而且相當嚴重的植物之一，果樹種類多，品種復雜，又系多年生植物，為害蟲發生提供了較為穩定的生態環境，成為害蟲繁衍與爆發的有利場所，蟲害對果樹正常新陳代謝造成的干擾，導致果樹從生理機能到組織結構上發生一系列的變化和破壞，對果品質量和產量造成嚴重影響。隨著農業生態環境的改變，作物布局和產業結構的調整，果樹品種的更新，特別是外來品種、引進品種的推廣，使果園害蟲發生了極大變化，果農面臨害蟲侵襲的新挑戰。
現有的果樹殺蟲劑，大多常用單純的人工合成有機物質，屬于化學類殺蟲劑，這類殺蟲劑雖然藥效高，但是其長期使用，會使害蟲產生耐藥性，從而失去效果，并且其殘毒期長，大量農藥揮發到空氣中、流入水體中、沉降聚集在土壤中，污染農畜漁果產品，通過食物鏈的富集作用轉移到人體內，對農作物生長環境及人畜健康有不同程度的不良影響。目前，雖然許多天然無公害的殺蟲劑不斷開發出來，但是其藥效較低，殺蟲效果不夠理想。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題：針對傳統的果樹殺蟲劑長期使用后，會使害蟲產生耐藥性，失去殺蟲效果，且殘毒期長，嚴重影響作物生長環境和人畜健康的問題。本發明以果樹主根處土壤作為菌源，避免了對果樹的傷害，利用氧氣增加好氧菌的數量，利用藜蘆醇對好氧菌進行篩選，獲得目標混合菌種，對混合菌種進行優化篩選培養，以酪氨酸、卵磷脂作為篩選基質，對目標混合菌種進行篩選，再以害蟲脫皮粉末作為誘導營養物，對菌種進行誘導培養，獲得分解害蟲脫皮的酶，隨后與植物提取物混合，從而獲得果樹生物殺蟲劑。本發明以植物提取物破壞害蟲體內蛋白質的合成，以獲得酶分解害蟲形成的幾丁質，阻止害蟲脫皮變態過程，使其不能脫皮而死，從而有效解決了對傳統的果樹殺蟲劑長期使用后，會使害蟲產生耐藥性，失去殺蟲效果，且殘毒期長，嚴重影響作物生長環境和人畜健康的問題，本發明制備的果樹殺蟲劑不會使害蟲產生耐藥性，殺蟲效果好，且不含有有毒物質，不會對農作物生長和人畜健康產生影響。
為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：
（1）取距離果樹主根0.4～0.8cm處的土壤，并與其質量0.9～1.2倍的質量分數為6％的葡萄糖溶液混合，放入容器中，并將容器置于25～32℃條件下，靜置10～12h，每隔30～40min，從容器底部對容器內的混合物進行充氧，充氧速度為4mL/min，充氧時間為1～2min；
（2）在上述靜置結束后，向容器中加入上述葡萄糖溶液體積1.1～1.5％的藜蘆醇，使用攪拌器對容器中的混合物以150r/min攪拌4～6min，使用50目紗布對容器中的混合物進行過濾，收集過濾液，得混合菌懸液，備用；
（3）按重量份數計，取50～55份無菌水、20～23份蛋白胨、18～20份酵母浸膏、12～14份葡萄糖、3～6份酪氨酸、2～4份卵磷脂及1～3份磷酸氫二鉀，放入攪拌機中攪拌均勻，并將攪拌混合物放入高溫滅菌鍋中殺菌消毒，得營養液；
（4）按體積比1:3～1:6，將步驟（2）備用的混合菌懸液和營養液混合均勻，放入發酵罐中，設定溫度為25～32℃，以1.1m3/min速率向發酵罐中通入氧氣，以110r/min攪拌發酵7～8天，每隔50～60min中向發酵罐中加入營養液質量6～8％的害蟲脫皮粉末；
（5）在上述發酵結束后，對發酵罐中的發酵混合物進行過濾，收集過濾液，放入冷凍離心機中，設定溫度為2～4℃，以8000r/min離心5～10min，收集上層液，并將上層液進行冷凍濃縮，濃縮至原體積的70～75％，濃縮溫度為2～4℃，收集濃縮物；
