本發(fā)明涉及高類黃酮優(yōu)異種質(zhì)‘CSR6R6-777’在功能型蘋果育種中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

“醫(yī)食同源”是發(fā)展方向，“吃營養(yǎng)，吃健康”已成為人們的共識。為此，開展功能型蘋果育種對改進(jìn)人類健康具有重要意義。

功能型蘋果育種是多個品質(zhì)性狀(基因)的有效集成與平衡，為完善新品種選育方案，提高育種效率，課題組采取了三項措施：一是在新疆紅肉蘋果與蘋果品種雜種一代果實(shí)總酚含量等性狀遺傳變異研究的基礎(chǔ)上，提出并實(shí)施了“三選兩早一促”的蘋果育種法(專利號ZL 2013 1 0205419.6)，育種效率顯著提高；二是利用遺傳背景復(fù)雜的‘嘎啦’、‘美國八號’、‘寒富’及‘富士’等蘋果品種與新疆紅肉蘋果(M.sieversii f.niedzwetzkyana)進(jìn)行多親本雜交與反復(fù)回交，旨在進(jìn)行品質(zhì)育種，目前已構(gòu)建回交一、二代分離群體40個，定植雜種實(shí)生苗4萬株，并申報了“果樹多種源品質(zhì)育種法(專利申請?zhí)?015 10428448.8)”及“易著色蘋果品種培育法(專利申請?zhí)?01510890141.X)”2個育種技術(shù)發(fā)明專利；三是及時地以性狀基本穩(wěn)定的后代株系為試材，進(jìn)行品質(zhì)性狀評價及發(fā)育機(jī)理的研究，并已取得了諸多重要進(jìn)展。目前，已創(chuàng)建了常規(guī)雜交與生物技術(shù)有機(jī)結(jié)合的蘋果高效育種技術(shù)體系，創(chuàng)制了一批新品種及優(yōu)異種質(zhì)，研發(fā)了蘋果新品種配套高效栽培技術(shù)體系。授權(quán)和申報發(fā)明專利10余項，育成新品種(系)16個；發(fā)表相關(guān)研究論文120篇，其中SCI論文20余篇，這些研究成果總體處在國際同類研究的領(lǐng)先水平。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供高類黃酮優(yōu)異種質(zhì)‘CSR6R6-777’在蘋果育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明要求保護(hù)蘋果(Malus domestica)CSR6R6-777在蘋果育種中的應(yīng)用。

所述應(yīng)用中，蘋果CSR6R6-777作為親本之一。

所述應(yīng)用中，蘋果CSR6R6-777作為父本。

所述育種的目的為獲得果肉全紅的植株。

所述育種的目的為獲得R6R1基因型且果肉全紅的植株。

所述育種的目的為獲得性狀優(yōu)異的蘋果種質(zhì)。所述性狀優(yōu)異的蘋果種質(zhì)為滿足如下(a)和/或(b)和/或(c)和/或(d)的蘋果植株：(a)果肉全紅；(b)果肉高類黃酮含量；(c)果肉高花青苷含量；(d)果肉高抗氧化能力。所述性狀優(yōu)異的蘋果種質(zhì)為R6R1基因型。所述果肉高類黃酮含量指的是每千克鮮重的果肉中的類黃酮的含量為200mg以上。所述果肉高花青苷含量指的是每千克鮮重的果肉中的花青苷含量為30mg以上。果肉高抗氧化能力指的是每千克鮮重的果肉中的抗氧化能力(又稱抗氧化物含量)為1μmol以上。

