本發明涉及植物組織培養領域，具體而言，涉及間歇浸沒式荔浦芋組培苗快速增殖的方法及荔浦芋種苗。

背景技術：

芋[Colocasia esculenta(L.)Schott]，又名芋艿、芋頭、毛芋，為天南星科(Araceae)芋屬(Colocasia Schott)，多年生單子葉草本植物。芋是一種重要的蔬菜和藥用植物，在我國具有悠久的栽培歷史。同時，芋還是迄今發現的耐鹽性最強的蔬菜作物之一，長期栽培可以降低土壤的鹽漬化程度，對灘涂的開發和利用具有較大的應用價值。全球芋頭種植面積最大的非洲，占芋頭種植總面積的79.9％，亞洲種植面積占7.6％，主要集中在中國、日本、菲律賓、泰國等。中國的檳榔芋產區主要分布在廣西、廣東、海南、福建；湖北、浙江、山東、四川、江西以多子芋為主，著名品種有廣西荔浦芋、福建福鼎芋、廣東樂昌炮彈芋、靖江香沙芋等。

自然條件下栽培的芋艿品種基本上不開花，因此，常規的芋的栽培方法是用球莖作種，每畝用種100～150公斤。然而，這不僅耗費了大量商品芋，而且還需要解決芋種越冬問題。同時，長期無性繁殖和蚜蟲的傳播，也會使得使芋感染上一種或多種病毒。長期以來，由于沒有注重種源的提純復壯工作，荔浦芋出現嚴重退化，抗病抗逆性下降，產量品質也明顯下降。到目前為止，我國的芋艿產區已經100％受到芋花葉病毒的侵染，在栽培過程中芋還易患芋軟腐病、芋疫病，嚴重影響芋艿的生產、銷售及品種的交換和種質資源的保存工作。

組織培養可以在短時間內獲得大量荔浦芋健康種苗，國內關于荔浦芋 組織培養的研究很多，主要包括莖尖脫毒、提純復壯與快繁。傳統組織培養：采用固體培養基培養莖頂生長點附近的芽(頂芽、腋芽)，使之大量分蘗繁殖，繁殖一定數量后，誘導芽長出根，形成完整植株。

然而，傳統的組織培養育苗方法仍有很多問題，具體如下：

(1)傳統組織培養方法操作過程中需要大量的手工勞動，是一種勞動密集型技術，機械化程度低，培育成本高；

(2)現有技術荔浦芋的增殖系數一般為5倍，效率很低；

(3)現有技術中，荔浦芋組培苗生根后，需要轉移到自然環境中進行煉苗處理15～20天，才能移栽到營養杯中，育苗步驟較多且耗時較長，育苗時間也難以控制。

有鑒于此，特提出本發明。

技術實現要素：

本發明的第一目的在于提供一種間歇浸沒式荔浦芋組培苗快速增殖的方法，本發明方法中通過間歇浸沒液體培養系統進行組培苗培養，能夠有效提高培養物的質量與繁殖系數；同時，本發明方法中，無需煉苗，簡化了培育操作程序，縮短組培苗生產周期，而且培養效率高。

本發明的第二目的在于提供一種荔浦芋種苗，本發明荔浦芋種苗由本發明方法培育得到，具有移栽成活率高等優點。

為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：

間歇浸沒式荔浦芋組培苗快速增殖的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)建立間歇浸沒液體培養系統：分別配置繼代增殖液體培養基和生根液體培養基，并將所配置的培養基和間歇浸沒式生物反應器滅菌后備用；

(2)接種與繼代增殖培養：制備荔浦芋外植體，并將荔浦芋外植體接種于間歇浸沒式生物反應器中，并在繼代增殖液體培養基中進行繼代增殖培養；

(3)生根培養：繼代增殖培養結束后，將間歇浸沒式生物反應器中的培養基替換為生根液體培養基，并繼續進行生根培養；

(4)生根苗移栽：生根培養結束后，將所得組培生根苗移栽至培養杯中育苗，并將所得種苗移栽至田地。

可選的，本發明中，步驟(1)中所述繼代增殖液體培養基為添加有6-BA、NAA、PP₃₃₃以及白砂糖的基礎MS培養基；

其中6-BA的濃度為4～5mg/L，NAA的濃度為0.05～0.1mg/L，PP₃₃₃的濃度為0.2～0.5mg/L,白砂糖的濃度為30～40g/L。

可選的，本發明中，步驟(1)中所述生根液體培養基為NAA、IBA、PP₃₃₃以及白砂糖的基礎MS培養基；

其中NAA的濃度為0.3～0.5mg/L，IBA的濃度為0.4～0.5mg/L，PP₃₃₃的濃度為0.4～0.5mg/L,白砂糖的濃度為30～40g/L。

可選的，本發明中，步驟(2)制備荔浦芋外植體的具體步驟如下：取荔浦芋莖尖分生組織培養的第3代或第4代組培苗，并將誘導出的不定芽切為單芽或雙芽，剝離老葉，并保留芽體1～2cm，即得到荔浦芋外植體。