（6）按質量比1:1:5，取鶴草芽、貫眾和0.8mol/L乙醇溶液放入蒸煮罐中，設定溫度為90～95℃，蒸煮4～6h，再自然冷卻至室溫，對蒸煮混合物進行過濾，收集過濾液，并將過濾液放入旋轉蒸發儀中去除乙醇，收集剩余液，按質量比1:4～1:6，將剩余液和上述濃縮物混合均勻，即可得果樹生物殺蟲劑。
所述的步驟（4）中害蟲脫皮粉末的制備方法為將害蟲脫皮放入45℃烘箱中干燥2～3h，再將干燥后的害蟲脫皮放入碾磨機中碾磨，過200目篩，收集過篩顆粒，即可。
所述的害蟲脫皮來自于果樹害蟲中鱗翅目害蟲和粉虱的脫皮。
所述的步驟（1）中果樹主根為蘋果樹主根、梨樹主根、桃樹主根、柿子樹主根及杏樹主根中的任意一種。
本發明的應用方法：本發明制備的果樹生物殺蟲劑適用于卷蛾科、螟蛾科、天蛾科等鱗翅目害蟲及粉虱。在果樹害蟲初發期，按質量比1:1000～1:2000，將本發明制備的果樹生物殺蟲劑與水進行混合均勻后，利用噴霧器，將殺蟲劑稀釋液均勻的噴灑于果樹的果實、枝、干、葉上，避免在大風天或預計1小時內有雨天使用。經檢測，本發明制備的果樹生物殺蟲劑藥效持效性達到40～45天，且殺蟲率達到98％以上，不會對作物生長和人體健康產生危害。
本發明與其他方法相比，有益技術效果是：
（1）本發明制備的果樹生物殺蟲劑藥效持效性達到40～45天，其長期使用后，不會使害蟲產生耐藥性，殺蟲率能達到98％以上，具有較高的殺蟲效果；
（2）本發明制備的果樹生物殺蟲劑中不含有有毒物質，不會對作物和人體健康產生危害，符合可持續發展的要求；
（3）本發明制備的果樹生物殺蟲劑制備步驟簡單，所需成本低，具有廣闊的應用前景。
具體實施方式
首先取距離果樹主根0.4～0.8cm處的土壤，并與其質量0.9～1.2倍的質量分數為6％的葡萄糖溶液混合，放入容器中，并將容器置于25～32℃條件下，靜置10～12h，每隔30～40min，從容器底部對容器內的混合物進行充氧，充氧速度為4mL/min，充氧時間為1～2min；在上述靜置結束后，向容器中加入上述葡萄糖溶液體積1.1～1.5％的藜蘆醇，使用攪拌器對容器中的混合物以150r/min攪拌4～6min，使用50目紗布對容器中的混合物進行過濾，收集過濾液，得混合菌懸液，備用；按重量份數計，取50～55份無菌水、20～23份蛋白胨、18～20份酵母浸膏、12～14份葡萄糖、3～6份酪氨酸、2～4份卵磷脂及1～3份磷酸氫二鉀，放入攪拌機中攪拌均勻，并將攪拌混合物放入高溫滅菌鍋中殺菌消毒，得營養液；按體積比1:3～1:6，將備用的混合菌懸液和營養液混合均勻，放入發酵罐中，設定溫度為25～32℃，以1.1m3/min速率向發酵罐中通入氧氣，以110r/min攪拌發酵7～8天，每隔50～60min中向發酵罐中加入營養液質量6～8％的害蟲脫皮粉末；在上述發酵結束后，對發酵罐中的發酵混合物進行過濾，收集過濾液，放入冷凍離心機中，設定溫度為2～4℃，以8000r/min離心5～10min，收集上層液，并將上層液進行冷凍濃縮，濃縮至原體積的70～75％，濃縮溫度為2～4℃，收集濃縮物；接著按質量比1:1:5，取鶴草芽、貫眾和0.8mol/L乙醇溶液放入蒸煮罐中，設定溫度為90～95℃，蒸煮4～6h，再自然冷卻至室溫，對蒸煮混合物進行過濾，收集過濾液，并將過濾液放入旋轉蒸發儀中去除乙醇，收集剩余液，按質量比1:4～1:6，將剩余液和上述濃縮物混合均勻，即可得果樹生物殺蟲劑。