本發(fā)明還保護(hù)一種蘋果育種方法，包括如下步驟：

(1)將蘋果品種A和蘋果品種B進(jìn)行雜交，獲得雜交種子；所述蘋果品種A為蘋果CSR6R6-777；所述蘋果品種B為除蘋果品種A以外的蘋果品種；

(2)將步驟(1)得到的雜交種子播種并育苗，得到實(shí)生苗；

(3)將步驟(2)得到的實(shí)生苗移栽至大田，待其長出果實(shí)后不對果實(shí)進(jìn)行套袋，篩選得到目的植株。

所述將蘋果品種A和蘋果品種B進(jìn)行雜交的方法如下：取蘋果品種A的花粉，對去雄后的蘋果品種B進(jìn)行授粉。

所述步驟(2)中，進(jìn)行所述播種前，先將所述雜交種子進(jìn)行1-3℃層積處理以打破休眠。所述層積處理的時間具體可為60天。

所述步驟(2)中,進(jìn)行所述育苗的條件為：25℃、每天光照12小時、光照強(qiáng)度3000lx，從種子萌發(fā)開始每7-10天澆一次營養(yǎng)液。

所述步驟(2)中,進(jìn)行所述育苗的條件具體為：將所述雜交種子播種于裝有育苗基質(zhì)的營養(yǎng)缽(每個營養(yǎng)缽播種3-5粒種子)培養(yǎng)至實(shí)生苗高度為8-15cm且根頸處木質(zhì)化(通常為播種2-3個月)，然后將實(shí)生苗移栽至新的裝有育苗基質(zhì)的營養(yǎng)缽(每個營養(yǎng)缽移栽1株)進(jìn)行培養(yǎng)；所述培養(yǎng)的條件為：25℃、每天光照12小時(光照強(qiáng)度3000lx)，從種子萌發(fā)開始每7-10天澆一次營養(yǎng)液(將MS基本培養(yǎng)基的大量元素母液用水稀釋至10倍體積即為營養(yǎng)液)、每次每個營養(yǎng)缽澆40-50ml。

所述步驟(3)中,在所述大田中進(jìn)行栽培管理的方法如下：在擬定植實(shí)生苗的大田中每畝施入有機(jī)肥6000kg并澆水沉實(shí)，定植實(shí)生苗后在大田中每畝再施入有機(jī)肥6000kg并及時澆水。所述有機(jī)肥具體可為充分腐熟的奶牛糞。

所述目的植株為果肉全紅的植株。

所述目的植株為R6R1基因型且果肉全紅的植株。

所述目的植株為滿足如下(a)和/或(b)和/或(c)和/或(d)的蘋果植株：(a)果肉全紅；(b)果肉高類黃酮含量；(c)果肉高花青苷含量；(d)果肉高抗氧化能力。所述性狀優(yōu)異的蘋果種質(zhì)為R6R1基因型。所述果肉高類黃酮含量指的是每千克鮮重的果肉中的類黃酮的含量為200mg以上。所述果肉高花青苷含量指的是每千克鮮重的果肉中的花青苷含量為30mg以上。果肉高抗氧化能力指的是每千克鮮重的果肉中的抗氧化能力(又稱抗氧化物含量)為1μmol以上。

所述方法中，移栽第4年，在離地面20cm處對實(shí)生苗的主干進(jìn)行環(huán)剝，環(huán)剝寬度為0.5-1.0cm，深達(dá)木質(zhì)部。

所述方法中，移栽第5年，在實(shí)生苗的盛花期進(jìn)行如下操作：每個花序的5朵花僅保留中心花，其他全部疏除。

所述方法中，移栽第5年得到所述目的植株。

所述蘋果品種B為R1R1基因型的蘋果品種。

所述蘋果品種B具體為‘嘎啦’蘋果或‘紅富士’蘋果。

鑒定R1R1基因型的方法如下：從待測蘋果植株上取蘋果，提取蘋果果肉的基因組DNA，以基因組DNA為模板，采用特異引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后按如下標(biāo)準(zhǔn)判讀基因型：如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中具有386bp的DNA片段且不具有497bp的DNA片段，待測蘋果植株為R1R1基因型。鑒定R1R1基因型的方法如下：從待測蘋果植株上取蘋果，提取蘋果果肉的基因組DNA，以基因組DNA為模板，采用特異引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后按如下標(biāo)準(zhǔn)判讀基因型：如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為一條帶且為386bp，待測蘋果植株為R1R1基因型。

