本發明涉及一種生殖醫學醫療衛生技術領域，特別是一種胚胎玻璃化冷凍器及使用方法。

背景技術：

患者在進行IVF(ICSI)----體外受精(卵胞漿內單精子顯微注射技術)治療時，在一個超排治療周期中一般會獲得多個質量好的胚胎，但在本周期中往往不能一次全部移植或不宜移植，可以將剩余或全部的優質胚胎進行冷凍保存。胚胎冷凍保存可使病人在一個治療周期中獲得多次胚胎移植的機會，使胚胎的利用率達到了最大的限度，大大提高了IVF(ICSI)治療的成功率。

胚胎冷凍保存技術是指采用慢速或快速的降溫方法，將胚胎低溫冷凍，然后超低溫保存在-196℃的液氮中。目前胚胎冷凍保存技術有慢速程序化冷凍技術和玻璃化冷凍技術兩種，玻璃化冷凍技術比慢速程序化冷凍技術具有簡單、快速、臨床妊娠率和胚胎著床率高的優點，因此目前各大生殖中心基本上采用玻璃化冷凍胚胎進行保存。在進行玻璃化冷凍的過程中，在最后一步胚胎放入冷凍液后要在60秒內置于載桿上并投入液氮，但胚胎會浮在冷凍液上層難以在60秒內吸取，尤其是對剛參加工作操作不熟練的實驗室工作人員，如何簡化胚胎玻璃化冷凍操作，避免操作失誤，提高玻璃化冷凍胚胎復蘇后的存活率(目前的存活率為94％)成為本行業急需解決的問題。

技術實現要素：

本發明所要解決的問題是提供一種結構簡單、使用方便、玻璃化冷凍胚胎復蘇后存活率高的胚胎玻璃化冷凍器及使用方法。

為了解決上述技術問題，本發明提供一種胚胎玻璃化冷凍器，包括殼體、拉桿、壓桿、拉桿活塞、壓桿活塞、彈簧、冷凍液吸管及胚胎針；所述殼體內腔的上半部被分隔形成了相互獨立的壓縮腔Ⅰ和壓縮腔Ⅱ，殼體內腔的下半部為廢液腔，所述壓縮腔Ⅰ和壓縮腔Ⅱ均與廢液腔相連通；

所述殼體頂端設置有兩個各自連通壓縮腔Ⅰ、壓縮腔Ⅱ的開口；

位于壓縮腔Ⅰ內的拉桿活塞與壓縮腔Ⅰ的內側壁密封的滑動相連，拉桿的底部穿過連通壓縮腔Ⅰ的開口后與拉桿活塞固定相連；在壓縮腔Ⅰ的上下端分別設置用于限定拉桿活塞滑動位置的拉桿活塞上限限定環、拉桿活塞下限限定環；

位于壓縮腔Ⅱ內的壓桿活塞與壓縮腔Ⅱ的內側壁密封的滑動相連，壓桿的底部穿過連通壓縮腔Ⅱ的開口后與壓桿活塞固定相連；在壓縮腔Ⅱ的上下端分別設置用于限定壓桿活塞滑動位置的壓桿活塞上限限定環和彈簧固定環，在壓桿活塞和彈簧固定環之間設置彈簧，所述彈簧的兩端分別抵接壓桿活塞和彈簧固定環；

