專利名稱：IBDV抗原表位與HBcAg嵌合基因的分子設計的制作方法
技術領域：
本發明涉及IBDV抗原表位與HBcAg嵌合基因的分子設計，具體涉及傳染性法氏囊 病病毒(IBDV)抗原表位與乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)嵌合基因的分子設計、技術路 線、基因序列、表達質粒及其表達產物，屬于生物制藥領域。
背景技術：
傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease，IBD)是當今危害最嚴重的禽病之 一，由傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)引起的以侵害雛雞 中樞免疫器官-法氏囊為主要特征。該病不僅引起患病動物死亡，而且還導致機體免疫抑 制，使機體的免疫防御能力降低和疫苗免疫接種失敗。每年因IBD發病、免疫失敗、免疫抑 制造成的經濟損失巨大[王永山等.近期引起免疫失敗的傳染性法氏囊病病毒VP2基因的 分子特征.中國獸醫科學，2008,38(12) :1013-1019]。接種疫苗是當前防控IBD最有效的 方法，目前使用的中強毒力活疫苗存在著較大的生物安全問題，因為在不同IBDV毒株之間 潛在著基因重配的可能，滅活疫苗也存在著抗原制備的困難。由于該病毒易變，在生產實踐 中要求IBD疫苗不斷更新以應對新出現的IBDV變異株。IBDV屬雙RNA病毒科，基因組包括大㈧小⑶兩個片段，有五種病毒蛋白VP1、 VP2、VP3、VP4和VP5。VPl由B片段編碼，為病毒自身編碼的依賴RNA的RNA聚合酶。其它 四種病毒蛋白由A片段編碼的多聚蛋白加工而成VP2和VP3是病毒的主要結構蛋白，構成 病毒衣殼，VP4為病毒自身蛋白酶，VP5為病毒的非結構蛋白，與病毒的毒力和復制效率有 關。VP2是病毒的主要保護性抗原，病毒中和表位主要在VP2上，并且多為構象依賴性，其立 體結構對病毒中和表位的形成至關重要。以VP2為靶基因的IBD基因工程疫苗已進行了多 年研究。分析目前的研究進展，三個方面難以兼顧一是提高重組IBDV蛋白的表達量，二是 簡化原核表達的重組IBDV蛋白復性工藝，三是解決源于一種毒株的重組蛋白不適用于其 它變異毒株的問題，由此導致的較高生產成本是影響獸用基因工程疫苗推廣應用的主要原 因。因此，探索新的IBD基因工程疫苗技術路線是十分必要的。抗原表位是蛋白質抗原性的物質基礎，重組蛋白的正確復性是構象依賴性表位形成的關鍵，構象依賴性中和抗原表位和免疫優勢表位的丟失將影響到機體產生完全有效的 保護性免疫應答。此前，本專利申請人根據5個IBDV抗原表位基序構建線性串聯模擬IBDV 多表位基因5印is，在多表位基因中，用線性化序列模擬了 IBDV空間構象依賴性抗原表位， 將人工合成的5印is在大腸桿菌中表達，重組多表位蛋白5EPIS可刺激機體產生抗IBDV感 染的保護性免疫應答[Wang YS(王永山)，et al (等)· Development of amulti-mimotope peptide as a vaccine immunogen for infectious bursal disease virus. Vaccine, 2007,25(22) :4447_4455.]。但這種單純用抗原表位串聯的方法得到的多表位分子量小，其 表達量、免疫原性以及免疫效力都有待進一步提高。因此，探索模擬IBDV抗原表位分子構 建模式，進一步增強其分子的穩定性、免疫原性及其免疫效力是十分必要的，這不僅可以拓 寬IBD新型檢測試劑和表位型基因工程疫苗的研究策略，而且具有良好的應用前景。
發明內容
技術問題抗原表位是蛋白質抗原性的物質基礎，重組蛋白的正確復性是構象依賴性表位形成的關鍵，構象依賴性中和抗原表位和免疫優勢表位的丟失將影響到機體產生完全有效的 保護性免疫應答。近年來，隨著對病毒抗原表位的分析，在一些分子量較大的病毒保護性 免疫原中除了與免疫保護有關的中和表位外，還有非中和表位、抑制性表位甚或是毒性表 位，這些表位會影響疫苗的免疫效果。單一抗原表位通常由數個氨基酸殘基組成，其分子量 很小，在體內的穩定性和免疫原性都很弱，因此，在應用于表位型基因工程疫苗研究時，需 要采取多表位的方法，以增強其免疫原性、穩定性和免疫效力。已有的實驗結果表明，采用 多個表位串聯的方法可以增強免疫原性，多表位有利于提供更完全和更有針對性的免疫保 護，但并不是拷貝數越多越好，只有串聯適量的拷貝數，才能夠刺激機體產生最大量的中和 抗體。此外，抗原表位、連接方法以及表達系統等都會影響到多表位蛋白的免疫效力，表位 的加工效率也是影響多表位蛋白免疫原性的重要因素。由于表位自身性質和組合方式的不 同，對多表位疫苗的分子設計方案還沒有一成不變的優化規律。