鑒定R6R1基因型的方法如下：從待測蘋果植株上取蘋果，提取蘋果果肉的基因組DNA，以基因組DNA為模板，采用特異引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后按如下標(biāo)準(zhǔn)判讀基因型：如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中具有497bp的DNA片段和386bp的DNA片段，待測蘋果植株為R6R1基因型。鑒定R6R1基因型的方法如下：從待測蘋果植株上取蘋果，提取蘋果果肉的基因組DNA，以基因組DNA為模板，采用特異引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后按如下標(biāo)準(zhǔn)判讀基因型：如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為兩條帶且分別為497bp和386bp，待測蘋果植株為R6R1基因型。

所述特異引物對由F1和R1組成；所述F1為序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；所述R1為序列表的序列2所示的單鏈DNA分子。

‘CSR6R6-777’，又稱蘋果(Malus domestica)CSR6R6-777，已于2016年12月08日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCCNO.12468。

本發(fā)明對于功能型蘋果育種具有重大價值。

附圖說明

圖1為新疆紅肉蘋果、‘紅富士’以及‘CSR6R6-777’的果實(shí)的表型比較。

圖2為各個基因的相對表達(dá)量。

圖3為蘋果果肉中，黃烷醇和無色花青素的含量、原花青苷的含量、黃烷酮的含量、查爾酮和二氫查耳酮的含量、黃酮醇的含量、花青苷的含量。

圖4為蘋果果肉中的黃酮醇進(jìn)行精確鑒定的結(jié)果。

圖5為部分后代植株的蘋果果實(shí)的照片。

圖6為部分后代植株的蘋果果實(shí)的照片。

圖7為部分后代植株的蘋果果實(shí)的照片。

圖8為‘紅心11號’、‘紅心16號’、‘紫霞1號’‘紫霞2號’‘紫霞3號’和‘嘎啦’的基因型鑒定結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗，結(jié)果取平均值。

蘆丁的結(jié)構(gòu)式如下：

Trolox的結(jié)構(gòu)式如下：

0.5％鹽酸甲醇溶液的制備方法：將0.5體積份35％濃鹽酸與99.5體積份甲醇混合。

1％鹽酸甲醇溶液的制備方法：將1體積份35％濃鹽酸與99體積份甲醇混合。

80％丙酮溶液：將4體積份丙酮與1體積份水混合。

鑒定蘋果植株為R1R1基因型、R6R6基因型還是R6R1基因型的方法如下：從待測蘋果植株上取蘋果，提取蘋果果肉的基因組DNA，以基因組DNA為模板，采用F1和R1組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后按如下標(biāo)準(zhǔn)判讀基因型：如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為一條帶且為497bp，待測蘋果植株為R6R6基因型；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為一條帶且為386bp，待測蘋果植株為R1R1基因型；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為兩條帶且分別為497bp和386bp，待測蘋果植株為R6R1基因型。

F1(序列表的序列1)：5’-GGTGGTCAAAGATGTGTGTTGT-3’；

R1(序列表的序列2)：5’-TTTGCCTGCTACCCACTTCA-3’。

提及‘紅富士’蘋果和‘嘎啦’蘋果的參考文獻(xiàn)：陳學(xué)森，辛培剛等，元帥和金帥在蘋果新品種選育中的作用，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1994，25(2)：236—248。經(jīng)檢測，‘紅富士’蘋果和‘嘎啦’蘋果均為R1R1基因型。

提及‘紅色之愛’蘋果的文獻(xiàn)：鄭吉文、姚少群、劉淑貞，紅肉蘋果新品種“紅色之愛”，西北園藝，201304。

實(shí)施例1、蘋果優(yōu)異種質(zhì)‘CSR6R6-777’的鑒定

一、‘CSR6R6-777’的獲得

新疆紅肉蘋果作為親本，與‘紅富士’等白肉栽培蘋果品種雜交。按照孟德爾遺傳定律，新疆紅肉蘋果(R6R1基因型)與‘紅富士’(R1R1基因型)等白肉栽培蘋果品種雜交,其后代群體應(yīng)為紅肉表型(R6R1基因型):白肉表型(R1R1基因型)＝1:1。但是，在雜交F₁代群體(868株)中發(fā)現(xiàn)3株R6R6基因型的單株。