所述殼體側壁上設置有連通廢液腔頂部的冷凍液吸管；所述冷凍液吸管下端設置有冷凍腔，胚胎針的端部位于冷凍腔內。

作為本發明的胚胎玻璃化冷凍器的改進：所述胚胎針包括均中空且上下相連通的胚胎針上段和胚胎針下段，胚胎針上段的頂部伸入冷凍腔內；

所述胚胎針上段的頂部為網狀半球形，網孔的孔徑小于胚胎的直徑；

胚胎針下段的下端為開口端。

備注說明：胚胎針上段的頂部為網狀半球形；這樣的結構既可以攔截住胚胎，使胚胎始終位于胚胎針上段的頂部，而不會進入冷凍腔和冷凍液吸管；又能確保液體的通過。

胚胎針上段和胚胎針下段的內腔橫截面大于胚胎的直徑，從而胚胎在胚胎針內的移動。

作為本發明的胚胎玻璃化冷凍器的進一步改進：所述胚胎針上段與胚胎針下段的夾角為145～155°(較佳為150°)。

作為本發明的胚胎玻璃化冷凍器的進一步改進：

拉桿頂端設置有拉板，拉板的尺寸大于連通壓縮腔Ⅰ的開口的尺寸，拉板位于壓縮腔Ⅰ的上方；

壓桿頂端設置有壓板，壓板的尺寸大于連通壓縮腔Ⅱ的開口的尺寸，壓板位于壓縮腔Ⅱ的上方。

作為本發明的胚胎玻璃化冷凍器的進一步改進：壓縮腔Ⅰ的容積大于壓縮腔Ⅱ的容積。

作為本發明的胚胎玻璃化冷凍器的進一步改進：壓縮腔Ⅰ的橫截面大于壓縮腔Ⅱ的橫截面。

作為本發明的胚胎玻璃化冷凍器的進一步改進：所述殼體的外表面設置有平衡液刻度線。

作為本發明的胚胎玻璃化冷凍器的進一步改進：冷凍腔(15)為球狀空腔。

本發明還同時提供了上述胚胎玻璃化冷凍器的使用方法，包括以下步驟：

1)、先向下按動拉板，使拉桿在壓縮腔Ⅰ中向下移動，直至拉桿活塞與拉桿活塞下限限定環相接觸為止；然后向下按動壓板，壓桿在壓縮腔Ⅱ中向下移動，壓桿活塞壓縮彈簧，直至彈簧被壓縮至極限為止；殼體內的空氣被壓縮后通過冷凍液吸管、再經胚胎針排出殼體外；

先將胚胎針下段開口端置入含有胚胎的培養液中，之后松開壓板，壓桿在彈簧彈力的作用下復原，使殼體內的壓力小于環境壓力，產生的吸力吸取含有胚胎的培養液；含有胚胎的培養液依次經過胚胎針下段、胚胎針上段進入位于冷凍腔內的胚胎針上段的頂部；胚胎被截留在胚胎針上段的頂部；培養液先通過胚胎針上段頂部的網孔進入冷凍腔內，再沿著冷凍液吸管流入廢液腔內；

2)、將胚胎針下段開口端置入平衡液中，向上拉動拉板，使拉桿在壓縮腔Ⅰ中向上移動，在殼體內外空氣壓差的作用下胚胎針下段開口端吸取平衡液，平衡液依次經過胚胎針下段、胚胎針上段、胚胎針上段頂部的網孔進入冷凍腔從而實現培養液的被置換；當于拉桿的作用下拉桿活塞被拉升至底端與平衡液刻度線平行時，保持6～10分鐘(例如為8分鐘)然后進行下述步驟3)；

備注說明：該步驟2)的作用是將胚胎針、冷凍腔和冷凍液吸管中的培養液全部替換成平衡液；被替換的培養液以及多余的平衡液會從冷凍腔經過冷凍液吸管流入廢液腔中；

3)、將胚胎針下段開口端置入冷凍液中，往上繼續拉動拉板，直至拉桿活塞與拉桿活塞上限限定環相接觸為止，在殼體內外空氣壓差的作用下胚胎針下段開口端吸取冷凍液；冷凍液依次經過胚胎針下段、胚胎針上段、胚胎針上段頂部的網孔進入冷凍腔從而實現平衡液的被置換；保持30±3秒然后進行下述的步驟4)

備注說明：該步驟3)的作用是將胚胎針、冷凍腔和冷凍液吸管中的平衡液迅速的全部替換冷凍液；被替換的平衡液以及多余的冷凍液會從冷凍腔經過冷凍液吸管流入廢液腔中；

4)、向下按動壓板，壓桿在壓縮腔Ⅱ中向下移動，在殼體內外空氣壓差的作用下，殼體內的氣體將位于胚胎針上段頂部內的胚胎從胚胎針中排出至載桿的胚胎載片上，之后將載桿迅速投入液氮中(迅速投入液氮中，此為常規技術)。

