基于str基因標志用于鑒定供者dna嵌合比率的pcr引物、試劑盒及其應用以及嵌合體的檢 ...的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于STR基因標志鑒定供者DNA嵌合比率的PCR引物、試劑盒及其應用以及嵌合體的檢測方法，其檢測方法包括以下步驟：a)從樣品中提取DNA作為模板；b)設定根據權利要求1中所述的PCR引物的退火溫度，并對所述PCR引物進行標記；c)將標記的PCR引物進行PCR擴增，得到擴增產物；d)對所述擴增產物的片段大小進行分析，確定具有差異的基因標志。根據本發明實施例的嵌合體的檢測方法，將PCR引物與熒光標記DNA片段分析技術有機結合，創出供受者區分率高、操作簡捷快速、結果分析準確的整套嵌合率檢測分析系統，該方法克服了傳統方法中主觀影響，分辨率高結果精確，且操作簡單快捷，干凈無毒。
【專利說明】基于STR基因標志用于鑒定供者DNA嵌合比率的PCR引物、試劑盒及其應用以及嵌合體的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，更具體地，涉及一種基于STR基因標志基于STR基因標志用于鑒定供者DNA嵌合比率供者嵌合比率的PCR引物、試劑盒及其應用的檢測方法。
【背景技術】
[0002]目前，評價造血干細胞移植后的植入情況主要依賴供者嵌合率的檢測，早期用以檢測供者嵌合率的方法包括表型檢測、性染色體核型分析、以及HLA分型等。這些方法對部分病例可獲得客觀植活的證明，但均有一定的應用限制。隨著分子生物學的發展，應用PCR技術擴增并分析供受體的基因型，可方便快捷地進行個體識別。用以擴增分析的基因多態性分子標志包括限制性片段長度多態性(RFLP)、小衛星DNA(minisatellite DNA)，微衛星DNA(microsatellite DNA)等。其中微衛星DNA又稱為短串聯重復序列(short tandemrepeats, STR)，是由2~7bp為核心單位，多次重復并串聯而成的DNA序列，具有高度的多態性。無關個體間12個STR位點完全相同的概率為10_14，同胞之間完全相同概率也僅為10_4。顯然以STR作為鑒別不同個體DNA的基因標志，進行PCR擴增并結合片段分析可以定量監測移植患者體內供者細胞的動態變化，對臨床具有重要的指導價值。
[0003]當前的嵌合體檢測的主要方法仍 然是利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離供受者STR基因的擴增片段，利用凝膠成像儀測量片段光密度相對定量分析供者嵌合比例。該方法也是法醫學利用基因標志鑒定個體身份的經典方法。但該方法操作復雜、耗時、主觀誤差明顯、精確度低。常用的STR引物因退火溫度不同在對供受者初步分型時必須使用不同的擴增程序，不能合理配置資源和時間。聚丙烯酰胺凝膠配制使用試劑較多，程序繁瑣而且難以保證每次配制凝膠的品質相同。電泳過程耗時2-3小時，長時間的電泳產生熱量會使凝膠因受熱不均影響電泳質量。凝膠在染色過程中也會因每次使用的銀染、定容試劑的差異，溫度的變化導致背景的差異影響判斷。由于聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨率較高，擴增產生的非特異性條帶常會對真實擴增條帶產生巨大影響。光密度定量屬于相對定量，誤差較大。

【發明內容】

[0004]本發明旨在至少在一定程度上解決上述技術問題之一。為此，本發明的一個目的在于提出一種基于STR基因標志用于鑒定供者DNA嵌合比率的PCR引物，所述PCR引物的基因序列包括:
[0005]D5F(SEQ ID N0.1), D5R(SEQ ID N0.2)；
[0006]D7F(SEQ ID N0.3), D7R(SEQ ID N0.4)；
[0007]D8F (SEQ ID N0.5), D8R(SEQ ID N0.6)；
[0008]TF (SEQ ID N0.7)，TR (SEQ ID N0.8)；
[0009]FF (SEQ ID N0.9)，FR (SEQ ID N0.10)；
[0010]D13F(SEQ ID N0.11), D13R(SEQ ID N0.12)；[0011]SRYF (SEQ ID N0.13)，SRYR (SEQ ID N0.14)；
[0012]D16F(SEQ ID N0.15), D16R(SEQ ID N0.16)；
[0013]D18F(SEQ ID N0.17)，D18R(SEQ ID N0.18)。
[0014]本發明還提供了一種基于STR基因標志用于鑒定供者DNA嵌合比率的PCR引物在檢測嵌合體中的應用。