3株單株均具有如下表型：葉、花、果皮和果肉等各部分及各個發(fā)育階段均為紫紅色。一株單株的莖也為紫紅色，將其命名為‘CSR6R6-777’。另外兩株單株的莖為淡紅色，分別命名為對照株甲和對照株乙。

在雜交F₁代群體隨機(jī)選定一個R1R1基因型的單株(命名為對照株A)和一個R6R1基因型的單株(命名為對照株B)。

新疆紅肉蘋果、‘紅富士’以及‘CSR6R6-777’的果實(shí)的表型比較見圖1。

二、‘CSR6R6-777’的保藏

‘CSR6R6-777’，又稱蘋果(Malus domestica)CSR6R6-777，已于2016年12月08日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCCNO.12468。

三、類黃酮生物合成相關(guān)基因表達(dá)分析

分別將‘CSR6R6-777’、對照株A和對照株B作為待測植株，取待測植株上的蘋果，提取蘋果果肉的總RNA，通過實(shí)時定量RT-PCR檢測類黃酮合成途徑上的關(guān)鍵酶基因(CHS基因、F3H基因、ANS基因、LAR基因、FLS基因)以及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因(MYB10基因)的表達(dá)量。

用于檢測CHS基因的引物對如下：

CHS-F：5’-GGAGACAACTGGAGAAGGACTGGAA-3’；

CHS-R：5’-CGACATTGATACTGGTGTCTTC-3’。

用于檢測F3H基因的引物對如下：

F3H-F：5’-TGGAAGCTTGTGAGGACTGGGGT-3’；

F3H-R：5’-CTCCTCCGATGGCAAATCAAAGA-3’。

用于檢測ANS基因的引物對如下：

ANS-F：5’-CCAAGTGAAGCGGGTTGTGCT-3’；

ANS-R：5’-CAAAGCAGGCGGACAGGAGTAGC-3’。

用于檢測LAR基因的引物對如下：

LAR-F：5’-CACCGTCAAGTCCTTCAA-3’；

LAR-R：5’-ACCTCTTAACTGTACCAACTG-3’。

用于檢測FLS基因的引物對如下：

FLS-F：5’-AACCACTGTGAACAAGGATA-3’；

FLS-R：5’-CATAGTCGCCGTACTTCTT-3’。

用于檢測MYB10基因的引物對如下：

MYB10-F：5’-TGCCTGGACTCGAGAGGAAGACA-3’；

MYB10-R：5’-CCTGTTTCCCAAAAGCCTGTGAA-3’。

以MdActin為內(nèi)參，數(shù)據(jù)分析采用2^-ΔΔCT方法(Livak&Schmittgen，2001)計算。

各個基因的相對表達(dá)量見圖2。‘CSR6R6-777’中各個基因的表達(dá)量均極為顯著的高于對照株A和對照株B中相應(yīng)基因的表達(dá)量。結(jié)果表明，‘CSR6R6-777’具有很強(qiáng)的類黃酮合成能力。