作為本發明的胚胎玻璃化冷凍器的使用方法的改進：

當在拉桿的作用下拉桿活塞被拉升至底端與平衡液刻度線平行時，從胚胎針下段開口端吸入的平衡液為200μL；

當拉桿活塞被繼續拉升至與拉桿活塞上限限定環相接觸時，從胚胎針下段開口端吸入的冷凍液為200μL。

本發明具有如下技術優勢：

1、本發明在冷凍胚胎過程中只需在顯微鏡下吸放胚胎各1次，無需像現有技術需要在顯微鏡下吸放胚胎3次，簡化了操作；

2、分別設置了大容積的壓縮腔Ⅰ和小容積的壓縮腔Ⅱ，大容積的壓縮腔Ⅰ用于較大體積的平衡液和冷凍液的吸取，是通過抽拉拉桿實現的；小容積的壓縮腔Ⅱ可以提供較為靈敏的吸放力用于體積極小的胚胎(即，含有胚胎的培養液)吸放，是通過壓縮彈簧實現的；

3、冷凍液吸管下端設置有球狀的冷凍腔，該形狀的冷凍腔中可以容納足夠多的平衡液或冷凍液，可以將胚胎細胞胞質中的水替換成平衡液中的低溫保護劑；胚胎針伸入冷凍腔的一端為網狀半球形，其允許液體通過又可以將胚胎攔截在胚胎針內的處于網狀半球形一端，使胚胎一直在胚胎針中，不會流入冷凍液吸管內。

4、胚胎針分為胚胎針下段與胚胎針上段，胚胎針下段與胚胎針上段呈一定角度(即，夾角為145～155°，較佳為150°)，在將胚胎置于載桿上的胚胎載片時，胚胎針下段可與顯微鏡載物臺平行，可以清楚觀察到胚胎在其中的位置。

綜上所述，本發明大大簡化了胚胎玻璃化冷凍的過程，使用時將需要玻璃化冷凍保存的胚胎(即，含胚胎的培養液)吸入胚胎針，再依次吸取平衡液和冷凍液，最后將胚胎置于載桿上并迅速投入液氮中，這個優化后的冷凍過程無需像傳統冷凍過程需要重復吸放胚胎，特別是解決了胚胎放入冷凍液后會上浮難以在60秒內吸取的難題。采用本發明后存活率能達到98％。

附圖說明

下面結合附圖對本發明的具體實施方式作進一步詳細說明。

圖1為本發明中胚胎玻璃化冷凍器的整體結構示意圖；

圖2為圖1的剖面示意圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此。

實施例1、一種胚胎玻璃化冷凍器，如圖1～2所示，包括殼體1、拉桿2、壓桿3、拉桿活塞4、壓桿活塞5、彈簧6、拉桿活塞上限限定環7、拉桿活塞下限限定環11、壓桿活塞上限限定環8、彈簧固定環12、冷凍液吸管14及胚胎針10。

殼體1為圓柱形空腔(帶有頂和底)，殼體1內腔的上半部設置有兩個直徑一大一小的平行的圓柱形空腔，大的圓柱形空腔為壓縮腔Ⅰ91，小的圓柱形空腔為壓縮腔Ⅱ92，壓縮腔Ⅰ91的容積大于壓縮腔Ⅱ92的容積，且，壓縮腔Ⅰ91的橫截面大于壓縮腔Ⅱ92的橫截面。

壓縮腔Ⅰ91和壓縮腔Ⅱ92被相互隔離，互不相通。殼體1內腔的下半部為廢液腔93，所述壓縮腔Ⅰ91和壓縮腔Ⅱ92均與廢液腔93相連通；廢液腔93用于吸收廢棄/多余的胚胎培養液、平衡液或冷凍液。

