本發明涉及一種羅漢果的種植方法。更具體地說，本發明涉及一種提高羅漢果甜苷V含量的方法。
背景技術：
：羅漢果為中國特有的珍貴藥用和甜料植物。其果實性涼、味甘，具有清熱潤肺，利咽開音，滑腸通便和抗癌等功效，活性成分甜苷V為世界上最強的非糖甜味物質之一，是蔗糖甜度的300～400倍，廣泛應用于食品、保健品和藥品中，是糖尿病人、肥胖者和高血壓患者的理想糖替代品。然而，甜苷V只存在占果重不足15％的果肉內，且含量僅為1％左右，嚴重制約了羅漢果產業的健康發展。茉莉酸甲酯作為植物信號誘導子能夠安全有效地激發植物次生代謝物的產生和積累。因此，優選合適的茉莉酸甲酯施用時間和濃度，可以最大限度地提高藥用植物活性成分的含量。現有技術中未見有茉莉酸甲酯提高羅漢果甜苷V含量的報道。技術實現要素：本發明的目的是提供一種提高羅漢果甜苷V含量的方法，其能有效地提高羅漢果甜苷V的產量，具有見效快、成本低、操作簡單、方便實施、產品無毒無殘留等特征，能滿足羅漢果甜苷V的大規模生產。為了實現根據本發明的這些目的和其它優點，提供了一種提高羅漢果甜苷V含量的方法，包括以下步驟：步驟一、將茉莉酸甲酯溶于體積分數為20％的乙醇水溶液中，配制成濃度為50mmol/L的茉莉酸甲酯的乙醇母液，備用；將茉莉酸甲酯溶于乙醇中，配制成濃度為50～400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，備用；步驟二、將羅漢果組培苗接種在固體培養基中，在相對濕度為60～66％、光照強度為1400lux、光照時間為8h/d、培養溫度為23±2℃的條件下培養30d，其中，固體培養基的制作方法為：在制作固體培養基時將步驟一中制得的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到固體培養基中，至茉莉酸甲酯的最終濃度為50～400μmol/L后，將固體培養基滅菌，冷卻至24～26℃；固體培養基還包含：MS、1.5mg/L6-芐氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L瓊脂、30g/L蔗糖和1.0g/L活性炭；步驟三、將步驟二中培養后的組培苗移栽至田間，在羅漢果授粉后50～60d，每天早、中、晚各噴灑一次步驟一中制得的茉莉酸甲酯溶液，至葉面滴水為止，連續噴灑10d。優選的是，所述的提高羅漢果甜苷V含量的方法中，所述步驟一中在制得茉莉酸甲酯的乙醇母液后，還包括用孔徑為0.22μm的微孔濾膜對茉莉酸甲酯的乙醇母液進行滅菌的步驟。優選的是，所述的提高羅漢果甜苷V含量的方法中，所述步驟二中將茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到固體培養基中后，向固體培養基中加入質量比為2:1的保水劑和牡蠣殼粉，每升固體培養基中，保水劑和牡蠣殼粉的總質量為30～50g，當固體培養基凝固時，保水劑和牡蠣殼粉全部均勻浸入固體培養基中。優選的是，所述的提高羅漢果甜苷V含量的方法中，所述步驟二中將羅漢果組培苗接種在固體培養基中后，每天向固體培養基的表面均勻噴灑溫度為40～45℃的殺菌劑，所述殺菌劑由以下重量份數的組分混合后制成：溶菌酶1～2份、溶壁酶2～3份、木醋液200～300倍液4～5份和水5～10份。本發明至少包括以下有益效果：本發明通過在羅漢果組培苗和種植羅漢果時施加茉莉酸甲酯，以誘導羅漢果甜苷V代謝關鍵酶(如葡萄糖基轉移酶和細胞色素P450酶等)基因的高表達，從而在短期內快速提高了羅漢果甜苷V的含量。由于固體培養基干化較快，培養物周邊容易堆積代謝產物，導致培養基的營養成分分布不均勻，也不利于培養物吸收有效成分。本發明在固體培養基中加入了保水劑和牡蠣殼粉，保水劑是一種吸水能力特別強的功能高分子材料，在固體培養基沒有凝固時，能吸收培養基中的有效成分，活化后的牡蠣殼粉具有微孔結構，也能吸附很多培養基中的有效成分，這樣能有效地保持營養成分，使營養成分的分布比較均勻，被保水劑和牡蠣殼粉吸收和吸附的營養成分能緩慢釋放出來，有利于培養物長效地吸收有效成分，從而能促進羅漢果組培苗的生長，有利于提高羅漢果甜苷V的含量。本發明將羅漢果組培苗接種在固體培養基中后，向固體培養基的表面均勻噴灑或涂抹殺菌劑，其中，溶菌酶能水解細菌的細胞壁，使細菌溶解，與病毒結合后能使病毒失活；溶壁酶能水解真菌的細胞壁，使真菌失活；木醋液具有殺菌、促進植物生長等作用，殺菌劑能起到屏障作用，能防止培養環境中的細菌、病毒和真菌影響羅漢果組培苗的生長，也能降低對培養環境的要求。