四、類黃酮組分含量分析

分別將‘CSR6R6-777’、對照株A和對照株B作為待測植株。

1、取待測植株上的蘋果，取蘋果果肉。

2、取步驟1得到的果肉，在液氮中研磨得到粉末。

3、稱取2g步驟2得到的粉末，加入5mL 0.5％鹽酸甲醇溶液，4℃靜置提取2h，然后8000rpm離心20min，分別收集上清液和殘渣。

4、取步驟3得到的殘渣，加入5mL 0.5％鹽酸甲醇溶液，4℃靜置提取1h，然后8000rpm離心20min，收集上清液。

5、將步驟3得到的上清液和步驟4得到的上清液混合，得到混合液。

6、取步驟5得到的混合液，37℃旋蒸除去甲醇，殘留物用2-3ml甲醇溶解，然后8000rpm離心20min，收集上清液。

7、取步驟6得到的上清液，用甲醇定容至5ml，然后用0.45μm濾膜過濾，收集濾液。

8、將步驟7得到的濾液進(jìn)行HPLC-MS分析。

液相色譜條件：

采用WATERS ACQUITY UPLC色譜儀，色譜柱為BEH C18柱(100mm×2.1mm)，填料粒徑1.7μm；柱溫45℃；進(jìn)樣體積1μL；

流動相為A液和B液的混合液，流速為0.3mL/min；A液為乙腈，B液為含0.2％(體積分?jǐn)?shù))甲酸的水溶液；0-0.1min，A液占流動相的體積分?jǐn)?shù)為5％；0.1-20min，A液占流動相的體積分?jǐn)?shù)由5％線性上升至20％；20-22min，A液占流動相的體積分?jǐn)?shù)由20％線性上升至80％；22-22.1min，A液占流動相的體積分?jǐn)?shù)由80％線性下降至5％；22.1-25min，A液占流動相的體積分?jǐn)?shù)為5％。

質(zhì)譜條件：

質(zhì)譜儀為WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS，ESI電離源，電噴霧離子化正離子采集模式(ESI+)；掃描范圍100-1500m/z；毛細(xì)管電壓3.5kV，錐孔電壓30V；源溫度100℃，脫溶溫度300℃；脫溶劑氣流量500L/h。

每克鮮重的蘋果果肉中，黃烷醇和無色花青素的含量、原花青苷的含量、黃烷酮的含量、查爾酮和二氫查耳酮的含量、黃酮醇的含量、花青苷的含量見圖3。‘CSR6R6-777’的蘋果果肉中，原花青苷的含量、查爾酮和二氫查耳酮的含量、黃酮醇的含量、花青苷的含量均顯著高于對照株A和對照株B中的相應(yīng)物質(zhì)含量。

對蘋果果肉中的黃酮醇進(jìn)行精確鑒定，結(jié)果見圖4。‘CSR6R6-777’的蘋果果肉中含有41種黃酮醇物質(zhì)，其中9種為其特有的，在對照株A和對照株B的蘋果果肉中都不含有。‘CSR6R6-777’的蘋果果肉特有的9種黃酮醇物質(zhì)見表1。表1中的9種特有物質(zhì)的檢測方法均屬于類黃酮組分及含量檢測方法，參考文獻(xiàn)(陳學(xué)森,張晶,劉大亮,等.新疆紅肉蘋果雜種一代的遺傳變異及功能型蘋果優(yōu)株評價[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,47(11):2193-2204.。

表1

以上結(jié)果表明，‘CSR6R6-777’具有很強(qiáng)的類黃酮合成能力，果肉富含類黃酮，并且含有特殊的黃酮醇類組分，是培育功能型蘋果品種的優(yōu)異種質(zhì)。

實(shí)施例2、應(yīng)用‘CSR6R6-777’作為親本雜交獲得全紅植株

一、從雜交后代中選育全紅植株

1、回交(在山東煙臺市牟平區(qū)進(jìn)行)

2011年4月，取‘CSR6R6-777’的花粉，對去雄后的‘嘎啦’蘋果進(jìn)行授粉，收獲BC₁雜交種子，將BC₁雜交種子洗凈后放到1-3℃冰箱保鮮室層積處理60d左右(目的是通過滿足需冷量來解除種子休眠)。

2、溫室育苗(在山東泰安進(jìn)行)

2011年12月，將步驟1得到的BC₁雜交種子播種于裝有育苗基質(zhì)的營養(yǎng)缽(每個營養(yǎng)缽播種3-5粒種子)培養(yǎng)至實(shí)生苗高度為8-15cm且根頸處木質(zhì)化(通常為播種2-3個月)，然后將實(shí)生苗移栽至新的裝有育苗基質(zhì)的營養(yǎng)缽(每個營養(yǎng)缽移栽1株)進(jìn)行培養(yǎng)；本步驟中的培養(yǎng)條件為：25℃、每天光照12小時(光照強(qiáng)度3000lx)，從種子萌發(fā)開始每7-10天澆一次營養(yǎng)液(將MS基本培養(yǎng)基的大量元素母液用水稀釋至10倍體積即為營養(yǎng)液)、每次每個營養(yǎng)缽澆40-50ml。