殼體1頂端設置有兩個各自連通壓縮腔Ⅰ91和壓縮腔Ⅱ92的開口。

位于壓縮腔Ⅰ91內的拉桿活塞4與壓縮腔Ⅰ91的內側壁密封的滑動相連，拉桿2的底部穿過連通壓縮腔Ⅰ91的開口后與拉桿活塞4固定相連；在壓縮腔Ⅰ91的上下端分別設置用于限定拉桿活塞4滑動位置的拉桿活塞上限限定環7、拉桿活塞下限限定環11。拉桿活塞上限限定環7和拉桿活塞下限限定環11將拉桿活塞4的位置限定在兩者之間，具有防止拉桿活塞4脫出壓縮腔Ⅰ91的作用。拉桿2頂端設置有拉板21，拉板21的尺寸大于連通壓縮腔Ⅰ91的開口的尺寸，拉板21位于壓縮腔Ⅰ91的上方。

位于壓縮腔Ⅱ92內的壓桿活塞5與壓縮腔Ⅱ92的內側壁密封的滑動相連，壓桿3的底部穿過連通壓縮腔Ⅱ92的開口后與壓桿活塞5固定相連；在壓縮腔Ⅱ92的上下端分別設置用于限定壓桿活塞5滑動位置的壓桿活塞上限限定環8和彈簧固定環12，在壓桿活塞5和彈簧固定環12之間設置彈簧6，所述彈簧6的兩端分別抵接壓桿活塞5和彈簧固定環12。當壓桿活塞5與壓桿活塞上限限定環8相接觸時，壓桿活塞5恰好與彈簧6接觸，但是沒有對彈簧6產生壓力。彈簧6的同心圓直徑比壓桿活塞5略小，能防止彈簧6與壓縮腔Ⅱ92內壁接觸。壓桿活塞上限限定環8和彈簧固定環12將壓桿活塞5的位置限定在兩者之間，具有防止壓桿活塞5脫出壓縮腔Ⅱ92的作用。壓桿3頂端設置有壓板31，壓板31的尺寸大于連通壓縮腔Ⅱ92的開口的尺寸，壓板31位于壓縮腔Ⅱ92的上方。

設置拉板21和壓板31均能方便使用操作。

殼體1側壁上設置有連通廢液腔93頂部的冷凍液吸管14；所述冷凍液吸管14下端設置有冷凍腔15，所述冷凍腔15為球狀空腔。

胚胎針10包括均中空且上下相連的胚胎針上段101和胚胎針下段102，胚胎針上段101和胚胎針下段102相連通；胚胎針上段101的頂部伸入冷凍腔15內，即，胚胎針上段101的頂部位于冷凍腔15內。胚胎針10的內徑(即，胚胎針上段101的內徑和胚胎針下段102的內徑)比早期胚胎的直徑略大，從而便于胚胎順利在該胚胎針10中的移動。

所述胚胎針上段101的頂部為網狀半球形，網孔的孔徑小于胚胎的直徑；這樣既可以攔截住胚胎，使胚胎始終位于胚胎針上段101的頂部，而不會進入冷凍腔15和冷凍液吸管14；又能確保液體(包括培養液、平衡液、冷凍液)通過該網孔進入冷凍腔15內。胚胎針下段102的下端為開口端，該開口端為圓形開口，便于胚胎的吸取。

所述胚胎針上段101與胚胎針下段102的夾角為145～155°(較佳為150°)。此角度時，在立體顯微鏡下，手持胚胎玻璃化冷凍器，胚胎針下段102可與顯微鏡載物臺平行，在將胚胎置于載桿時，可觀察到胚胎在胚胎針下段102中的位置，可以在胚胎剛剛到達胚胎針下段102的開口端時，再將胚胎針下段102的開口端置于載桿的胚胎載片上，從而實現將胚胎置于胚胎載片上，這樣可以讓胚胎載片上冷凍液的量最少。