[0015]本發明保護了一種基于STR基因標志用于鑒定供者DNA嵌合比率的試劑盒，具體地，所述試劑盒含有根據上述實施例所述的PCR引物。
[0016]本發明還提供了一種基于STR基因標志用于鑒定供者DNA嵌合比率的試劑盒在檢測嵌合體中的應用。
[0017]本發明提供了一種嵌合體的檢測方法，包括以下步驟:a)從樣品中提取DNA作為模板山)設定根據權利要求1中所述的PCR引物的退火溫度，并對所述PCR引物進行標記；
c)將標記的PCR引物進行PCR擴增，得到擴增產物；d)對所述擴增產物的片段大小進行分析，確定具有差異的基因標志。
[0018]根據本發明實施例的嵌合體的檢測方法，
[0019]另外，根據本發明上述實施例的嵌合體的檢測方法，還可以具有如下附加的技術特征:
[0020]根據本發明的一個實施例，在所述步驟b)中，所述標記為FAM熒光標記。
[0021]根據本發明的一個實施例，所述FAM熒光標記在所述PCR引物的5’端進行標記。
[0022]根據本發明的一個實施例，所述PCR的擴增條件為:95 V 5min ；95 V 30s,60°C 25s，72。。30s，共 30 個循環；72°C 延伸 4min。
[0023]根據本發明的一個實施例，在步驟d)中，對所述擴增產物的基因標志片段進行分析的方法采用全自動毛細管電泳。
[0024]根據本發明實施例的嵌合體的檢測方法，將PCR引物與熒光標記基因片段分析技術有機結合，創出供受者區分率高、操作簡捷快速、結果分析簡單準確的整套嵌合率檢測分析系統。根據本發明實施例的嵌合體的檢測方法，操作簡單快捷，干凈無毒，并且分辨率高、結果精確、客觀。
[0025]具體而言，根據本發明實施例PCR引物的與現有的引物序列相比，退火溫度統一，擴增延伸時間均大幅度縮短。根據本發明實施例的嵌合體的檢測方法與傳統的操作方法相t匕，由于摒棄了配制聚丙烯酰胺凝膠及電泳、銀染成像的過程，使得整個檢測過程更加簡單快速，容易操作。
[0026]根據本發明實施例的嵌合體的檢測方法，由于不必再使用有毒的試劑配制凝膠，不必為成像進行銀染顯像，使得有毒試劑的使用大大減少，保護了操作者及操作環境的安
全，干凈無毒。
[0027]采用熒光標記基因片段分析技術分辨率可以達到I個堿基差異，與同樣具有相同分辨率的聚丙烯酰胺凝膠電泳技術相比，由于后者受限于背景噪音、非特異擴增及技術人員的主觀因素使得前者較凝膠成像方法有更好的重復性和更高的準確度。
[0028]根據本發明實施例的嵌合體的檢測方法，相比于凝膠成像方法操作程序及結果分析的復雜， 該方法具有更好的可操作性，普通技術人員經過簡單的培訓即可進行操作并分析結果。[0029]傳統的對于凝膠成像方法的結果分析最大的缺點是會因分析人員的不同而發生變化，甚至相同人員不同時間得出的結果都有可能不同。而熒光片段分析因其結果由儀器在掃描同時計算得出，其結果不會因分析人員的不同而發生變化，因此，其檢測結果更為客觀、準確。
[0030]本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:圖1是根據本發明實施例的受者D13基因位點擴增片段掃描圖；
[0032]圖2是根據本發明實施例的供者D13基因位點擴增片段掃描圖；
[0033]圖3是根據本發明實施例的移植后受者D13基因位點擴增片段掃描圖；
[0034]圖4是根據傳統檢測方法得到的基因位點凝膠電泳圖。
【具體實施方式】
[0035]下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的 ，旨在用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。
[0036]下面結合具體實施例描述根據本發明的嵌合體的檢測方法。
[0037]一、實驗方法:
[0038]1、從樣品中提取DNA作為模板(利用英俊公司DNA提取試劑盒提取供受者DNA標本)。
[0039]2、PCR引物標記:重新設計引物統一不同基因標志引物的退火溫度，并在PCR引物的5’端標記FAM熒光。
[0040]3、將標記的PCR弓丨物進行PCR擴增，得到擴增產物。
[0041]4、對所述擴增產物的基因標志片段進行分析，確定具有差異的基因標志。
[0042]二、PCR的反應體系
[0043]所述PCR的反應體系為:
[0044]

2X Premix (英俊公司) 12.5 μ I
標記引物上游ΙμL 10 μ M
引物下游ΙμL 10 μΜ
雙蒸水9.5 μ I
DNA 樣本IOOng I μ I。
[0045]三、PCR的擴增條件
[0046]PCR 的擴增條件為:95°C 5min ；95°C 30s，60。。25s，72。。30s，共 30 個循環；72°C延伸 4min。