3、雜種實(shí)生苗定植(在山東冠縣進(jìn)行)

2012年2月，在擬定植實(shí)生苗的選種圃(大田)中每畝施入有機(jī)肥(本實(shí)施例中采用的為充分腐熟的奶牛糞)6000kg并澆水沉實(shí)；2012年4月，將3600株步驟2得到的實(shí)生苗定植于選種圃，2012年4月在定植有實(shí)生苗的選種圃中每畝再施入有機(jī)肥(本實(shí)施例中采用充分腐熟的奶牛糞)6000kg并及時澆水。

4、雜種實(shí)生苗環(huán)剝處理

2015年5月，在離地面20cm處對各實(shí)生苗的主干進(jìn)行環(huán)剝，環(huán)剝寬度為0.5-1.0cm，深達(dá)木質(zhì)部。此操作的目的是促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的積累及花芽分化，以縮短童期、提早結(jié)果。

5、花果管理

2016年4-5月，在各實(shí)生苗的盛花期進(jìn)行疏花(每個花序的5朵花僅保留中心花，其他全部疏除)。幼果不套袋，常規(guī)管理。

6、全紅植株的獲得

2016年8月，從回交后代群體中選育出5個果肉全紅植株：‘紫霞1號’、‘紫霞2號’、‘紫霞3號’、‘紅心11號’和‘紅心16號’。

二、表型特征

5個植株上生長的蘋果的果實(shí)特征見圖5、圖6和圖7。

三、基因型

5個植株的基因型如下：

‘紅心11號’為R6R1基因型；

‘紅心16號’為R6R1基因型；

‘紫霞1號’為R6R1基因型；

‘紫霞2號’為R6R1基因型；

‘紫霞3號’為R6R1基因型。

鑒定圖譜見圖8。

結(jié)果表明，從‘CSR6R6-777’的雜種后代分離群體中，能夠選育出R6R1基因型且果肉全紅的植株。

四、類黃酮含量、花青苷含量及抗氧化能力分析

待測材料：‘紅心11號’上生長的蘋果、‘紅心16號’上生長的蘋果、‘紫霞1號’上生長的蘋果、‘紫霞2號’上生長的蘋果、‘紫霞3號’上生長的蘋果以及‘CSR6R6-777’上生長的蘋果和‘嘎啦’上生長的蘋果。

1、類黃酮含量測定

(1)取1g果肉，液氮研磨，然后加入10ml 4℃預(yù)冷的65％(體積百分含量)乙醇水溶液并混勻，4℃避光靜置提取4h，然后12000g離心20min，收集上清液。

(2)取試管，加入0.5ml步驟(1)得到的上清液，然后依次加入1mL 5g/100ml NaNO₂水溶液、1ml 10g/100ml AL(NO₃)₃水溶液、4mL 2M NaOH水溶液，混勻后靜置15min，8000rpm離心10min，取上清，然后在510nm下測定吸光值。

以蘆丁(rutin,Sigma chemical,ST,Loiuis,USA)為標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2、花青苷含量測定

(1)取0.5g果肉，液氮研磨，加入5ml 4℃預(yù)冷的1％鹽酸甲醇溶液，4℃避光靜置提取24h。

(2)取1ml步驟(1)得到的提取液，加入4ml KCl緩沖液或加入4ml NaAC緩沖液，混勻后4℃避光靜置提取15min，然后8000r/min離心10min，收集上清液。

KCl緩沖液(pH＝1、0.025M)：1.86g KCl用980ml蒸餾水溶解，用濃鹽酸調(diào)pH為1.0，轉(zhuǎn)移到1L容量瓶中，用蒸餾水定容。

NaAC緩沖液(pH＝4.5、0.4M)：54.43g NaAC用960ml蒸餾水溶解，用濃鹽酸調(diào)pH為4.5，轉(zhuǎn)移到1L容量瓶中，用蒸餾水定容。

