本發(fā)明涉及分離提純技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種羅漢果中甜苷類的工業(yè)化分離提純方法。

背景技術(shù)：

羅漢果是一種天然的甜味劑，羅漢果的學(xué)名siraitiagrosvenori(swingle)c.)，是一種瓜科的，爬藤類的多年根生植物，藤的長度可以達(dá)到5m多，地下部分也有塊莖，主要分布在中國華南地區(qū)，晝夜溫差較大，多霧，氣候較為涼爽的區(qū)域，喜歡在生長在土壤較為柔軟，地面多腐植物的山地或斜坡等地。主要在中國廣西桂林地區(qū)種植。

羅漢果自古以來一般是經(jīng)過烘干，掰成碎塊后加水煎煮后，作為羅漢果茶飲用，羅漢果用水等抽提以后，一般作為料理的甜味劑使用。因為羅漢果對支氣管炎、扁桃腺炎、咽喉炎、止咳、祛痰、急性胃炎、便秘等有防治和治療效果，自古以來在中國是作為漢方的藥用果實來食用的。

羅漢果的甜味特性主要來自于各種三萜類的配糖體成分，其中主要是有羅漢果甜苷v,羅漢果甜苷iv，11-環(huán)氧羅漢果甜苷v，以及賽門苷i(以下簡稱為羅漢果甜苷類)等為羅漢果的主要的甜味成分，羅漢果的甜苷類物質(zhì)，除了具有跟蔗糖相比幾百倍的甜度和跟蔗糖非常近似的甜味，跟同樣是天然的甜味劑甜菊糖苷，以及甘草提取物相比，還具有綜合良好的甜味特點，另外由于羅漢果甜苷類物質(zhì)在體內(nèi)不參與能量代謝過程，可以作為減肥的甜味劑和糖尿病患者的甜味劑使用特點。

現(xiàn)有的技術(shù)方案中，曾用蛋白分解酶使羅漢果提取液中的蛋白質(zhì)低分子量化，從而簡單有效的將其分離純化而得到的產(chǎn)品，比市場上銷售的普通羅漢果提取物粉末產(chǎn)品的甜味品質(zhì)更為優(yōu)異。但是，對有一部分的食品合制造商來說，對于上述羅漢果精制粉末品還是會有一點點的關(guān)于風(fēng)味方面的不滿，所有對羅漢果精制粉末產(chǎn)品提出了跟高規(guī)格的要求，市場上需要提供具有更優(yōu)秀的甜味品質(zhì)的羅漢果甜苷類成分的組成物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種羅漢果中甜苷類的工業(yè)化分離提純方法，以解決上述背景 技術(shù)中提出的問題。

模擬移動床法，simulatedmovingbed，簡稱smb，從包含兩種以上成分的溶液中，根據(jù)各成分的層析移動速度的差別相對應(yīng)的把兩種成分一分為二的分離方法。具體過程是，在原液中包含的兩個以上的成分對應(yīng)成分直列連接填充4根以上單位的填充塔，在最下游部分的填充塔和最上游部分的填充塔的填充層連接，通過用原液和洗脫液，根據(jù)各個成分相對應(yīng)填充劑親合力的差別、原液供給口、洗脫液供給口、原液中含有的成分(填充層內(nèi)移動速度大的成分)剩下的成分(填充層內(nèi)移動速度的小的成分)擬似性地相對于填充層(固定相)洗脫液(移動相)的流動，反方向移動，使目的成分得到連續(xù)地分離的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種羅漢果中甜苷類的工業(yè)化分離提純方法，具體步驟如下：

(1)羅漢果濃縮液制備

將粉碎后的羅漢果干燥原料和水加入不銹鋼容器中，邊攪拌，在70～92℃下加熱處理1.0～3.2h，然后冷卻至20～30℃，過濾除去殘渣，再用濾芯式過濾泵進(jìn)行過濾，得到抽提液，加入蛋白分解酶，在33～67℃下攪拌進(jìn)行酶處理2.7～5.3h，得到酶處理液；

酶處理液用合成吸附樹脂處理，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.8～5.2％naoh溶液過液，再用水進(jìn)行水洗，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.8～5.2％的h2so4過液，再用水進(jìn)行沖洗，再過合成吸附樹脂，用水進(jìn)行水洗，再用醇溶液進(jìn)行過液，得到洗出液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進(jìn)行真空濃縮，得到羅漢果濃縮液；

(2)濃縮液分離

把酶處理液用合成樹脂進(jìn)行處理，先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.8～5.2％的naoh水溶液通過樹脂柱進(jìn)行活化處理，再用水通過樹脂柱，然后再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.8～5.2％的h2so4水溶液通過樹脂柱，然后再用水進(jìn)行洗滌，再將酶處理液通過樹脂柱，再用水洗滌樹脂柱，最后用體積分?jǐn)?shù)為48～72％的乙醇溶液通過樹脂柱，溶出得到醇溶出液，再將醇溶出液進(jìn)行真空濃縮以回收醇溶液，并得到濃縮液；