本發明利用HBcAg具有形成病毒樣顆粒并具有免疫佐劑功能的分子特征，用其作 為IBDV抗原表位的分子載體，將IBDV模擬多表位5印is嵌入HBcAg之中，構建IBDV抗原 表位與HBcAg嵌合基因，提高抗原表位的穩定性、免疫原性及其免疫效力，為新型顆粒化表 位型IBD基因工程疫苗提供技術和物質保證。技術方案模擬傳染性法氏囊病病毒(IBDV)多表位5印is與乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg) 嵌合基因，該嵌合基因mHBc-5印is序列為SEQ ID NO. 1。上述模擬IBDV多表位5印is與乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)嵌合基因病毒樣 顆粒重組蛋白，其序列為SEQ ID NO. 2。是通過分子設計和分子構建嵌合基因mHBc-5印is 表達質粒pET-mHBc-5印is，在大腸桿菌中高效表達獲得的。其分子設計和技術路線分為四 個步驟進行3、根據權利要求2所述的重組蛋白，是通過分子設計獲得的，具體包括第一步根據HBcAg基因序列設計引物，并在正向引物Pl與反向引物P2的5'端 分別加上酶切位點Nco I與Hind III Pl 5' -GATATACCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3‘P2 5' -GTTCCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAG-3‘以乙型肝炎患者血清為模板用PCR擴增HBcAg基因片段560bp，與pMD18_T載體連 接，轉化E. coli T0P10感受態細菌，獲得含有HBcAg基因的重組克隆質粒pMD-HBc ；第二步運用重疊延伸PCR技術在重組克隆質粒pMD-HBc中的HBcAg基因的231 232位核苷酸，即77 78位氨基酸殘基之間插入BamH I和EcoR I酶切位點，在重疊延伸 PCR引物P3和引物P4的5'端分別加上酶切位點BamH I和EcoR I P3 5' -GAATTCTGGATCCTCCAAGTTATTACCCAC-3‘P4 5' -GGAGGATCCAGAATTCTCCCCAGCATCTAGG-3‘以pMD-HBc為模板，分別用引物Pl和P3，引物P4和P2擴增得到PCR產物P13禾口P42，再以P13和P42共同作模板，用引物P1和P2擴增得到PCR產物，用1. 0%瓊脂糖凝膠 電泳分析，回收目的DNA片段，構建含BamH I和EcoR I位點的HBcAg修飾基因Modified HBc，簡稱mHBc，與pMD18-T載體連接，可見兩條大小分別約為580bp和2700bp的條帶，獲 得含BamH I和EcoR I位點的HBcAg修飾基因mHBc重組克隆質粒pMD-mHBc ；將pMD-mHBc 和pET-28a分別用Ncol和Hindlll酶切，構建含有BamH I和EcoR I酶切位點的mHBc重 組原核表達質粒pET-mHBc ； 第三步根據模擬IBDV多表位基因5印is以及HBcAg修飾基因表達質粒pET-mHBc 的雙酶切位點和閱讀框，設計引物，并分別在正、反向引物的5'端加上酶切位點BamH I和 EcoR I 正向引物 5 ‘ -GCGGATCCCATGCCTAAGACTCATAATTCTGGTC-3 ‘反向引物5 ‘ -GCGAATTCAAACCAATTAGTAAAACCATGCCCATG-3 ‘以pET-5印is為模板，用PCR方法在5印is基因的5'和3'端分別加入BamH I 和EcoRI酶切位點，構建5印is亞克隆質粒pMD-5印is ；將第二步構建的mHBc重組原核表達質粒pET-mHBc與pMD-5印is分別用BamH I 和EcoR I雙酶切，回收pET-mHBc片段和5印is片段，用T4 DNA連接酶連接，轉化E. coli TOP 10感受態細菌，獲得IBDV抗原表位嵌合基因mHBc-5印is表達質粒pET-mHBc_5印is。第四步將pET-mHBc-5印is轉化宿主菌E. coli BL21 (DE3)，涂布1. 5%瓊脂LB平 板該平板含卡那霉素100 U g/mL，挑取單菌落接種于含卡那霉素100 U g/mL的LB液體培養 基中，37°C，200r/min振搖16h，再按1 %的體積吸取菌液接種于含卡那霉素100 y g/mL的 LB液體培養基中，37°C，200r/min振搖至菌液A6(1(1 = 0. 6 0. 8，加IPTG至終濃度為lmmol/ L，37°C，200r/min,誘導培養4h，收集重組菌培養物，獲得IBDV抗原表位5印is與HBcAg嵌 合基因病毒樣顆粒重組蛋白。上述嵌合基因重組蛋白可以在IBD新型檢測試劑或基因工程疫苗方面得到應用。