本發明屬于植物繁殖技術領域，涉及一種適用于油桐組培快繁方法。
背景技術：
油桐（Vernicia fordii (Hemsl.) Airy Shaw），大戟科油桐屬，屬落葉喬木，樹皮灰色，枝條粗壯，葉卵圓形，花雌雄同株，花萼外面密被棕褐色微柔毛；花瓣白色，有淡紅色脈紋，倒卵形，子房密被柔毛，核果近球狀，種皮木質。花果期3-9月。分布于中國的陜西、河南、江蘇、安徽、浙江、江西、福建、臺灣、湖南、湖北、廣東、海南、廣西、四川、貴州、云南等省區。油桐與油茶、核桃、烏桕并稱中國四大木本油料植物。油桐生于1000米以上的地區，喜溫暖 ，忌嚴寒 。冬季氣溫落差18℃有利于油桐生長發育 ，但長期處在－10℃以下會引起凍害。適生于緩坡及向陽谷地，盆地及河床兩岸臺地。富含腐殖質、土層深厚、排水良好、中性至微酸性沙質壤土最適油桐生長。組織培養能通過無性繁殖，遺傳樹種的優良特性，能在短時間內快速繁殖獲得大量優質的組培苗，為優質種源推廣提供可能。
技術實現要素：
本發明的目的是針對油桐組織培養過程中芽增殖系數低，生長緩慢等問題,提供一種生長效果好、擴繁快的油桐嫩枝組培繁殖方法。
為了實現上述發明目的，本發明的技術方案如下：
一種適用于油桐的組培快繁方法，包括外植體選擇、外植體處理、初始芽誘導培養、增殖培養、壯芽培養和生根培養工序，采集半木質化、生長健壯的當年生油桐嫩枝作為外植體，對外植體進行修剪、滅菌消毒處理后接種于初始芽誘導培養基中獲取初始芽，再將初始芽接種于增殖培養基中經過3-4個周期增殖培養，形成叢生芽，將叢生芽接入壯芽培養基中培養，最后將高≥2cm的單芽插入生根培養基中誘導生根，具體操作步驟如下：
（1）外植體選擇：采集半木質化、生長健壯的當年生油桐嫩枝作為外植體；
（2）外植體處理：將外植體置于自來水下沖洗10-15 min，然后去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡時間15-20 min，最后用純凈水洗凈藥物，將外植體裁成帶至少1個腋芽，1.5-3cm長的莖段，視莖段木質化程度分類置放容器內，備用；
（3）初始芽誘導培養：將步驟（2）得到的外植體接種于初始芽誘導培養基中培養，培養30-35 d，初始芽萌發、生長；
（4）增殖培養：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養基中進行增殖培養，35-40 d轉接一次，循環往復，經3-4個周期的培養，形成叢生芽；
（5）壯芽培養：將步驟（4）得到的叢生芽進行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養基中，培養35-40 d，形成壯芽；
（6）生根培養：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養基中誘導生根；余下小芽叢再次接種于步驟（4）的增殖培養基中繼續增殖，然后再重復步驟（5），循環往復，獲得大量壯芽。
以上所述的初始芽誘導培養基的配方為：1/2改良MS培養基+6-BA 4.0-6.0 mg/L+NAA 2.0-3.0 mg/L+TDZ 1.0-2.0 mg/L+ZT 1.5-2.0 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB2 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+卡拉膠25 g/L。
以上所述的增殖培養基的配方為：改良1/2MS培養基+6-BA 6.0-8.0 mg/L+NAA 2.0-3.0 mg/L+ZT 0.5-1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+天冬氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+卡拉膠 30 g/L。
以上所述的壯芽培養基的配方為：改良MS培養基+6-BA 3.0-4.0 mg/L+NAA 1.0-1.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+天冬氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 25 g/L。
以上所述的生根培養基的配方為：1/2改良MS培養基+6-BA 1.5-2.5 mg/L+NAA 1.0-1.5 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 30 g/L。
以上所述的改良MS培養基的配方為：KNO3 660 mg·L-1；NH4NO3 850 mg·L-1；CaCl2·2H2O 275 mg·L-1；MgSO4·7H2O 280 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 600 mg·L-1；KH2PO4340 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；維生素B1 1.0 mg·L-1；維生素B6 0.5 mg·L-1；煙酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 105 mg·L-1。
以上步驟（3）所述的初始芽誘導培養的培育控制條件為：光培養、光照500-1000 lx，培養溫度20±1℃；步驟（4）所述的增殖培養、步驟（5）所述的壯芽培養、步驟（6）所述的生根培養的培育控制條件均為：光培養，光照2500-4000 lx，每日光照16 h，培養溫度25-28℃。