(3)取步驟(2)得到的上清液，分別測定510nm和700nm下的吸光值。

花青苷含量(mg/g)＝△A*5*0.005*1000*449.2/(26900*0.5)；

△A＝(A_510nm-A_700nm)_{pH1.0條件下}-(A_510nm-A_700nm)_{pH4.5條件下}。

3、抗氧化能力測定

(1)取果肉，液氮研磨，得到粉末。

(2)稱取10g步驟(1)得到的粉末，加入50mL 80％丙酮溶液，4℃靜置提取2h，8000rpm離心10min，收集上清。

(3)取完成步驟(2)的殘渣，加入50mL 80％丙酮溶液，4℃靜置提取1h，8000rpm離心10min，收集上清。

(4)將步驟(2)得到的上清和步驟(3)得到的上清合并，得到混合液。

(5)取步驟(4)得到的混合液，40℃旋蒸除去丙酮，殘留部分5000rpm離心，取上清液，用去離子水定容至20mL，得到待測樣品。

(6)10體積份乙酸緩沖液、1體積份20mM FeCl₃·6H₂O水溶液和1體積份TPTZ溶液混合，37℃水浴5min。

乙酸緩沖液(pH3.6、300mM)：16.8克冰醋酸和0.8克氫氧化鈉與水配制成1升溶液。

TPTZ溶液：含10mM 2,4,6–三吡啶基三嗪和40mM鹽酸的水溶液。

(7)完成步驟(6)后，取4mL溶液，與30μL待測樣品混合，37℃靜置反應(yīng)120min，然后593nm測其吸光度。以Trolox為標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

各個待測材料的類黃酮含量、花青苷含量以及抗氧化能力(又稱抗氧化物含量)檢測結(jié)果見表2。結(jié)果表明，以‘CSR6R6-777’為親本雜交育成的全紅植株的果肉的類黃酮含量、花青苷含量以及抗氧化能力均顯著的高于其親本嘎啦。‘紅心11號’和‘紅心16號’酸甜適口，細(xì)脆多汁，鮮食品質(zhì)優(yōu)良。‘紫霞1號’、‘紫霞2號’和‘紫霞3號’可作為深加工的原料。因此，‘CSR6R6-777’是功能蘋果育種的珍貴種質(zhì)。

表2

對比例、

用對照株甲代替‘CSR6R6-777’，按照實(shí)施例2的步驟一的方案進(jìn)行操作。2016年8月，從回交后代中未得到果肉全紅植株，僅得到一株果肉紅白參雜的植株(經(jīng)檢測，為R6R1基因型)，將其命名為‘紅雜1號’。

用對照株乙代替‘CSR6R6-777’，按照實(shí)施例2的步驟一的方案進(jìn)行操作。2016年8月，從回交后代中未得到果肉全紅植株，僅得到一株果肉紅白參雜的植株(經(jīng)檢測，為R6R1基因型)，將其命名為‘紅雜2號’。

按照實(shí)施例2的步驟四的方法檢測‘紅雜1號’和‘紅雜2號’的類黃酮含量、花青苷含量以及抗氧化能力，結(jié)果見表3。

實(shí)施例3、應(yīng)用‘CSR6R6-777’作為親本雜交獲得全紅植株

用‘紅富士’蘋果代替‘嘎啦’蘋果，按照實(shí)施例2的步驟一的方案進(jìn)行操作。

2016年8月，從回交后代群體中選育出4個果肉全紅植株：‘紫霞4號’、‘紫霞5號’、‘紫霞6號’、‘紅心35號’。

經(jīng)檢測，‘紫霞4號’、‘紫霞5號’、‘紫霞6號’、‘紅心35號’均為R6R1基因型。

按照實(shí)施例2的步驟四的方法檢測‘紫霞4號’、‘紫霞5號’、‘紫霞6號’、和‘紅心35號’的類黃酮含量、花青苷含量以及抗氧化能力，結(jié)果見表3。

表3

序列表

<110> 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 高類黃酮優(yōu)異種質(zhì)‘CSR6R6-777’在功能型蘋果育種中的應(yīng)用

<130> GNCYX162162

<160> 2

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

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<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<400> 2

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