可選的，本發明中，步驟(2)中荔浦芋外植體的接種密度為：每升培養液中接種10～15株外植體。

可選的，本發明中，步驟(2)中繼代增殖培養的具體條件為：培養溫度25～30℃，光照強度1500～1800Lx，光照時間10～12h/d，培養時間25～30d。

可選的，本發明中，步驟(2)中繼代增殖培養的浸沒頻率為5～10min/4～5h。

可選的，本發明中，步驟(3)中生根培養的條件為：培養溫度27～30℃，光照強度1500～1800Lx，光照時間13～16h/d，培養時間20～25d。

可選的，本發明中，步驟(3)中生根培養的浸沒頻率為3～4min/6～8h。

同時，本發明還提供了由本發明方法培育得到的荔浦芋種苗。

與現有技術相比，本發明的有益效果為：

(1)本發明中，使用間歇浸沒液體培養系統進行組培苗培育，能夠有效防止有害物質在培養基中的積累，培養空間利用率高且利于培養氣體成分交換，從而提高培養物質量與繁殖系數；

(2)本發明的培養基配方適合于使用間歇浸沒式培養增殖荔浦芋組培苗，在本發明的培養基配方和培養條件下，繼代一代增殖達30倍，增殖率遠遠高于傳統組培方法；

(3)組培苗生根后無需再進行煉苗處理，生根與煉苗在同一反應器中同步完成，簡化了組培操作程序；

(4)與傳統荔浦芋組培苗相比，本發明的組培苗更粗壯。生根率達到95％以上，無需煉苗的移栽成活率可達到90％以上。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，以下將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1為接種于間歇浸沒液體培養系統1d的荔浦芋外植體；

圖2為接種于間歇浸沒液體培養系統10d的荔浦芋外植體；

圖3為接種于間歇浸沒液體培養系統20d的荔浦芋外植體；

圖4為生根培養所得荔浦芋生根苗。

具體實施方式

下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。

按照植物學分類，天南星科(Araceae)芋屬(Colocasia Schott)植物有20種，我國有6種，分別是勐臘芋、大野芋、芋、滇南芋、卷苞芋和假芋。其中芋[Colocasia esculenta(Linn.)Schott]是食用最為普遍的種，滇南芋雖然也有一些類型的植物部位可以食用，但栽培和食用的地區僅限于我國云南、廣西等地；

而按照園藝學分類，芋分為魁芋、魁子用芋、多子芋和多頭芋；

其中，a魁芋：母芋、子芋和孫芋按代數等級生長排列，彼此易分離，子芋多具短柄，母芋質量占球莖總質量的一半以上，以食母芋為主的芋類型。

b魁子兼用芋：母芋、子芋和孫芋按代數等級生長排列，彼此易分離，子芋多具短柄，母芋質量與子孫芋質量相當，母芋及子芋、孫芋均宜食用的芋類型。

c多子芋：母芋、子芋和孫芋等按代數等級生長排列，彼此易分離，子芋無柄，子芋和孫芋等的質量占球莖總質量的一半以上，以食子芋、孫芋為主的芋類型。

d多頭芋：母芋、子芋和孫芋生長排列無明顯代數等級差別，相互連接 成一個整體而不易分離的芋類型。

本發明中所要培育的荔浦芋，為天南星科芋屬，是檳榔芋的著名品種，屬魁芋類型，多年生草本，植株高1.3～1.7米，葉片長0.5～0.7米，葉柄長1～1.3米，上部紫紅色，下部青綠色，與葉片相連處有一紅褐色圓斑。母芋長約0.3米，橫徑約0.1米，近似紡錘形，中部大，每株有子芋十多個，呈棒槌形，尾部略彎，孫芋、曾孫芋呈藤狀。橫切面為灰白色并具有明顯紫色檳榔花紋，肉質細粉松散，味甘甜且具有獨特芬芳香味，營養豐富。生長期240～270天，單株產量2～3公斤,畝產約2000公斤。

荔浦芋為廣西壯族自治區名特產蔬菜之一，在廣西全區各地均有栽培，是廣西極具特色和歷史的農作物，有400年的人工栽培歷史，為國家地理標志保護農產品，全區僅荔浦縣種植荔浦芋5萬余畝，畝產平均達2000公斤，總產量達10萬噸，年總產值超過6億元。

