本發明屬于植物組織培養技術的再生領域，具體涉及到一種馬鈴薯莖尖培養基、制備方法及其應用。
背景技術：
由于環境的污染或是病毒代代的累積，現在的植物中已經沉積了大量的病毒，導致植物病變影響產品的質量與數量；若是食用性植物，將嚴重影響人們的健康，其中，屬于無性繁殖的植物，在生長過程中極易受到病毒的感染，例如，侵染馬鈴薯病毒多達30多種，而且隨著時間的推移，植物一代一代的遺傳，侵染馬鈴薯病毒種類會越來越多，現在馬鈴薯病毒已經成為全球普遍性的問題，嚴重影響農業的發展。
目前，人們通用的化學類藥劑僅僅對細菌或真菌導致的病害有效，但是對病毒浸染的植物作用極小，因此，培養無病毒植物苗具有重要的現實意義和應用價值。常用的防治病毒方法為物理法，即通過X射線、紫外線和高溫等進行處理，達到鈍化病毒的目的，但是，物理法在防治病毒中屬于小概率殺毒，而且同時也對植株造成了傷害，例如：基因突變或是組織受損等。還有化學法殺毒，使用抑制病毒復制的藥物進行殺毒，但是同時會對寄主組織造成了傷害，推廣性差。工業中常用的方法為生物學方法，即對種子、愈傷組織或是莖尖進行培養，但是種子培養只針對有性繁殖有效，愈傷組織培養易變異，因此，常用的手段為莖尖脫毒培養，而且周期短、成活率高等優點。
莖尖培養的脫毒原理是由于莖尖是新生長組織，或是激素含量的不同，導致病毒感染的幾率小，含量低，因此，莖尖培養已經成為解決馬鈴薯病毒的主要途徑，但是，莖尖培養技術需要進一步改進。
公開號為105532479A的中國專利公開了一種馬鈴薯莖尖分化培養基及制備方法。所述培養基的配方中含有L-半胱胺酸鹽酸鹽，以1L培養基計算，所述L-半胱胺酸鹽酸鹽的含量為0.1mg。所述配方為①或②，①：MS培養基+吲哚乙酸0.1mg/L+6-芐基嘌呤0.1mg/L+赤霉酸0.1mg/L+L-半胱胺酸鹽酸鹽0.1mg/L+30g/L蔗糖+5-7g/L瓊脂粉；②：MS培養基+NAA 0.1mg/L+6-芐基嘌呤0.1mg/L+赤霉酸0.1mg/L+L-半胱胺酸鹽酸鹽0.1mg/L+30g/L蔗糖+5-7g/L瓊脂粉。該發明在馬鈴薯組培用培養基(MS培養基)中添加L-半胱氨酸鹽酸鹽，作為抗氧劑，減少褐化現象，以增加馬鈴薯莖尖分生組織的成苗率。但是在莖尖培養過程中使用1個濃度的MS培養基銨態氮含量過高，而且還加入了其他營養物質，會使莖尖培養中生長速度慢，而且L-半胱氨酸鹽酸鹽在光照條件下易分解，破壞培養基的電解質平衡，不僅如此，分解產生的物質不確定，可能會影響植物的發育。
技術實現要素：
為了進一步改進現有技術，促進莖尖培養的生長速度與出苗率，本發明公開了一種馬鈴薯莖尖培養基及其應用。本發明是對MS培養基的進一步改良，使之更適應馬鈴薯莖尖的培養。
本發明技術方案如下所示：
一種馬鈴薯莖尖培養基，所述的培養基配方為：0.8MS培養基、150-250mg/L KNO3、40-100mg/L Ca(H2PO4)2·H2O、0.1-0.3mg/L龍葵堿、0.2-0.4mg/L吲哚乙酸、0.2-0.5mg/L 6-芐基嘌呤、0.05-0.2mg/L赤霉酸、0.5-1mg/L谷胱甘肽、25-35g/L蔗糖和8-10g/L瓊脂。。
進一步的，所述的培養基配方為：0.8MS培養基、210mg/L KNO3、65mg/L Ca(H2PO4)2·H2O、0.15mg/L龍葵堿、0.3mg/L吲哚乙酸、0.3mg/L 6-芐基嘌呤、0.12mg/L赤霉酸、0.7mg/L谷胱甘肽、32g/L蔗糖和9g/L瓊脂。