(3)提純

在樹脂柱中充填強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂，使用同樣的多根串聯(lián)連接的樹脂柱，洗脫液為44～76％乙醇水溶液，用定量泵以對串聯(lián)柱進(jìn)行循環(huán)，循環(huán)時間200～490min；檢測器設(shè)置在第1根～第4根樹脂柱的出口處，在uv203nm和uv280nm的兩種波長下，進(jìn)行連續(xù)檢測觀察。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述步驟(1)中，合成吸附樹脂先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2～5％的h2so4溶液調(diào)整ph為2.8～5.2。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述步驟(1)中，濾紙的孔徑為0.5～2.5μm。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述步驟(1)和步驟(2)中，醇溶液為體積分?jǐn)?shù)為30～60％的乙醇水溶液。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述步驟(1)中，蛋白分解酶包括但不限于絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、金屬蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、msd蛋白酶中的一種。

作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：所述步驟(3)中，強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂為苯乙烯磺酸鈉凝膠型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明方法，使得甜苷類與蛋白有效的分離，使羅漢果甜苷類成分的濃度達(dá)到80～98％，其中羅漢果甜苷ⅴ的含量達(dá)到65～80％，具有高濃度，高效精制分離的優(yōu)點，成本低，污染小。

附圖說明

圖1為經(jīng)過酶處理的羅漢果甜苷類提取物與低分子化蛋白質(zhì)的smb分離圖。

圖2為未經(jīng)過酶處理的羅漢果甜苷類提取物與蛋白質(zhì)的smb分離圖。

圖3為smb系統(tǒng)裝置示意圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實 施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實施例1

(1)羅漢果濃縮液的調(diào)制

將1000g的羅漢果干燥原料和20l的自來水加入20l的不銹鋼容器中，在80℃下，加熱攪拌2h，冷卻至25℃；用30目的鋼絲網(wǎng)過篩，并用孔徑為1μm的濾紙過濾器過濾，得到過濾提取液；在提取液加入1l水和50g蛋白分解酵素(蛋白酶msd)攪拌，在45℃下酶處理5h，得到處理液；處理液用合成吸附樹脂(三菱化學(xué)制造，鉆石離子hp20，1000ml)處理，并進(jìn)行活性化(用1000ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％naoh溶液以16ml/min的流速過液，再用3000ml水進(jìn)行水洗，再用1000ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的h2so4以16ml/min的流速過液，最后用3000ml的水進(jìn)行沖洗)，上述合成吸附樹脂用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的h2so4溶液調(diào)整ph為4.0，上述20l的提取液以16ml/min的流速過液，用3000ml的水進(jìn)行水洗。其次，羅漢果甜味的成分，羅漢果甜苷類成分分析，用4000ml體積分?jǐn)?shù)為60％的乙醇溶液以16ml/min的流速過液，得到洗出液3900ml。得到的洗出液為了去除乙醇，使用真空濃縮(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器)得到100g的羅漢果粗加工液，作為smb處理的試料。

(2)羅漢果抽提液的酶處理

將1000g的羅漢果干燥粉碎原料和20l水，加入20l的不銹鋼容器，邊攪拌下，在80℃下加熱處理2h，冷卻至25℃，用30目的金屬絲網(wǎng)過濾以除去殘渣，再用孔徑1μm的濾紙過濾，得到抽提液19l，加入1l水和50g蛋白分解酶(蛋白酶msd，日本天野公司，商品名)，在45℃下攪拌進(jìn)行酶處理5h；

(3)分離

把酶處理液用合成樹脂(三菱化學(xué)hp20，1000l)進(jìn)行處理，先用1000ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的naoh水溶液以16ml/min流速通過樹脂柱進(jìn)行活化處理，再用3000ml的水以相同的流速通過該樹脂柱，然后再用3000ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的h2so4水溶液以16ml/min的流速通過該樹脂柱，然后再用3000ml水以同樣的流速進(jìn)行洗滌，最后再將20l酶處理液以16ml/min的流速通過樹脂柱，再用3000ml的水以同樣的流速洗滌樹脂柱，最后用4000ml 體積分?jǐn)?shù)為60％的酒精水溶液以16ml/min的流速通過該樹脂柱，溶出得到3900ml的酒精溶出液，再將溶出液進(jìn)行真空濃縮器進(jìn)行濃縮回收酒精，得到100g的濃縮液，用作smb的試料。

smb處理條件，直徑50mm×長50cm玻璃柱中充填700ml苯乙烯磺酸鈉的凝膠型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂(ubk-550交聯(lián)度8％，水分含量46～49.5％，三菱化學(xué)(株))，使用同樣的4根串聯(lián)連接的玻璃柱，洗脫液為酒精濃度55％的含水乙醇，用定量泵以10ml/min的流速通過4根串聯(lián)柱進(jìn)行循環(huán)(循環(huán)時間280min)；檢測器設(shè)置在smb裝置的第1～第4柱的出口處，用波長uv203內(nèi)nm(羅漢果甜苷類檢測用)和uv280nm(蛋白檢測用)的2種波長下，進(jìn)行連續(xù)檢測觀察。