為促進荔浦芋生產向高產、優質、高效方向發展，各級政府高度重視發展“荔浦芋”這個支柱產業，全面提升荔浦芋市場競爭力，以實施農業標準化手段和方法，加快農業先進適用技術和科技成果在荔浦芋生產上的推廣應用，從而帶動荔浦芋生產及其它標準化、無公害蔬菜的發展，為科技興農作出貢獻。

本發明也是為荔浦芋標準化和高效培育提供了新的思路，也是為荔浦芋的普及和推廣做出一份貢獻！

間歇浸沒液體培養系統，是一套集植物組織培養和植物次生代謝物質研究為一體的設備，其原理是利用液體培養基以經過過濾的空氣壓力為動力對植物組培苗進行間歇式培養，植物在液體培養的過程中提供了一個良好的環境，可以很好地進行培養器中的氣體(包括容器中氣體和培養基中的氣體成分)交換。培養基的循環利用可很有效的防止營養沉積和有害物 質的積累，從而更有效利用培養基的營養成分。目前并沒有使用間歇浸沒液體培養系統進行荔浦芋培養的相關報道。

本發明所述間歇浸沒液體培養系統，包括荔浦芋培養所用培養基以及間歇浸沒式生物反應器；

其中，所述培養基分為繼代增殖液體培養基和生根液體培養基；

進一步的，所述繼代增殖液體培養基為添加有6-BA、NAA、PP₃₃₃以及白砂糖的基礎MS培養基，培養基中所添加的各組分濃度具體可以為：6-BA 4、4.5或者5mg/L；NAA 0.05、0.06、0.07、0.08、0.09或者0.1mg/L；PP₃₃₃ 0.2、0.3、0.4或者0.5mg/L；白砂糖30、32、35、37或者40g/L；

同時，所述生根液體培養基為添加NAA、IBA、PP₃₃₃以及白砂糖的基礎MS培養基，培養基中所添加的各組分濃度具體可以為：NAA 0.3、0.4或者0.5mg/L；IBA 0.4或者0.5mg/L；PP₃₃₃ 0.4或者0.5mg/L；白砂糖30、35或者40g/L；

其中，所述間歇浸沒式生物反應器可以為市售或者自制反應器。如圖1中所用到的裝置所示，本發明所用間歇浸沒式生物反應器的主要結構包括：培養容器裝置、載物構件和運輸配件，所述的培養容器裝置包括容器主體以及通過螺紋嚙合的密封蓋體；所述容器密封蓋體頂部設有氣體交換的通孔；所述容器主體側壁的一端其底部與頂部均各設一外伸開孔；所述載物構件包括載物篩盤以及固定框架，單個載物篩盤通過多個摞疊置于固定框架內,而固定框架再擱置于所述培養容器內；所述的運輸配件包括硅膠軟管、蠕動泵和儲液容器，通過兩條硅膠軟管與所述的培養容器、蠕動泵、儲液容器相連接；

進一步的，本發明反應器中，所述培養容器裝置和儲液容器均為容積3L的廣口白色玻璃瓶，瓶高30cm，直徑15cm，儲液瓶中液體培養基體積為 1L/瓶；

在進行接種培養前，要首先將包括培養基和間歇浸沒式生物反應器的間歇浸沒液體培養系統采用熱濕滅菌法進行滅菌。

接下來就是具體的培養過程，首先是制備荔浦芋外植體。本發明外植體制備所用原料為荔浦芋莖尖分生組織培養的第三代或第4四代組培苗，并將這些組培苗在誘導培養過程中所長出的不定芽切成單芽或雙芽，剝離老葉，留芽體1～2cm，將前代培養中發黑或者變黃的葉片完全去除，同時要注意不能破壞芽體的生長點和基部的芽點；

然后，在無菌環境中，將制得的荔浦芋外植體接種到裝載有繼代增殖液體培養基的如前所述的間歇浸沒式生物反應器中，并將接種密度控制在10～15株外植體/L培養液，例如可以為，但不限于11、12、13、14或者15株外植體/L培養液，并進行繼代增殖培養；

繼代增殖培養要控制培養的溫度為25～30℃，例如可以為，但不限于26、28或者29℃等；光照強度為1500～1800Lx，例如可以為，但不限于1600或者1700Lx等；光照時間為10～12h/d，例如可以為12h光照、12h黑暗或者11h光照、13h黑暗等；培養時間25～30d，例如可以為，但不限于26、27、28或者29d等；