其中MS培養基的配比為：大量元素為：NH4NO31650，KNO31900，CaCl2·2H2O 440，MgSO4·7H2O 370，KH2PO4170微量元素：KI 0.83，H3BO36.2，MnSO4·4H2O 22.3，ZnSO4·7H2O 8.6，Na2MoO4·2H2O 0.25，CuSO4·5H2O 0.025，CoCl2·6H2O 0.025，鐵鹽：FeSO4·7H2O(27.8)，Na2-EDTA·2H2O(37.3)，有機物質：肌醇100，煙酸0.5，鹽酸吡哆醇(維生素B6)0.5，鹽酸硫胺素(維生素B1)0.1，甘氨酸2.0，單位為mg/L。
進一步的，本發明提供了所述的馬鈴薯莖尖培養基的制備方法，步驟為
S1：將MS培養基稀釋至濃度為原來的0.8倍，然后加入KNO3、Ca(H2PO4)2·H2O、龍葵堿、吲哚乙酸、6-芐基嘌呤、赤霉酸、谷胱甘肽，攪拌均勻，得液體A；
S2：取1/3步驟S1制得的液體A倒人小鋁鍋中煮沸，再將蔗糖、瓊脂傾人小鋁鍋中，邊加熱邊攪拌，直至瓊脂全部融化即清澈見底為止，然后倒入余下的液體A，攪拌均勻，得膠狀物B；
S3：使用1M的NaOH或HCl溶液調節步驟S2得到的膠狀物B的pH值至5.8，115-125℃蒸汽滅菌，滅菌15-25分鐘，降至室溫，即得。
進一步的，步驟S1和S2中的攪拌速度為45-60r/min。
進一步的，所述的馬鈴薯莖尖培養基在馬鈴薯莖尖誘導組織培養中的應用。
培養方法為：在無菌環境下，從消毒后的馬鈴薯莖尖上剝去生長在錐外圍的幼葉和葉原基，直至露出圓滑的生長錐。切取0.2-0.4mm帶有1-2片葉原基的生長錐，接種在所述的培養基上，置于22-25℃，光照強度2200-2800LX，12-16h/d的光照條件下培養。
磷酸二氫鈣：被稱為重過磷酸鈣，為灰白色粉末，含有效P4O10高達30％～45％，為普通過磷酸鈣的兩倍以上。重過磷酸鈣主要用作酸性磷肥。將磷酸二氫鈣應用到供給植物磷、鈣等元素，可用作基肥、根外追肥、葉面噴灑。與氮肥混合使用，有固氮作用，減少氮的損失。能促進植物的發芽、長根、分枝、結實及成熟，可用作生產復混肥的原料。本發明將Ca(H2PO4)2·H2O應用到培養基中，發現添加適量濃度的Ca(H2PO4)2·H2O，可以促進莖尖的發育，提高生長速度。
龍葵堿：廣泛存在于馬鈴薯、番茄及茄子等茄科植物中。在番茄青綠色未成熟時，里面含有龍葵堿。馬鈴薯發芽后，其幼芽和芽眼部分的龍葵堿含量高達0.3％～0.5％。
谷胱甘肽：是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結合，含有巰基的的三肽，具有抗氧化作用和整合解毒作用。谷胱甘肽參與生物轉化作用，其中植物生長會使機體代謝產生的過多自由基會損傷生物膜，加快機體衰老，尤其是培養基中植物，抵抗力弱，加入谷胱甘肽可以提高馬鈴薯的成活率。
本發明是在MS培養基的基礎上將其稀釋，然后添加了KNO3、Ca(H2PO4)2·H2O、龍葵堿、吲哚乙酸、6-芐基嘌呤、赤霉酸、谷胱甘肽、蔗糖和瓊脂。其中稀釋MS基礎培養基的目的是減少氮源中氨鹽的含量，減少銨態氮的含量，有利于培養物的生長，成苗率高；加入的KNO3一方面是為了補充硝態氮元素，另一方面是為了補充鉀元素，適當的提高鉀元素的含量，有利于發芽率；加入的Ca(H2PO4)2·H2O與氮源混合使用，有固氮作用，減少氮的損失，而且促進植物的生長；本發明還加入了少量的龍葵堿，廣泛存在于馬鈴薯的幼芽中，試驗證明加入少量的龍葵堿可以促進馬鈴薯的出苗率；添加的谷胱甘肽有利于提高植物的抵抗力，保持植物旺盛生命力，并且減少愈傷組織的褐化。
與現有技術相比，本發明具有以下優點：
1、本發明提供的馬鈴薯莖尖培養基是在MS基礎培養基的改良，豐富了培養基的營養物質，提高了馬鈴薯的質量。
2、本發明提供的培養基對馬鈴薯的脫毒具有良好的效果，進一步的改進了馬鈴薯苗的品質。
3、本發明培養基促進了馬鈴薯的生長速度，減少了育苗周期，降低了成本，有利于提高脫毒效率。