本實驗，用酶處理過得到的羅漢果濃縮液和沒有酶處理的羅漢果濃縮液進(jìn)行對比試驗。上述的smb循環(huán)過程中的第1個柱的入口，添加50g處理。第1號出口洗脫液的uv230nm和uv280nm的檢測結(jié)果如圖2和圖3所顯示的那樣，酶處理過的羅漢果濃縮液存在2個峰(峰a，峰b；圖2中顯示)，峰a為羅漢果甜苷類，峰b為低分子化的蛋白質(zhì)，兩個成分已經(jīng)得到很好的分離。因此，在smb系統(tǒng)的第三個柱出口處，把相當(dāng)于峰a面積約30％的溶出液導(dǎo)入到smb系統(tǒng)外的回收桶中進(jìn)行回收。同時，加入跟回收的液量相同量的展開溶劑繼續(xù)進(jìn)行循環(huán)。通過此操作，回收的得到峰a的30％相當(dāng)?shù)幕厥找菏菐缀醪缓头肿踊牡鞍踪|(zhì)的羅漢果甜苷類成分。

其次，smb系統(tǒng)的第4個柱的出口處，把相當(dāng)于峰b面積約30％的液體量導(dǎo)出到smb系統(tǒng)外的回收桶中。與上述操作過程相同，把與回收液同等量的展開溶劑在回收的同時繼續(xù)追加循環(huán)下去。通過操作，回收得到的峰b的30％相當(dāng)?shù)幕厥找?蛋白質(zhì)畫分)中，幾乎是不含羅漢果甜苷類成分的低分子化蛋白質(zhì)成分。

這兩種回收液經(jīng)過濃縮粉末化后，進(jìn)行羅漢果甜苷類含量和蛋白質(zhì)含量測定，同smb處理前的羅漢果甜苷類含量75.8％(羅漢果甜苷ⅴ含量60.4％)相比，峰a回收液由來的羅漢果甜苷類成分含量達(dá)到98.5％(羅漢果sidⅴ含量是78.8％)，用此方法使羅漢果甜苷類成分得到了高度的純化。峰b回收液中沒有檢測出含有羅漢果甜苷類。

由此證明，利用smb裝置系統(tǒng)，可以把羅漢果提取液中的蛋白質(zhì)含量幾乎除去干凈，從而得到高純度的羅漢果甜苷類成分的組成物產(chǎn)品是可以工業(yè)化制造的，此方法是切實可以的。

另一方面，沒有經(jīng)過酶處理的羅漢果濃縮液，兩個峰沒有被分離(圖3)。因此也根據(jù)以上酶處理過的羅漢果粗精制液的實驗操作一樣，針推沒有酶處理過的羅漢果濃縮液進(jìn)行了相同實驗操作。其結(jié)果是smb處理后的羅漢果甜苷類和蛋白質(zhì)的羅漢果甜苷類含量測定分別為76.2％(羅漢果甜苷ⅴ含量59.2％)，smb處理前的羅漢果甜苷類含量75.2％(羅漢果甜苷ⅴ含量58.9％)，兩個結(jié)果相比，羅漢果甜苷類的含量沒有明顯的得到提高。

由此可見，用smb裝置系統(tǒng)對沒有經(jīng)過酶處理的羅漢果濃縮液，羅漢果甜苷類和蛋白質(zhì)不能被有效的分離。

sbm系統(tǒng)裝置(如圖1)，因為是不斷連續(xù)循環(huán)的，因此系統(tǒng)內(nèi)部未回收成分從第1個柱子又返回到入口。這時要是添加新的試樣，就會和系統(tǒng)內(nèi)的殘留的目的成分一起開始進(jìn)行第二個周期循環(huán)的色譜層析分離過程，同樣也會產(chǎn)生同第一個循環(huán)相同的分離現(xiàn)象。在各個各柱子的出口處，設(shè)置檢測器，和進(jìn)行同樣的連續(xù)檢測操作，由此就可以制造出高濃度的羅漢果甜苷類成分的精制產(chǎn)品。如果把導(dǎo)出的各個組分溶液，用反滲透膜等方法等除去溶液內(nèi)的成分后，又可以再次使用，這樣將會大大的降低成本，和減少對環(huán)境的污染。