有益效果本發明的特點和優點如下IBDV屬雙RNA病毒科，基因組包括大(A)小⑶兩個片段，有五種病毒蛋白VP1、 VP2、VP3、VP4和VP5。VP1由B片段編碼，為病毒自身編碼的依賴RNA的RNA聚合酶。其它 四種病毒蛋白由A片段編碼的多聚蛋白加工而成VP2和VP3是病毒的主要結構蛋白，構成 病毒衣殼，VP4為病毒自身蛋白酶，VP5為病毒的非結構蛋白，與病毒的毒力和復制效率有 關。VP2是病毒的主要保護性抗原，病毒中和表位主要在VP2上，并且多為構象依賴性，其立 體結構對病毒中和表位的形成至關重要。以VP2為靶基因的IBD基因工程疫苗已進行了多 年研究。分析目前的研究進展，三個方面難以兼顧一是提高重組IBDV蛋白的表達量，二是 簡化原核表達的重組IBDV蛋白復性工藝，三是解決源于一種毒株的重組蛋白不適用于其 它變異毒株的問題，由此導致的較高生產成本是影響獸用基因工程疫苗推廣應用的主要原 因。因此，探索新的IBD基因工程疫苗技術路線是十分必要的。病毒樣顆粒(Virus like particles, VLP)疫苗作為預防性疫苗具有以下幾個方 面的優勢(1)不含病毒DNA，無感染性；(2)免疫原性強，可刺激機體產生特異性體液免疫 和細胞免疫；(3)穩定性好，不易失活。基于VLP設計的疫苗，是一種理想的疫苗形式。乙型肝炎病毒核心抗原Ofepatitis B core antigen, HBcAg)是由乙型肝炎病毒 基因組的C區基因編碼，從第二個AUG起始翻譯，形成長約183 185個氨基酸殘基的多肽。HBcAg的第48位和第61位上的半胱氨酸可與另一 HBcAg上相應位點的半胱氨酸通過二硫鍵形成二聚體。以二聚體為基本單位，HBcAg可自身聚合成兩種排列形式、直徑分別為 30nm和34nm的核心顆粒T = 3型，由180個HBcAg分子組成的20面體結構；T = 4型，由 240個HBcAg分子組成的20面體結構。兩種顆粒的局部排列相似，表面有特征性的刺突和 核孔。HBcAg氨基端的第78 83位、127 133位氨基酸殘基位于顆粒表面，并且前者是 刺突尖部的組成部分。而HBcAg羧基端的150 177位氨基酸殘基則位于顆粒的內部，為 HBcAg的核酸結合區域，在大腸桿菌合成的HBcAg顆粒內部包含有細菌的RNA，能使機體免 疫反應向Thl方向極化。由HBcAg組成的VLP，既有顆粒抗原的一般特征，也具有免疫佐劑 的作用。因此，HBcAg顆粒被認為是抗原表位理想的分子載體。本發明針對IBD流行現狀和基因工程疫苗研究中存在的主要問題，利用HBcAg具 有形成病毒樣顆粒并具有免疫佐劑功能的分子特征，用其作為IBDV抗原表位的分子載體， 進行分子設計和嵌合基因mHBC-5epiS表達質粒的構建。構建的IBDV抗原表位嵌合基因分 子載體，使用方便、容量大、表達量高、表達產物呈病毒樣顆粒，具有成為顆粒化表位型IBD 基因工程疫苗的應用前景。用SDS-PAGE分析，重組嵌合蛋白的分子量約29kDa，表達量約占 菌體總蛋白的47. 6%;在Western-blotting試驗中，重組嵌合蛋白與IBDV抗體反應形成1 條特異性蛋白帶。將重組菌超聲破碎，用電鏡檢查，可見重組嵌合蛋白呈病毒樣顆粒(VLP)， 直徑約60nm 80nm ；用IBDV抗體夾心ELISA檢測，抗原效價達到2. OX 102。
四

圖lHBcAg修飾基因mHBc的序列結構圖2嵌合基因mHBc-5印is表達質粒的分子圖譜圖3HBcAg修飾基因mHBc表達質粒pET-mHBc酶切圖譜圖4嵌合基因表達質粒pET-mHBC-5epiS酶切圖譜圖5嵌合基因mHBc-5印is的序列圖6嵌合基因重組菌pET-mHBc-5印is分析結果圖7嵌合基因mHBc-5印is重組蛋白電鏡檢查結果
五具體實施例方式1實驗材料含有模擬IBDV多表位基因5印is的重組原核表達質粒pET-5印is由本實驗室構 建[公知公用，Wang YS (王永山)，et al (等) Development of a multi-mimotope peptide as avaccine immunogen for infectious bursal disease virus. Vaccine, 2007,25(22) 4447-4455.]。 雞抗IBDV高免血清系用IBD弱毒疫苗(B87株，購自南京天邦生物科技有限公司) 對SPF雞(購自南京天邦生物科技有限公司)免疫5次獲得，用DEAE纖維素(DE32)純化 (劉玉斌，茍仕金主編.動物免疫學實驗技術.長春吉林科學技術出版社，1989，8-15)；