具體實施方式
通過以下具體實施例對本發明作進一步說明，但并非是對本發明的限制。本發明培養基購自北京拜爾迪生物技術有限公司供應的Sigma的MS培養基。
實施例1
一種馬鈴薯莖尖培養基，所述的培養基配方為：0.8MS培養基、210mg/L KNO3、65mg/L Ca(H2PO4)2·H2O、0.15mg/L龍葵堿、0.3mg/L吲哚乙酸、0.3mg/L 6-芐基嘌呤、0.12mg/L赤霉酸、0.7mg/L谷胱甘肽、32g/L蔗糖和9g/L瓊脂。
所述培養基的制備方法為，步驟為：
S1：將MS培養基稀釋至濃度為原來的0.8倍，然后加入KNO3、Ca(H2PO4)2·H2O、龍葵堿、吲哚乙酸、6-芐基嘌呤、赤霉酸、谷胱甘肽，攪拌均勻，攪拌速度為50r/min，得液體A；
S2：取1/3步驟S1制得的液體A倒人小鋁鍋中煮沸，再將蔗糖、瓊脂傾人小鋁鍋中，邊加熱邊攪拌，攪拌速度為50r/min，直至瓊脂全部融化即清澈見底為止，然后倒入余下的液體A，攪拌均勻，得膠狀物B；
S3：使用1M的NaOH或HCl溶液調節步驟S2得到的膠狀物B的pH值至5.8，120℃蒸汽滅菌，滅菌20分鐘，降至室溫，即得。
實施例2
一種馬鈴薯莖尖培養基，所述的培養基配方為：0.8MS培養基、150mg/L KNO3、40mg/L Ca(H2PO4)2·H2O、0.3mg/L龍葵堿、0.2mg/L吲哚乙酸、0.5mg/L 6-芐基嘌呤、0.05mg/L赤霉酸、1mg/L谷胱甘肽、25g/L蔗糖和10g/L瓊脂。
所述培養基的制備方法與實施例1類似。
實施例3
一種馬鈴薯莖尖培養基，所述的培養基配方為：0.8MS培養基、250mg/L KNO3、100mg/L Ca(H2PO4)2·H2O、0.1mg/L龍葵堿、0.4mg/L吲哚乙酸、0.2mg/L 6-芐基嘌呤、0.2mg/L赤霉酸、0.5mg/L谷胱甘肽、35g/L蔗糖和8g/L瓊脂。
所述培養基的制備方法與實施例1類似。
對比例1
一種馬鈴薯莖尖培養基，所述的培養基配方為：0.8MS培養基、210mg/L KNO3、65mg/L Ca(H2PO4)2·H2O、0.15mg/L龍葵堿、0.3mg/L吲哚乙酸、0.3mg/L 6-芐基嘌呤、0.12mg/L赤霉酸、0.85mg/L L-半胱胺酸鹽酸鹽、32g/L蔗糖和9g/L瓊脂。
與實施例1相比，區別是將谷胱甘肽替換為L-半胱胺酸鹽酸鹽。
所述培養基的制備方法與實施例1類似。
試驗例1
培養基：實施例1-3、對比例1制得的馬鈴薯莖尖培養基。
在無菌環境下，從消毒后的馬鈴薯(中薯5號)莖尖上剝去生長在錐外圍的幼葉和葉原基，直至露出圓滑的生長錐。切取0.3mm帶有2片葉原基的生長錐，接種在所述的培養基上，置于24℃，光照強度2500LX，14h/d的光照條件下培養，3天換一次培養基，每個試驗處理3次重復，每個重復50個莖尖，培養50天觀察成苗率和芽的生長表現，具體結果如表1所示。
表1莖尖生長狀況
從表1中可以看出，本發明實施例1-3培養基培養的出苗率達到了93％以上，成苗時間28.5-32天，移栽成活率在91％以上，幼苗葉片深綠、莖部健壯、無黃化現象，移栽后植株健壯、根系質量好，說明經過改良后的MS培養基有利于馬鈴薯的莖尖培養，而與對比例1相比，將谷胱甘肽替換為L-半胱胺酸鹽酸鹽，成苗時間稍短，而且移栽成活率略低于本發明，植株質量也稍差，原因可能是L-半胱胺酸鹽酸鹽的光不穩定。
綜上所述，本發明豐富了培養基的營養物質，提高了馬鈴薯植株的質量，促進了馬鈴薯的生長速度，減少了育苗周期，降低了成本，有利于提高脫毒效率。
上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。