殼體1的外表面設置有平衡液刻度線16。

本發明的胚胎玻璃化冷凍器屬于一次性使用器具。

本發明的實際使用過程：

1)、先向下按動拉板21，使拉桿2在壓縮腔Ⅰ91中向下移動，直至拉桿活塞4與拉桿活塞下限限定環11相接觸為止；然后向下按動壓板31，壓桿3在壓縮腔Ⅱ92中向下移動，壓桿活塞5壓縮彈簧6，直至彈簧6被壓縮至極限為止；殼體1內的空氣被壓縮后通過冷凍液吸管14、再經胚胎針10排出殼體1外；

先將胚胎針下段102的開口端置入含有胚胎的培養液中；之后松開壓板31，壓桿3在彈簧6彈力的作用下重新復原，從而使殼體1內的壓力小于環境壓力；產生的吸力吸取含有胚胎的培養液，含有胚胎的培養液依次經過胚胎針下段102、胚胎針上段101，進入位于冷凍腔15內的胚胎針上段101的頂部；胚胎被截留在胚胎針上段101的頂部；培養液先通過胚胎針上段101頂部的網孔進入冷凍腔15內，再沿著冷凍液吸管14流入廢液腔93內。此過程需要使用顯微鏡載物臺觀察，因為胚胎肉眼幾乎不可見。

2)、將胚胎針下段102開口端置入平衡液中，向上拉動拉板21，使拉桿2在壓縮腔Ⅰ91中向上移動，在殼體1內外空氣壓差的作用下胚胎針下段102開口端吸取平衡液，平衡液依次經過胚胎針下段102、胚胎針上段101、胚胎針上段101頂部的網孔進入冷凍腔15從而實現培養液的被置換；當于拉桿2的作用下拉桿活塞4被拉升至底端與平衡液刻度線16平行時，保持8分鐘然后進行下述步驟3)。

當拉桿活塞4被拉升至底端與平衡液刻度線16平行時，從胚胎針下段102開口端吸入的平衡液的體積為200μL。吸入的平衡液的體積過大會浪費平衡液，也會讓后續需要吸取的冷凍液不足200μL；過低會使吸取的平衡液不足200μL，從而影響胚胎的預平衡。

備注說明：該步驟2)的作用是將胚胎針10、冷凍腔15和冷凍液吸管14中的培養液全部替換成平衡液；被替換的培養液以及多余的平衡液會從冷凍腔15經過冷凍液吸管14流入廢液腔93中。

3)、將胚胎針下段102開口端置入冷凍液中，往上繼續拉動拉板21，直至拉桿活塞4與拉桿活塞上限限定環7相接觸為止，在殼體1內外空氣壓差的作用下胚胎針下段102開口端吸取冷凍液；冷凍液依次經過胚胎針下段102、胚胎針上段101、胚胎針上段101頂部的網孔進入冷凍腔15從而實現平衡液的被置換；保持30秒然后進行下述的步驟4)。

此步驟中，從胚胎針下段102開口端吸入的冷凍液的體積為200μL。

備注說明：該步驟3)的作用是將胚胎針10、冷凍腔15和冷凍液吸管14中的平衡液迅速替換冷凍液；被替換的平衡液以及多余的冷凍液會從冷凍腔15經過冷凍液吸管14流入廢液腔93中；

4)、向下按動壓板31，壓桿3在壓縮腔Ⅱ92中向下移動，在殼體1內外空氣壓差的作用下，殼體1內的氣體將位于胚胎針上段101頂部(此胚胎針上段101頂部位于冷凍腔15中)內的胚胎從胚胎針10中排出至載桿的胚胎載片上，之后將載桿迅速投入液氮中。此過程需要使用顯微鏡載物臺觀察，因為胚胎肉眼幾乎不可見。

載桿例如可選用KITAZATO Biopharma公司生產的玻璃化冷凍載桿。載桿作為冷凍胚胎的載體，可以在載桿上標記胚胎信息，置入液氮中保存，需要復蘇胚胎時，可以根據標記的信息從液氮中取出需要的冷凍胚胎進行解凍。

本發明先把胚胎放入較低濃度的玻璃化溶液(平衡液)中，平衡一定時間，使平衡液中的低溫保護劑滲入胞質；然后將胚胎移入較高濃度的玻璃化溶液(冷凍液)中，既可縮短平衡時間又可防止低溫保護劑的化學毒性并限制其過度滲透。