兔抗雞IgG抗體和HRP標記的兔抗雞IgG抗體參照文獻制備(劉玉斌，茍仕金 主編.動物免疫學實驗技術.長春吉林科學技術出版社，1989,150-151 ；王永山，郝崇， 侯世寬，劉子，馬從林，殷震.抗雞IgG單克隆抗體的研究.獸醫大學學報，1989，9(2)109-114)。Ex Taq DNA 合成酶、T4DNA 連接酶、BamHI、EcoRI、DNA Marker、X_gal、IPTG、 MiniBEST質粒純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、克隆載體pMD18-T simple Vector均購自 TaKaRa 公司。原核表達載體pET-28a、E. coli BL21 (DE3)、E. coli TOP 10 均購自 Invitrogen 公 司。DAB顯色液購自武漢博士德生物工程有限公司。引物合成、DNA序列測定由Invitrogen 公司完成。2實驗方法2. lHBcAg基因克隆質粒的構建根據HBcAg 基因序列(GenBank 登錄號AM282986 ；Panjaworayan N, 等 HBVRegDB -annotation, comparison, detection and visualization of regulatory elements in hepatitis B virussequences.Viro J,2007,4:136 doi 10. 1186/1743-422X-4-136.)設計引物，并在正向引物PI與反向引物P2的5'端分別加上 酶切位點Nco I與Hind III。P1 5' -GATATACCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3‘P2 5' -GTTCCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAG-3‘取住院乙型肝炎患者血清25iiL，加入等量裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH 7.5， 0. 3% NP-40)，充分混勻，100°C水浴5min, 13000r/min離心lOmin，取3 u L上清液作模板， PCR 擴增 HBcAg 基因片段。PCR 條件95°C預變性 2min ；94°C 30s，55°C 30s，72°C 30s，循環 30次；72°C延伸5min。用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，可見一條大小約為560bp的 目的DNA帶(圖3中2泳道)，與HBcAg基因實際大小相符合，回收目的DNA片段，DNA膠回 收試劑盒純化，與PMD18-T simple Vector載體連接，轉化E. coliTOPIO感受態細菌，涂布 于1. 5%瓊脂LB平板(含Amp 100 u g/ml)，挑白色菌落培養，抽提質粒，用Nco I與Hind III雙酶切鑒定，可見兩條大小分別約為560bp和2700bp的DNA帶(圖3中3泳道)，與理 論大小相符合測序分析，獲得含有HBcAg基因的重組克隆質粒pMD-HBc。2. 2HBcAg修飾基因mHBc表達質粒的分子設計與構建運用重疊延伸PCR技術在重組克隆質粒pMD-HBc中的HBcAg基因的231 232位 核苷酸(77 78位氨基酸殘基)之間插入BamH I和EcoR I酶切位點。在重疊延伸PCR 引物P3和引物P4的5'端分別加上酶切位點BamH I和EcoR I。P3 5' -GAATTCTGGATCCTCCAAGTTATTACCCAC-3‘P4 5' -GGAGGATCCAGAATTCTCCCCAGCATCTAGG-3‘以pMD-HBc為模板，分別用引物P1和P3，引物P4和P2擴增得到PCR產物P13 (大 小 251bp)，和 P42(大小 354bp), PCR 擴增條件為:95°C預變性 2min ;94°C 30s，55°C 30s, 72°C 30s，循環 30 次；72°C延伸 5min。再以P13和P42共同作模板，用引物P1和P2擴增得到PCR產物，用1. 0%瓊脂糖 凝膠電泳分析，可見一條大小約為580bp的DNA條帶(圖3中4泳道)，與理論大小相符合， 回收目的DNA片段，與pMD18-T simple Vector載體連接，經氨芐抗性與藍白斑篩選，Nco I 與Hind III雙酶切鑒定，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見兩條大小分別約為580bp和 2700bp的條帶(圖3中5泳道)，與理論大小相符合，DNA測序結果與實驗設計序列一致