本發明操作簡便，成本低，對環境友好，適于規模化生產，具有較強的實用性和推廣價值。本發明的其它優點、目標和特征將部分通過下面的說明體現，部分還將通過對本發明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。具體實施方式下面結合實施例對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。需要說明的是，下述實施方案中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法，所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。實施例1本發明提供一種提高羅漢果甜苷V含量的方法，包括以下步驟：步驟一、將茉莉酸甲酯溶于體積分數為20％的乙醇水溶液中，配制成濃度為50mmol/L的茉莉酸甲酯的乙醇母液，備用；將茉莉酸甲酯溶于乙醇中，配制成濃度為50μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，備用；步驟二、將羅漢果組培苗接種在固體培養基中，在相對濕度為60％、光照強度為1400lux、光照時間為8h/d、培養溫度為21℃的條件下培養30d，其中，固體培養基的制作方法為：在制作固體培養基時將步驟一中制得的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到固體培養基中，至茉莉酸甲酯的最終濃度為50μmol/L后，將固體培養基滅菌，冷卻至24℃，即降至室溫使固體培養基凝固；固體培養基還包含：MS、1.5mg/L6-芐氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L瓊脂、30g/L蔗糖和1.0g/L活性炭；即在制作固體培養基時，在瓊脂凝固前將茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到固體培養基中，混合均勻，瓊脂凝固后茉莉酸甲酯能均勻地存在于固體培養基中。步驟三、將步驟二中培養后的組培苗移栽至田間，在羅漢果授粉后50d，每天早、中、晚各噴灑一次步驟一中制得的茉莉酸甲酯溶液，至葉面滴水為止，連續噴灑10d，待果柄變為黃褐色、果皮轉成淡黃色時采樣，采用HPLC法進行羅漢果甜苷V含量檢測。所述的提高羅漢果甜苷V含量的方法中，所述步驟一中在制得茉莉酸甲酯的乙醇母液后，還包括用孔徑為0.22μm的微孔濾膜對茉莉酸甲酯的乙醇母液進行滅菌的步驟。能防止茉莉酸甲酯的乙醇母液攜帶細菌，影響組培苗的生長。所述的提高羅漢果甜苷V含量的方法中，所述步驟二中將茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到固體培養基中后，瓊脂凝固前，向固體培養基中加入質量比為2:1的保水劑和牡蠣殼粉，每升固體培養基中，保水劑和牡蠣殼粉的總質量為30g，當固體培養基凝固時，保水劑和牡蠣殼粉全部均勻浸入固體培養基中。由于固體培養基干化較快，培養物周邊容易堆積代謝產物，導致培養基的營養成分分布不均勻，也不利于培養物吸收有效成分。在固體培養基中加入了保水劑和牡蠣殼粉，保水劑是一種吸水能力特別強的功能高分子材料，在固體培養基沒有凝固時，能吸收培養基中的有效成分，活化后的牡蠣殼粉具有微孔結構，也能吸附很多培養基中的有效成分，這樣能有效地保持營養成分，使營養成分的分布比較均勻，被保水劑和牡蠣殼粉吸收和吸附的營養成分能緩慢釋放出來，有利于培養物長效地吸收有效成分，從而能促進羅漢果組培苗的生長，有利于提高羅漢果甜苷V的含量。所述的提高羅漢果甜苷V含量的方法中，所述步驟二中將羅漢果組培苗接種在固體培養基中后，每天向固體培養基的表面均勻噴灑溫度為40℃的殺菌劑，所述殺菌劑由以下重量份數的組分混合后制成：溶菌酶1份、溶壁酶2份、木醋液200倍液4份和水5份。將羅漢果組培苗接種在固體培養基中后，向固體培養基的表面均勻噴灑或涂抹殺菌劑，其中，溶菌酶能水解細菌的細胞壁，使細菌溶解，與病毒結合后能使病毒失活；溶壁酶能水解真菌的細胞壁，使真菌失活；木醋液具有殺菌、促進植物生長等作用，殺菌劑能起到屏障作用，能防止培養環境中的細菌、病毒和真菌影響羅漢果組培苗的生長，也能降低對培養環境的要求。