羅漢果甜苷的含量測定

羅漢果精制粉末樣品0.05g，用分析天平精確稱量，加入100ml容量瓶，用100ml蒸餾水加滿至容量瓶刻度，作為hplc的分析試樣。hplc的分析條件如下：色譜柱種類shodexasahipaknh2p-504e(id4.6×250mm)，展開溶劑75％ch3cn(isocratic)、流速0.8ml/min、檢出器od210nm、光電二極管檢測器(200-700nm，吸光度測定)，注射量：20μl。利用羅漢果甜苷v標(biāo)品(和光純藥工業(yè))在100-600ppm濃度下，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行測定試樣中羅漢果甜苷類含量的測定。然后再根據(jù)hplc的分析羅漢果甜苷v，甜苷iv，11-環(huán)氧羅漢果甜苷v以及賽門苷的峰面積和吸光度的大小計算甜苷類的各自的組成比和實際的含量 比。得到的該試樣的羅漢果甜苷的組成比為：羅漢果甜苷v80.9％，羅漢果甜苷iv1.5％，11-環(huán)氧羅漢果甜苷v15％，賽門苷2.6％。

另外，蛋白質(zhì)的含量根據(jù)kjeldahlmethod測定。

實施例2

實施例1所得到的用smb精制的羅漢果精制成品和smb沒有進(jìn)行處理的羅漢果粗加工產(chǎn)品，其羅漢果甜苷類及蛋白質(zhì)含量測定的結(jié)果如表1所示。兩個產(chǎn)品中含有的羅漢果甜苷類的各成分的組成，大體上相同，羅漢果甜苷v有78.3％，羅漢果甜苷iv有1.5％、11-環(huán)氧羅漢果甜苷v有18.1％、賽門苷i為2.1％。

表1

表1的結(jié)果，本發(fā)明的smb處理的產(chǎn)品，同未經(jīng)smb處理產(chǎn)品相比，其蛋白質(zhì)的含量與羅漢果甜苷類的含量比明顯有了特別的降低，降低了將近10倍。

實施例3甜味評價

實施例1調(diào)制的smb處理的本發(fā)明的產(chǎn)品和smb未處理的產(chǎn)品，對其甜味品質(zhì)進(jìn)行了品嘗評分。兩種不同試料用純水調(diào)制成為相同羅漢果甜苷類濃度相同濃度(480ppm)溶液，對照標(biāo)準(zhǔn)樣以白砂糖10％的濃度水溶液作為對比標(biāo)準(zhǔn)樣，甜味品質(zhì)的評價，把甜味品質(zhì)的基本性能分為以下幾項內(nèi)容：豐滿的甜味感、后甜味、苦味、厚重的甜味、清爽甜味感、質(zhì)地重的甜味感、異樣甜味感、澀味、刺激性，進(jìn)行打分評估，甜味品質(zhì)的評價，采用10個優(yōu)選的人員進(jìn)行官能測定。每一個項目都跟標(biāo)準(zhǔn)的糖水進(jìn)行對比，按照以下1-5級 打分制進(jìn)行評估打分，標(biāo)準(zhǔn)的10％的白砂糖水的標(biāo)準(zhǔn)分為3分。10個人的全項目的評估結(jié)果的平均值(sttd)和標(biāo)準(zhǔn)偏差值(sd)的結(jié)果列表與表2。

表2

甜味的評價標(biāo)準(zhǔn)：＞5，不好；＞3，和蔗糖一樣；＞1，好。

表2的結(jié)果顯示，smb處理過的羅漢果產(chǎn)品比較smb未處理羅漢果產(chǎn)品具有更優(yōu)越的甜味品質(zhì)。根據(jù)以上結(jié)論，本發(fā)明的羅漢果甜苷類成分的組成物具有非常良好的甜味品質(zhì)。

根據(jù)以上的結(jié)果，用蛋白質(zhì)分解酶處理過的蛋白質(zhì)低分子化的羅漢果提取液作為smb裝置系統(tǒng)的試料，經(jīng)過smb系統(tǒng)處理后，羅漢果甜苷類的含量可以達(dá)到65-99％的純度，其蛋白質(zhì)的含量可以降低到相比于羅漢果甜苷類150重量部對0.2重量部以下的結(jié)果，由此證明了高純度，幾乎不含蛋白質(zhì)含量的羅漢果甜苷類成分的精制方法，高效的低成本的工業(yè)化生產(chǎn)是可行的。而且其產(chǎn)品具有非常優(yōu)異的甜味品質(zhì)，幾乎等同于蔗糖的甜味品質(zhì)。

對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應(yīng)將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。不應(yīng)將權(quán)利要求中的任何附圖標(biāo)記視為限制所涉及的權(quán)利要求。