7(圖1、圖5)。獲得含BamH I和EcoR I位點的HBcAg修飾基因(Modified HBc, mHBc)重 組克隆質粒pMD-mHBc。將pMD-mHBc和pET_28a分別用NcoI和HindIII酶切，采用實驗室常規方法(薩 姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T.著(金冬燕，黎孟楓，侯云德，等.譯校).分子克隆 實驗指南.第2版，北京科學出版社，1995，846 847，888 898)構建含有BamH I和 EcoR I酶切位點的mHBc重組原核表達質粒pET-mHBc，用Nco I和Hind III對HBcAg修飾 基因mHBc表達質粒pET-mHBc進行雙酶切，可見兩條大小分別約為580bp和5200bp的DNA 帶(圖3中6泳道)。將pET-mHBc轉化宿主菌E. coli BL21 (DE3)，涂布1. 5%瓊脂LB平板(含卡那霉 素100 μ g/mL)，挑取單菌落接種于LB液體培養基中(含卡那霉素100 μ g/mL)，37°C，200r/ min振搖16h。再按1 %的體積吸取菌液接種于LB液體培養基中(含卡那霉素100 μ g/mL)， 37°C，200r/min振搖至菌液A_ = 0. 6 0. 8，加IPTG至終濃度為lmmol/L，誘導培養4h，離 心沉淀菌體，用SDS-PAGE分析(薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T.著(金冬燕，黎孟 楓，侯云德，等.譯校).分子克隆實驗指南.第2版，北京科學出版社，1995，846 847， 888 898)，在分子量2IkDa處可見表達產物蛋白條帶，與重組mHBc的理論推算值相符合。2. 3嵌合基因表達質粒的分子設計與構建根據模擬IBDV多表位基因5印is以及HBcAg修飾基因表達質粒pET-mHBc的雙酶 切位點和閱讀框，設計引物，并分別在正、反向引物的5'端加上酶切位點BamHI和EcoRI。正向引物5 ‘ -GCGGATCCCATGCCTAAGACTCATAATTCTGGTC-3 ‘反向引物5 ‘ -GCGAATTCAAACCAATTAGTAAAACCATGCCCATG-3 ‘以pET-5印is為模板，用PCR方法在5印is基因的5'和3'端分別加入BamH I 和EcoRI酶切位點，構建5印is亞克隆質粒pMD-5印is，將pMD_5印is用BamH I和EcoR I 雙酶切，1. O%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見兩條約250bp和2700bp的DNA片段，與5印is和 PMD載體的理論長度相符合(圖4中3泳道)。將pET-mHBc與pMD-5印is分別用BamH I禾Π EcoR I雙酶切，回收pET-mHBc片段 和5印is片段，用T4DNA連接酶連接，轉化E. coli TOPlO感受態細菌，獲得IBDV抗原表位 嵌合基因mHBc-5印is表達質粒pET-mHBc-5印is，用MiniBEST質粒純化試劑盒提取質粒， BamH I和EcoR I雙酶切鑒定，可見兩條約250bp和5800bp的DNA片段(圖4中4泳道)。 mHBc-5印is測序結果(SEQ ID NO. 1)與實驗設計一致(圖5)2. 4嵌合基因表達產物的分析2. 4. 1SDS-PAGE將pET-mHBc-5印is轉化宿主菌E. coli BL21 (DE3)，涂布1. 5%瓊脂LB平板(含卡 那霉素100 μ g/mL)，挑取單菌落接種于LB液體培養基中(含卡那霉素100 μ g/mL)，37°C， 200r/min振搖16h。再按的體積吸取菌液接種于LB液體培養基中(含卡那霉素100 μ g/ mL)，37°C，200r/min振搖至菌液 A6qq = 0. 6 0. 8，加 IPTG 至終濃度為 lmmol/L，37°C，200r/ min,誘導培養4h。收集重組菌培養物，用15% SDS-PAGE電泳分析，在分子量29kDa處可見 表達蛋白(SEQ ID N0. 2)產物，與嵌合基因mHBc-5印is編碼蛋白的分子量理論值相符合。 用Bandscan 5. O軟件分析，表達量占菌體總蛋白的47. 6% (圖6中3、4泳道)。2. 4. 2ffestern blotting
SDS-PAGE電泳完畢后，將蛋白條帶轉印到硝酸纖維素膜(NC膜)上，轉印后的NC 膜用5%脫脂奶粉4°C封閉過夜，先后用第一抗體(雞抗IBDV高免血清1 100稀釋)和 第二抗體(HRP標記的兔抗雞IgG抗體1 1000稀釋)與轉印后的NC膜反應，DAB底物顯 色，重組菌誘導物與雞抗IBDV高免血清反應，在分子量29kDa處出現一條帶，與SDS-PAGE 的分析結果一致(圖6中6泳道)。2. 4. 3電鏡檢查將誘導后的重組菌超聲破碎，3000r/min離心5min，取上清液 ，部分用電鏡負染技 術觀察；部分與雞的IBDV高免血清混合，37°C反應Ih后，4°C過夜，3000r/min離心5min， 取上清液，用電鏡負染技術觀察，均可見病毒樣顆粒(virus-like particles，VLP或者 subviral particle, SVP)，直徑約為 60 80nm(圖 7)。