其中害蟲脫皮粉末的制備方法為將害蟲脫皮放入45℃烘箱中干燥2～3h，再將干燥后的害蟲脫皮放入碾磨機中碾磨，過200目篩，收集過篩顆粒，即可，害蟲脫皮來自于果樹害蟲中鱗翅目害蟲和粉虱的脫皮。果樹主根為蘋果樹主根、梨樹主根、桃樹主根、柿子樹主根及杏樹主根中的任意一種。
實例1
首先取距離果樹主根0.8cm處的土壤，并與其質量1.2倍的質量分數為6％的葡萄糖溶液混合，放入容器中，并將容器置于32℃條件下，靜置12h，每隔40min，從容器底部對容器內的混合物進行充氧，充氧速度為4mL/min，充氧時間為2min；在上述靜置結束后，向容器中加入上述葡萄糖溶液體積1.5％的藜蘆醇，使用攪拌器對容器中的混合物以150r/min攪拌6min，使用50目紗布對容器中的混合物進行過濾，收集過濾液，得混合菌懸液，備用；按重量份數計，取55份無菌水、23份蛋白胨、20份酵母浸膏、14份葡萄糖、6份酪氨酸、4份卵磷脂及3份磷酸氫二鉀，放入攪拌機中攪拌均勻，并將攪拌混合物放入高溫滅菌鍋中殺菌消毒，得營養液；按體積比1:6，將備用的混合菌懸液和營養液混合均勻，放入發酵罐中，設定溫度為32℃，以1.1m3/min速率向發酵罐中通入氧氣，以110r/min攪拌發酵8天，每隔60min中向發酵罐中加入營養液質量8％的害蟲脫皮粉末；在上述發酵結束后，對發酵罐中的發酵混合物進行過濾，收集過濾液，放入冷凍離心機中，設定溫度為4℃，以8000r/min離心10min，收集上層液，并將上層液進行冷凍濃縮，濃縮至原體積的75％，濃縮溫度為4℃，收集濃縮物；接著按質量比1:1:5，取鶴草芽、貫眾和0.8mol/L乙醇溶液放入蒸煮罐中，設定溫度為95℃，蒸煮6h，再自然冷卻至室溫，對蒸煮混合物進行過濾，收集過濾液，并將過濾液放入旋轉蒸發儀中去除乙醇，收集剩余液，按質量比1:6，將剩余液和上述濃縮物混合均勻，即可得果樹生物殺蟲劑。其中害蟲脫皮粉末的制備方法為將害蟲脫皮放入45℃烘箱中干燥3h，再將干燥后的害蟲脫皮放入碾磨機中碾磨，過200目篩，收集過篩顆粒，即可，害蟲脫皮來自于蘋果小卷蛾的脫皮，果樹主根為蘋果樹主根。
本發明制備的果樹生物殺蟲劑適用于蘋果小卷蛾。在蘋果小卷蛾初發期，按質量比1:1000，將本發明制備的果樹生物殺蟲劑與水進行混合均勻后，利用噴霧器，將殺蟲劑稀釋液均勻的噴灑于蘋果樹的果實、枝、干、葉上，避免在大風天或預計1小時內有雨天使用。經檢測，本發明制備的果樹生物殺蟲劑藥效持效性達到45天，且殺蟲率達到99.0％，不會對作物生長和人體健康產生危害。
實例2
首先取距離果樹主根0.4cm處的土壤，并與其質量0.9倍的質量分數為6％的葡萄糖溶液混合，放入容器中，并將容器置于25℃條件下，靜置10h，每隔30min，從容器底部對容器內的混合物進行充氧，充氧速度為4mL/min，充氧時間為1min；在上述靜置結束后，向容器中加入上述葡萄糖溶液體積1.1％的藜蘆醇，使用攪拌器對容器中的混合物以150r/min攪拌4min，使用50目紗布對容器中的混合物進行過濾，收集過濾液，得混合菌懸液，備用；按重量份數計，取50份無菌水、20份蛋白胨、18份酵母浸膏、12份葡萄糖、3份酪氨酸、2份卵磷脂及1份磷酸氫二鉀，放入攪拌機中攪拌均勻，并將攪拌混合物放入高溫滅菌鍋中殺菌消毒，得營養液；按體積比1:3，將備用的混合菌懸液和營養液混合均勻，放入發酵罐中，設定溫度為25℃，以1.1m3/min速率向發酵罐中通入氧氣，以110r/min攪拌發酵7天，每隔