實施例2本發明提供一種提高羅漢果甜苷V含量的方法，包括以下步驟：步驟一、將茉莉酸甲酯溶于體積分數為20％的乙醇水溶液中，配制成濃度為50mmol/L的茉莉酸甲酯的乙醇母液，備用；將茉莉酸甲酯溶于乙醇中，配制成濃度為400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，備用；步驟二、將羅漢果組培苗接種在固體培養基中，在相對濕度為66％、光照強度為1400lux、光照時間為8h/d、培養溫度為25℃的條件下培養30d，其中，固體培養基的制作方法為：在制作固體培養基時將步驟一中制得的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到固體培養基中，至茉莉酸甲酯的最終濃度為400μmol/L后，將固體培養基滅菌，冷卻至26℃，即降至室溫使固體培養基凝固；固體培養基還包含：MS、1.5mg/L6-芐氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L瓊脂、30g/L蔗糖和1.0g/L活性炭；即在制作固體培養基時，在瓊脂凝固前將茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到固體培養基中，混合均勻，瓊脂凝固后茉莉酸甲酯能均勻地存在于固體培養基中。步驟三、將步驟二中培養后的組培苗移栽至田間，在羅漢果授粉后60d，每天早、中、晚各噴灑一次步驟一中制得的茉莉酸甲酯溶液，至葉面滴水為止，連續噴灑10d，待果柄變為黃褐色、果皮轉成淡黃色時采樣，采用HPLC法進行羅漢果甜苷V含量檢測。所述的提高羅漢果甜苷V含量的方法中，所述步驟一中在制得茉莉酸甲酯的乙醇母液后，還包括用孔徑為0.22μm的微孔濾膜對茉莉酸甲酯的乙醇母液進行滅菌的步驟。能防止茉莉酸甲酯的乙醇母液攜帶細菌，影響組培苗的生長。所述的提高羅漢果甜苷V含量的方法中，所述步驟二中將茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到固體培養基中后，向固體培養基中加入質量比為2:1的保水劑和牡蠣殼粉，每升固體培養基中，保水劑和牡蠣殼粉的總質量為50g，當固體培養基凝固時，保水劑和牡蠣殼粉全部均勻浸入固體培養基中。由于固體培養基干化較快，培養物周邊容易堆積代謝產物，導致培養基的營養成分分布不均勻，也不利于培養物吸收有效成分。在固體培養基中加入了保水劑和牡蠣殼粉，保水劑是一種吸水能力特別強的功能高分子材料，在固體培養基沒有凝固時，能吸收培養基中的有效成分，活化后的牡蠣殼粉具有微孔結構，也能吸附很多培養基中的有效成分，這樣能有效地保持營養成分，使營養成分的分布比較均勻，被保水劑和牡蠣殼粉吸收和吸附的營養成分能緩慢釋放出來，有利于培養物長效地吸收有效成分，從而能促進羅漢果組培苗的生長，有利于提高羅漢果甜苷V的含量。所述的提高羅漢果甜苷V含量的方法中，所述步驟二中將羅漢果組培苗接種在固體培養基中后，每天向固體培養基的表面均勻噴灑溫度為45℃的殺菌劑，所述殺菌劑由以下重量份數的組分混合后制成：溶菌酶2份、溶壁酶3份、木醋液300倍液5份和水10份。將羅漢果組培苗接種在固體培養基中后，向固體培養基的表面均勻噴灑或涂抹殺菌劑，其中，溶菌酶能水解細菌的細胞壁，使細菌溶解，與病毒結合后能使病毒失活；溶壁酶能水解真菌的細胞壁，使真菌失活；木醋液具有殺菌、促進植物生長等作用，殺菌劑能起到屏障作用，能防止培養環境中的細菌、病毒和真菌影響羅漢果組培苗的生長，也能降低對培養環境的要求。實施例3本發明提供一種提高羅漢果甜苷V含量的方法，包括以下步驟：步驟一、將茉莉酸甲酯溶于體積分數為20％的乙醇水溶液中，配制成濃度為50mmol/L的茉莉酸甲酯的乙醇母液，備用；將茉莉酸甲酯溶于乙醇中，配制成濃度為220μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，備用；步驟二、將羅漢果組培苗接種在固體培養基中，在相對濕度為63％、光照強度為1400lux、光照時間為8h/d、培養溫度為23℃的條件下培養30d，其中，固體培養基的制作方法為：在制作固體培養基時將步驟一中制得的