2. 4. 4 夾心 ELISA用純化的雞抗IBDV IgG包被ELISA反應板，濃度5 μ g/mL，100 μ 1/孔，4°C過夜， PBST洗滌，用含10%小牛血清的PBST封閉。將超聲破碎的重組菌懸浮液分別加入ELISA板 反應孔，100μ 1/孔，37°C，2h，PBST洗滌；加入1 1000稀釋的HRP標記的雞抗IBDV IgG， 100 μ 1/孔，370C，lh, PBST洗滌，加入TMB顯色液，用2Μ H2SO4終止，測A450值，分析結果。實 驗同步設立IBDV抗原為陽性對照、Ε. coli BL21(DE3)為陰性對照、PBST為空白對照。超聲 破碎的重組菌懸浮液抗原效價達到2Χ102，IBDV抗原為陽性；而Ε. coli BL21(DE3)和PBST 則均為陰性。序列表<110>中國人民解放軍南京軍區軍事醫學研究所江蘇省農業科學院<120>IBDV抗原表位與HBcAg嵌合基因的分子設計<1；30> 說明書<160>8<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>798<212>DNA<213>人工合成<220><221> 嵌合基因 mHBc-5印is<222>(1). . (798)<223><400>1atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60tctgactttt ttccttccgt cagagatctc ctagacaccg cctcagctct gtatcgggaa 120gccttagagt ctcctgagca ttgctcacct caccatactg cactcaggca agcaattctc 180tgctgggggg aattgatgac tctagctacc tgggtgggta ataacttgga ggatcccatg 240cctaagactc ataattctgg tcgttctaat gtggatggtg gaggttcgac gcttcatctg 300ccgcatttgt ggcggcctct ttctggtgga ggttcgcata atgcgaagta tgtgtcggct 360
gagtcttggg gtggaggttc gcatccggat agtattcatc cgtttctggc gtctcctggt 420ggaggttcgg atactcttca tgggcatggt tttactaatt ggtttgaatt ctccccagca 480tctagggatc tagtagtcaa ttatgttaat actaacatgg gtttaaagat caggcaacta 540ttgtggtttc atatatcttg ccttactttt ggaagagaga ctgtacttga atatttggtc 600tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcctatagac caccaaatgc ccctatctta 660tcaacacttc cggaaactac tgtggttaga cgacgggacc gaggcaggtc ccctagaaga 720agaactccct cgcctcgcag acgcagatct caatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct 780cgggaatctc aatgttag798<210>2<211>265<212>PRT<213>人工合成<220><221>嵌合基因的重組蛋白<222>(1). . (265)<223><400>2Met Asp lie Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu151015Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp202530Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys354045Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala lie Leu Cys Trp Gly Glu505560Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Met65707580Pro Lys Thr His Asn Ser Gly Arg Ser Asn Val Asp