同時，在繼代增殖培養過程中，還要對間歇浸沒式生物反應器進行設置，并調控浸沒頻率為5～10min/4～5h，即，每4～5h進行一次浸沒換氣培養，每次培養的時間控制在5～10min。

進一步的，在繼代增殖培養過程中需要注意的是，要控制培養代數控制在12代以內，以防止組培苗變異的發生；

然后，將間歇浸沒式生物反應器中的培養基替換為生根液體培養基，并將繼代增殖培養產物繼續進行生根培養；

生根培養需要控制培養的溫度在27～30℃，例如可以為，但不限于28、29或者30℃；光照強度在1500～1800Lx，例如可以為，但不限于1600、1700或者1800Lx；光照時間為13～16h/d，例如可以為，但不限于14h光照、10h黑暗或者15h光照，13h黑暗等；培養時間20～25d，例如可以為，但不限于21、22、23或者24h等；

同時，在生根培養過程中，還要對間歇浸沒式生物反應器進行設置，并調控浸沒頻率為3～4min/6～8h，即，每6～8h進行一次浸沒換氣培養，每次培養的時間控制在3～4min。

在生根培養后，本發明無需進行煉苗處理，在生根過程中實際上已經完成了煉苗的過程，因而能夠大大減少育苗的周期；

將生根后的組培苗根部洗凈后，可以直接移栽至培養杯中，在培養杯中育苗60d后，即可將所得種苗移栽至田地中。

實施例1

本發明所提供的間歇浸沒式荔浦芋組培苗快速增殖的方法具體步驟參考如下：

(1)間歇浸沒液體培養系統(TIBs系統)的建立：培養瓶和儲液瓶為容積3L的廣口白色玻璃瓶，瓶高30cm，直徑15cm，儲液瓶中液體培養基體積為1L/瓶，培養基配置完成后，整套裝置采用濕熱滅菌法進行滅菌后備用。

(2)材料選擇：采用荔浦芋莖尖分生組織培養的第三代或第4四代組培苗為原材料；

(3)外植體的制備：將原材料組培苗在誘導過程中長出的不定芽切成單芽或雙芽，剝離老葉，留芽體1～2cm，將前代培養中發黑或者變黃的葉片完全去除，注意不能破壞芽體的生長點和基部的芽點；

(4)接種與增殖培養：在無菌環境下將荔浦芋外植體接種到間歇浸沒式生物反應器中，接種密度為每升繼代增殖培液體養基10～15株外植體，并進行繼代增殖培養；

其中，繼代增殖液體培養基配方為：MS+6-BA 4mg/L+NAA 0.05mg/L+PP₃₃₃0.2mg/L+30g/白砂糖，PH值為6.0；

具體培養條件為：溫度28±1℃，光照1500Lx，12小時光照，12小時黑暗，設定間歇浸沒式生物反應器的相關參數，即間歇培養的間歇頻率為每4小時一次，培養時間為5分鐘，培養時間30天；

同時，間歇浸沒式荔浦芋繼代增殖培養代數控制在12代以內，以防止組培苗變異的發生。

(5)生根培養：待增殖培養結束后，將培養基更換為生根液體培養基；

其中，生根液體培養基配方為：MS+NAA 0.3mg/L+IBA 0.4mg/L+PP₃₃₃0.4mg/L+30g/L白砂糖，PH值為6.0；

具體培養條件為：溫度28±1℃，光照1500Lx，14小時光照，10小時黑暗，設定間歇浸沒式生物反應器的相關參數，即間歇培養的間歇頻率為每6小時一次，培養時間為3分鐘，培養時間20天；

(6)生根苗的移栽：生根結束后無需再進行煉苗處理，用清水洗干凈根部，直接移栽至營養杯中，在營養杯中育苗60天左右即可移栽至大田。

各培養階段外植體或種苗的形態如圖1-4所示，具體的，接種于間歇浸沒液體培養系統1d的荔浦芋外植體如圖1所示；接種于間歇浸沒液體培養系統10d的荔浦芋外植體如圖2所示；接種于間歇浸沒液體培養系統20d的荔浦芋外植體如圖3所示；生根培養所得荔浦芋生根苗如圖4所示。

進一步對本發明各階段培育產物進行檢測，結果發現，本發明培育得到的組培苗相較于傳統方法而言，明顯外形更加粗壯；同時，組培苗的發 芽率達到95％以上，而移栽成活率也能夠達到90％以上。

本發明自動化程度高，節省勞動成本，并可在短時間內獲得大量荔浦芋組培苗，極大縮短生產周期，效率高，增加經濟效益。

盡管已用具體實施例來說明和描述了本發明，然而應意識到，在不背離本發明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權利要求中包括屬于本發明范圍內的所有這些變化和修改。