[0047]采用全自動毛細管電泳的具體方法為:取PCR擴增產物1.5 μ I或Ladderl μ I加入21 μ I上樣液(去離子甲烯胺20 μ 1+Rox500內標1.0 μ I)，95°C變性5分鐘后立即冰浴至少 5 分鐘，ABI310 遺傳分析儀米用 P0P4 (Perforance Optimized Polymer 4)膠及 36cm長毛細管進行全自動毛細管電泳及片段分析。
[0048]四、實驗結果
[0049]通過儀器自帶軟件作圖，通過片段大小判斷并明確供受者有區別基因型，實驗結果如圖1至圖4所示，其中，圖1表示受者D13基因位點擴增片段掃描圖，D13兩等位基因擴增片段大小相差4個堿基；圖2表示供者D13基因位點擴增片段掃描，D13兩等位基因擴增片段大小相差8個堿基；圖3表示移植后受者D13基因位點擴增片段掃描圖顯示為混合嵌合。圖4為某患者各基因位點凝膠電泳圖，非特異擴增多，供受者區分主觀因素影響大，精確度低。
[0050]五、結果分析 [0051]通過上述實施例以及圖1至圖3的結果可以看出，根據本發明實施例的嵌合體的檢測方法，將PCR引物與熒光標記基因片段分析技術有機結合，創出供受者區分率高、操作簡捷快速、結果分析簡單準確的整套嵌合率檢測分析系統。根據本發明實施例的嵌合體的檢測方法，操作簡單快捷，干凈無毒，并且分辨率高、結果精確、客觀。
[0052]在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。
[0053]盡管上面已經示出和描述了本發明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發明的限制，本領域的普通技術人員在不脫離本發明的原理和宗旨的情況下在本發明的范圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。
【權利要求】
1.一種基于STR基因標志鑒定供者DNA嵌合比率基于STR基因標志用于鑒定供者DNA嵌合比率的PCR引物，其特征在于，所述PCR引物的基因序列包括:
D5F(SEQ ID N0.1)，D5R(SEQ ID N0.2)；
D7F(SEQ ID N0.3)，D7R(SEQ ID N0.4)；
D8F (SEQ ID N0.5)，D8R(SEQ ID N0.6)；
TF (SEQ ID N0.7)，TR (SEQ ID N0.8)；
FF (SEQ ID N0.9)，FR (SEQ ID N0.10)；
D13F(SEQ ID N0.11), D13R(SEQ ID N0.12)；
SRYF(SEQ ID N0.13)，SRYR(SEQ ID N0.14)；
D16F(SEQ ID N0.15), D16R(SEQ ID N0.16)；
D18F(SEQ ID N0.17)，D18R(SEQ ID N0.18)。
2.根據權利要求1所述的基于STR基因標志鑒定供者DNA嵌合比率基于STR基因標志用于鑒定供者DNA嵌合比率的PCR引物在檢測嵌合體中的應用。
3.一種基于STR基因標志用于鑒定供者DNA嵌合比率的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有權利要求1所述的PCR引物。
4.根據權利要求3所述的基于STR基因標志用于鑒定供者DNA嵌合比率的試劑盒在檢測嵌合體中的應用。
5.一種嵌合體的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: a)從樣品中提取DNA作為模板； b)設定根據權利要求1中所述的PCR引物的退火溫度，并對所述PCR引物進行標記； c)將標記的PCR引物進行PCR擴增，得到擴增產物； d)對所述擴增產物的片段大小進行分析，確定具有差異的基因標志。
6.根據權利要求5所述的嵌合體的檢測方法，其特征在于，在所述步驟b)中，所述標記為FAM突光標記。
7.根據權利要求6所述的嵌合體的檢測方法，其特征在于，所述FAM熒光標記在所述PCR引物的5’端進行標記。
8.根據權利要求5所述的嵌合體的檢測方法，其特征在于，所述PCR的擴增條件為:.950C 5min ；95°C 30s, 60°C 25s，72°C 30s，共 30 個循環；72°C延伸 4min。
9.根據權利要求5所述的嵌合體的檢測方法，其特征在于，在步驟d)中，對所述擴增產物的基因標志片段進行分析的方法采用全自動毛細管電泳。
【文檔編號】C12Q1/68GK104004820SQ201310060981
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2013年2月27日 優先權日:2013年2月27日
【發明者】艾輝勝, 孫學東 申請人:北京紐賽爾生物科技有限公司