Gly Gly Gly Ser859095Thr Leu His Leu Pro His Leu Trp Arg Pro Leu Ser Gly Gly Gly Ser100105110His Asn Ala Lys Tyr Val Ser Ala Glu Ser Trp Gly Gly Gly Ser His115120125Pro Asp Ser lie His Pro Phe Leu Ala Ser Pro Gly Gly Gly Ser Asp130135140Thr Leu His Gly His Gly Phe Thr Asn Trp Phe Glu Phe Ser Pro Ala145150155160Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys165170 175
lie Arg Gln Leu Leu Trp Phe His lie Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg180185190Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp lie Arg Thr195200205Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro lie Leu Ser Thr Leu Pro210215220Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg225230235240Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg245250255Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys260265<210>3<211>30<212>DNA<213> 人工<220><221>P1<222>(1). . (30)<223><400>3gatataccat ggacattgac ccttataaag30<210>4<211>32<212>PRT<213> 人工<220><221>P2<222>(1). . (32)<223><400>4Gly Thr Thr Cys Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Thr Cys Thr Ala Ala151015Cys Ala Thr Thr Gly Ala Gly Ala Thr Thr Cys Cys Cys Gly Ala Gly202530<210>5<211>30<212>DNA<213>IBDV單克隆抗體
<220><221>P3<222>(1). . (30)
<223><400>5gaattctgga tcctccaagt tattacccac30<210>6<211>31<212>PRT<213> 人工<220><221>P4<222>(1). . (31)<223><400>6Gly Gly Ala Gly Gly Ala Thr Cys Cys Ala Gly Ala Ala Thr Thr Cys151015Thr Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys Ala Thr Cys Thr Ala Gly Gly202530<210>7<211>34<212>DNA<213> 人工<220><221>嵌合基因表達質粒正向引物<222>(1). . (34)<223><400>7gcggatccca tgcctaagac tcataattct ggtc34<210>8<211>35<212>PRT<213> 人工<220><221>嵌合基因表達質粒反向引物<222>(1). . (35)<223><400>8
Gly Cys Gly Ala Ala Thr Thr Cys Ala Ala Ala Cys Cys Ala Ala Thr
151015Thr Ala Gly Thr Ala Ala Ala Ala Cys Cys Ala Thr Gly Cys Cys Cys202530Ala Thr Gly3權利要求
模擬傳染性法氏囊病病毒IBDV多表位5epis與乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg嵌合基因，該嵌合基因mHBc-5epis序列為SEQ ID NO.1。
2.權利要求1所述嵌合基因的重組蛋白，其序列為SEQID NO. 2。