50min中向發酵罐中加入營養液質量6％的害蟲脫皮粉末；在上述發酵結束后，對發酵罐中的發酵混合物進行過濾，收集過濾液，放入冷凍離心機中，設定溫度為2℃，以8000r/min離心5min，收集上層液，并將上層液進行冷凍濃縮，濃縮至原體積的70％，濃縮溫度為2℃，收集濃縮物；接著按質量比1:1:5，取鶴草芽、貫眾和0.8mol/L乙醇溶液放入蒸煮罐中，設定溫度為90℃，蒸煮4h，再自然冷卻至室溫，對蒸煮混合物進行過濾，收集過濾液，并將過濾液放入旋轉蒸發儀中去除乙醇，收集剩余液，按質量比1:4，將剩余液和上述濃縮物混合均勻，即可得果樹生物殺蟲劑。其中害蟲脫皮粉末的制備方法為將害蟲脫皮放入45℃烘箱中干燥2h，再將干燥后的害蟲脫皮放入碾磨機中碾磨，過200目篩，收集過篩顆粒，即可，害蟲脫皮來自于梨葉斑蛾的脫皮，果樹主根為梨樹主根。
本發明制備的果樹生物殺蟲劑適用于梨葉斑蛾。在梨樹梨葉斑蛾初發期，按質量比1:2000，將本發明制備的果樹生物殺蟲劑與水進行混合均勻后，利用噴霧器，將殺蟲劑稀釋液均勻的噴灑于梨樹的果實、枝、干、葉上，避免在大風天或預計1小時內有雨天使用。經檢測，本發明制備的果樹生物殺蟲劑藥效持效性達到40天，且殺蟲率達到98.7％，不會對作物生長和人體健康產生危害。
實例3
首先取距離果樹主根0.6cm處的土壤，并與其質量1.1倍的質量分數為6％的葡萄糖溶液混合，放入容器中，并將容器置于30℃條件下，靜置11h，每隔35min，從容器底部對容器內的混合物進行充氧，充氧速度為4mL/min，充氧時間為2min；在上述靜置結束后，向容器中加入上述葡萄糖溶液體積1.2％的藜蘆醇，使用攪拌器對容器中的混合物以150r/min攪拌5min，使用50目紗布對容器中的混合物進行過濾，收集過濾液，得混合菌懸液，備用；按重量份數計，取52份無菌水、22份蛋白胨、19份酵母浸膏、13份葡萄糖、5份酪氨酸、3份卵磷脂及2份磷酸氫二鉀，放入攪拌機中攪拌均勻，并將攪拌混合物放入高溫滅菌鍋中殺菌消毒，得營養液；按體積比1:4，將備用的混合菌懸液和營養液混合均勻，放入發酵罐中，設定溫度為30℃，以1.1m3/min速率向發酵罐中通入氧氣，以110r/min攪拌發酵7天，每隔55min中向發酵罐中加入營養液質量7％的害蟲脫皮粉末；在上述發酵結束后，對發酵罐中的發酵混合物進行過濾，收集過濾液，放入冷凍離心機中，設定溫度為3℃，以8000r/min離心6min，收集上層液，并將上層液進行冷凍濃縮，濃縮至原體積的72％，濃縮溫度為3℃，收集濃縮物；接著按質量比1:1:5，取鶴草芽、貫眾和0.8mol/L乙醇溶液放入蒸煮罐中，設定溫度為92℃，蒸煮5h，再自然冷卻至室溫，對蒸煮混合物進行過濾，收集過濾液，并將過濾液放入旋轉蒸發儀中去除乙醇，收集剩余液，按質量比1:5，將剩余液和上述濃縮物混合均勻，即可得果樹生物殺蟲劑。其中害蟲脫皮粉末的制備方法為將害蟲脫皮放入45℃烘箱中干燥3h，再將干燥后的害蟲脫皮放入碾磨機中碾磨，過200目篩，收集過篩顆粒，即可，害蟲脫皮來自于粉虱的脫皮。果樹主根為柿子樹主根。
本發明制備的果樹生物殺蟲劑適用于粉虱。在柿子樹粉虱初發期，按質量比1:1500，將本發明制備的果樹生物殺蟲劑與水進行混合均勻后，利用噴霧器，將殺蟲劑稀釋液均勻的噴灑于柿子樹的果實、枝、干、葉上，避免在大風天或預計1小時內有雨天使用。經檢測，本發明制備的果樹生物殺蟲劑藥效持效性達到42天，且殺蟲率達到99.3％，不會對作物生長和人體健康產生危害。