采用本發明，胚胎的存活率能達到98％。

對比例1、僅僅取消實施例1中的位于壓縮腔Ⅱ92的彈簧6的使用，其余等同于實施例1。

使用該裝置進行胚胎玻璃化冷凍實驗時，會導致出現吸放胚胎時，推拉壓桿3產生的吸放力難以控制，不能很好的吸取和釋放胚胎；還會導致將含胚胎的冷凍液置于載桿的胚胎載片上時液滴過大的不利情況；因此，使用該裝置最終的胚胎存活率僅為78％。

對比例2、取消實施例1中整個壓縮腔Ⅱ92，包括相應的取消以下所有部件：連通壓縮腔Ⅱ92的開口、壓桿3、壓桿活塞5、彈簧6、壓桿活塞上限限定環8和彈簧固定環12。其余等同于實施例1。

使用該裝置進行胚胎玻璃化冷凍實驗時，會導致出現推拉拉桿2產生的吸放力太大，可能導致胚胎損傷或丟失不利情況；因此，使用該裝置最終的胚胎存活率僅為61％。

對比例3-1、將平衡液刻度線16在殼體1上的位置相對于實施例1而言向上移動，即，當拉桿活塞4被拉升至底端與平衡液刻度線16平行時，從胚胎針下段102開口端吸入的平衡液的體積由200μL改為300μL。其余等同于實施例1。

使用該裝置進行胚胎玻璃化冷凍實驗時，會導致出現在步驟3)中不能很好排盡平衡液，從而稀釋冷凍液的不利情況；因此，使用該裝置最終的胚胎存活率僅為85％。

對比例3-2、將平衡液刻度線16在殼體1上的位置相對于實施例1而言向下移動，即，當拉桿活塞4被拉升至底端與平衡液刻度線16平行時，從胚胎針下段102開口端吸入的平衡液的體積由200μL改為100μL。其余等同于實施例1。

使用該裝置進行胚胎玻璃化冷凍實驗時，會導致出現平衡液未填滿冷凍腔15，低溫保護劑不能完全滲入胚胎細胞胞質，后續放入液氮中細胞內會形成冰晶，從而造成細胞損傷的不利情況；因此，使用該裝置最終的胚胎存活率僅為80％。

對比例4、將壓縮腔Ⅰ91、壓縮腔Ⅱ92的橫截面改成大小一致，當然，壓縮腔Ⅰ91的高度仍然大于壓縮腔Ⅱ92，即，壓縮腔Ⅰ91的容積仍然大于壓縮腔Ⅱ92的容積。其余等同于實施例1。

使用該裝置進行胚胎玻璃化冷凍實驗時，會導致出現吸放含胚胎的培養液時敏感度下降，將胚胎置于載桿的胚胎載片上時會出現液滴的大小難以掌握的不利情況；因此，使用該裝置最終的胚胎存活率僅為76％。

對比例5、將實施例1中的“冷凍液吸管14連通廢液腔93的頂部”改成“冷凍液吸管14連通廢液腔93的中間部位”；其余等同于實施例1。

使用該裝置進行胚胎玻璃化冷凍實驗時，會導致出現當廢液的液面超過冷凍液吸管14連通廢液腔93的位置時，廢液會稀釋冷凍液吸管14中甚至冷凍腔15的冷凍液的不利情況；因此，使用該裝置最終的胚胎存活率僅為82％。

對比例6、僅僅取消實施例1中與冷凍液吸管14連接的冷凍腔15，其余等同于實施例1。

使用該裝置進行胚胎玻璃化冷凍實驗時，會導致出現低溫保護劑不能很好的置換胚胎中的水分，后續放入液氮中細胞內會形成冰晶，從而造成細胞損傷的不利情況；因此，使用該裝置最終的胚胎存活率僅為66％。

最后應說明的是：以上各實施例僅用于說明本發明的技術方案，而非對其限制；盡管參照簽署各實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前處各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離發明各實施例方案的范圍。