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到固體培養基中，至茉莉酸甲酯的最終濃度為220μmol/L后，將固體培養基滅菌，冷卻至25℃，即降至室溫使固體培養基凝固；固體培養基還包含：MS、1.5mg/L6-芐氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L瓊脂、30g/L蔗糖和1.0g/L活性炭；即在制作固體培養基時，在瓊脂凝固前將茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到固體培養基中，混合均勻，瓊脂凝固后茉莉酸甲酯能均勻地存在于固體培養基中。步驟三、將步驟二中培養后的組培苗移栽至田間，在羅漢果授粉后55d，每天早、中、晚各噴灑一次步驟一中制得的茉莉酸甲酯溶液，至葉面滴水為止，連續噴灑10d，待果柄變為黃褐色、果皮轉成淡黃色時采樣，采用HPLC法進行羅漢果甜苷V含量檢測。所述的提高羅漢果甜苷V含量的方法中，所述步驟一中在制得茉莉酸甲酯的乙醇母液后，還包括用孔徑為0.22μm的微孔濾膜對茉莉酸甲酯的乙醇母液進行滅菌的步驟。能防止茉莉酸甲酯的乙醇母液攜帶細菌，影響組培苗的生長。所述的提高羅漢果甜苷V含量的方法中，所述步驟二中將茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到固體培養基中后，向固體培養基中加入質量比為2:1的保水劑和牡蠣殼粉，每升固體培養基中，保水劑和牡蠣殼粉的總質量為40g，當固體培養基凝固時，保水劑和牡蠣殼粉全部均勻浸入固體培養基中。由于固體培養基干化較快，培養物周邊容易堆積代謝產物，導致培養基的營養成分分布不均勻，也不利于培養物吸收有效成分。在固體培養基中加入了保水劑和牡蠣殼粉，保水劑是一種吸水能力特別強的功能高分子材料，在固體培養基沒有凝固時，能吸收培養基中的有效成分，活化后的牡蠣殼粉具有微孔結構，也能吸附很多培養基中的有效成分，這樣能有效地保持營養成分，使營養成分的分布比較均勻，被保水劑和牡蠣殼粉吸收和吸附的營養成分能緩慢釋放出來，有利于培養物長效地吸收有效成分，從而能促進羅漢果組培苗的生長，有利于提高羅漢果甜苷V的含量。所述的提高羅漢果甜苷V含量的方法中，所述步驟二中將羅漢果組培苗接種在固體培養基中后，每天向固體培養基的表面均勻噴灑溫度為42℃的殺菌劑，所述殺菌劑由以下重量份數的組分混合后制成：溶菌酶2份、溶壁酶2份、木醋液250倍液4份和水7份。將羅漢果組培苗接種在固體培養基中后，向固體培養基的表面均勻噴灑或涂抹殺菌劑，其中，溶菌酶能水解細菌的細胞壁，使細菌溶解，與病毒結合后能使病毒失活；溶壁酶能水解真菌的細胞壁，使真菌失活；木醋液具有殺菌、促進植物生長等作用，殺菌劑能起到屏障作用，能防止培養環境中的細菌、病毒和真菌影響羅漢果組培苗的生長，也能降低對培養環境的要求。對比例1本發明一種羅漢果的種植方法，包括以下步驟：步驟一、將羅漢果組培苗接種在固體培養基中，在相對濕度為60％、光照強度為1400lux、光照時間為8h/d、培養溫度為21℃的條件下培養30d；固體培養基包含：MS、1.5mg/L6-芐氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L瓊脂、30g/L蔗糖和1.0g/L活性炭，不含有茉莉酸甲酯；步驟三、將步驟二中培養后的組培苗移栽至田間，移栽后按常規方法種植，其他培養條件與實施例1～3相同，但不噴施茉莉酸甲酯溶液。實施例1～3和對比例1中，待果柄變為黃褐色、果皮轉成淡黃色時采樣，采用HPLC法進行羅漢果甜苷V含量檢測，結果見表1，表1中甜苷V含量指甜苷V含量占果實含量的百分數。表1實施例1～3和對比例1羅漢果甜苷V含量的檢測結果實施例實施例1實施例2實施例3對比例1甜苷V含量1.04％1.35％1.16％0.77％由表1可知，采用實施例1～3的方法與對比例1的方法相比，實施例1～3均能顯著提高羅漢果甜苷V的含量，說明在羅漢果組培苗和種植羅漢果時施加茉莉酸甲酯能有效地提高羅漢果甜苷V的含量，該方法見效快、成本低、操作簡單、方便實施，能為羅漢果甜苷V的大規模生產提供新思路。盡管本發明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發明并不限于特定的細節和這里示出與描述的實施例。當前第1頁1 2 3