3.根據權利要求2所述的重組蛋白，是通過分子設計獲得的，具體包括第一步根據HBcAg基因序列設計引物，并在正向引物Pl與反向引物P2的5'端分別 加上酶切位點Nco I與Hind III Pl 5' -GATATACCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3‘ P2 5' -GTTCCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAG-3‘以肝炎患者血清為模板用PCR擴增HBcAg基因片段500bp，與pMD18_T載體連接，轉化 E. coli TOPlO感受態細菌，獲得含有HBcAg基因的重組克隆質粒pMD_HBc ；第二步運用重疊延伸PCR技術在重組克隆質粒pMD-HBc中的HBcAg基因的231 232 位核苷酸，即77 78位氨基酸殘基之間插入BamH I和EcoR I酶切位點，在重疊延伸PCR 引物P3和引物P4的5'端分別加上酶切位點BamH I和EcoR I P3 5' -GAATTCTGGATCCTCCAAGTTATTACCCAC-3‘ P4 5' -GGAGGATCCAGAATTCTCCCCAGCATCTAGG-3‘以pMD-HBc為模板，分別用引物Pl和P3，引物P4和P2擴增得到PCR產物P13和P42， 再以P13和P42共同作模板，用引物Pl和P2擴增得到PCR產物，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分 析，回收目的DNA片段，構建含BamH I和EcoR I位點的HBcAg修飾基因Modified HBc,簡 稱mHBc，與pMD18-T載體連接，可見兩條大小分別約為580bp和2700bp的條帶，獲得含BamH I和EcoR I位點的HBcAg修飾基因mHBc重組克隆質粒pMD-mHBc ；將pMD-mHBc和pET_28a 分別用NcoI和HindIII酶切，構建含有BamH I和EcoR I酶切位點的mHBc重組原核表達 質粒 pET-mHBc ；第三步根據模擬IBDV多表位基因5印is以及HBcAg修飾基因表達質粒pET-mHBc的 雙酶切位點和閱讀框，設計弓丨物，并分別在正、反向引物的5'端加上酶切位點BamH I和EcoR I 正向引物 5 ‘ -GCGGATCCCATGCCTAAGACTCATAATTCTGGTC-3 ‘ 反向引物 5 ‘ -GCGAATTCAAACCAATTAGTAAAACCATGCCCATG-3 ‘以pET-5印is為模板，用PCR方法在5印is基因的5'和3'端分別加入BamH I和 EcoRI酶切位點，構建5印is亞克隆質粒pMD-5印is ；將pET-mHBc與pMD-5印is分別用BamH I禾口 EcoR I雙酶切，回收pET-mHBc片段和 5印is片段，用T4 DNA連接酶連接，轉化E. coli TOPlO感受態細菌，獲得IBDV抗原表位嵌 合基因 mHBc-5epis 表達質粒 pET-mHBc_5epis。第四步將pET-mHBc-5印is轉化宿主菌E. coli BL21 (DE3)，涂布1. 5%瓊脂LB平板該 平板含卡那霉素100 μ g/mL，挑取單菌落接種于含卡那霉素100 μ g/mL的LB液體培養基中， 370C，200r/min振搖16h，再按1 %的體積吸取菌液接種于含卡那霉素100 μ g/mL的LB液 體培養基中，37°C，200r/min振搖至菌液A6tltl = 0. 6 0. 8，加IPTG至終濃度為lmmol/L， 37°C，200r/min,誘導培養4h，收集重組菌培養物，獲得IBDV抗原表位5印is與HBcAg嵌合 基因病毒樣顆粒重組蛋白。
4.權利要求2或3所述嵌合基因重組蛋白在IBD新型檢測試劑或基因工程疫苗方面的 應用。
全文摘要
本發明涉及IBDV抗原表位與HBcAg嵌合基因的分子設計，屬于生物制藥領域。運用重疊延伸PCR技術，構建HBcAg修飾基因表達質粒pET-mHBc。將傳染性法氏囊病病毒多表位基因5epis定向插入到該表達質粒mHBc基因中，獲得表達質粒pEt-mHBc-5epis，在大腸桿菌中表達。重組嵌合蛋白的分子量約29kDa，表達量約占菌體總蛋白的47.6％；呈病毒樣顆粒直徑約60nm～80nm；抗原效價達到2.0×102。本發明構建成功5epis與HBcAg嵌合基因，在大腸桿菌中高效表達了具有IBDV抗原反應性的重組嵌合蛋白并形成了病毒樣顆粒，具有成為顆粒化表位型IBD基因工程疫苗的應用前景。
文檔編號C12N15/62GK101818162SQ20091023240
公開日2010年9月1日 申請日期2009年11月27日 優先權日2009年11月27日
發明者劉小娟, 唐雨德, 歐陽偉, 王忠燦, 王曉麗, 王永山, 諸玉梅 申請人:中國人民解放軍南京軍區軍事醫學研究所;江蘇省農業科學院