相對于現有技術，本發明具有的優點和有益效果如下：
1、本發明以油桐當年生嫩枝作為外植體，經過初始芽培養基培養，初始芽萌動率90%以上；經過3-4個周期增殖培養，形成叢生芽，芽增殖系數5/30d-7/30d，再將叢生芽接入壯芽培養基中培養，最后將高≥2cm的單芽插入生根培養基中誘導生根，從而縮短了油桐的育苗周期，節省育苗材料，克服了傳統育苗方法中存在的育苗所需材料多、周期長等問題，大大降低了生產成本，提高了生產效率。
2、本發明將高≥2cm的單芽插入生根培養基中誘導生根，余下小芽叢繼續增殖培養，使得材料能夠多次繼代，實現大量增殖，規模化生產壯芽，實現黃樟油素型樟樹的擴繁。
3、本發明對MS基本培養基進行了改良，同時重點調整了與油桐出芽壯芽相關元素，使得培養基更科學，更有針對性，更易促使油桐芽誘導的發生、增殖和壯芽，效果顯著。
4、本發明操作過程簡便，培養周期短，繼代芽產量大,并且質量優，增殖系數達到5以上的組培苗產業化技術要求，具有很好的經濟效益、生態效益和社會效益。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。
實施例1：
（1）外植體選擇：采集半木質化、生長健壯的當年生油桐嫩枝作為外植體；
（2）外植體處理：將外植體置于自來水下沖洗10 min，然后去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡時間15 min，最后用純凈水洗凈藥物，將外植體裁成帶至少1個腋芽，1.5-3cm長的莖段，視莖段木質化程度分類置放容器內，備用；
（3）初始芽誘導培養：將步驟（2）得到的外植體接種于初始芽誘導培養基中培養，置于光培養、光照500 lx，培養溫度20±1℃的環境中培養30-35 d，初始芽萌發、生長；所述的初始芽誘導培養基的配方為：1/2改良MS培養基+6-BA 4.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L+TDZ 1.0 mg/L+ZT 1.5 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB2 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+卡拉膠25 g/L；
（4）增殖培養：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養基中進行增殖培養，置于光培養，光照2500 lx，每日光照16 h，培養溫度25-28℃的環境中，35-40 d轉接一次，循環往復，經3-4個周期的培養，形成叢生芽；所述的增殖培養基的配方為：1/2改良MS培養基+6-BA 6.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L+ZT 0.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+天冬氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+卡拉膠 30 g/L；
（5）壯芽培養：將步驟（4）得到的叢生芽進行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養基中，置于光培養，光照2500 lx，每日光照16 h，培養溫度25-28℃的環境中培養35-40 d，形成壯芽；所述的壯芽培養基的配方為：改良MS培養基+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+天冬氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 25 g/L；
（6）生根培養：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養基中，余下小芽叢再次接種于步驟（4）的增殖培養基中繼續增殖，然后再重復步驟（5），循環往復，獲得大量壯芽；生根培養是置于光培養，光照2500 lx，每日光照16 h，培養溫度25-28℃的環境中誘導生根，生根率為89%；所述的生根培養基的配方為：1/2改良MS培養基+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 30 g/L。
以上所述的改良MS培養基的配方為：KNO3 660 mg·L-1；NH4NO3 850 mg·L-1；CaCl2·2H2O 275 mg·L-1；MgSO4·7H2O 280 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 600 mg·L-1；KH2PO4340 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；維生素B1 1.0 mg·L-1；維生素B6 0.5 mg·L-1；煙酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 105 mg·L-1。
實施例2：
（1）外植體選擇：采集半木質化、生長健壯的當年生油桐嫩枝作為外植體；
（2）外植體處理：將外植體置于自來水下沖洗15 min，然后去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡時間20 min，最后用純凈水洗凈藥物，將外植體裁成帶至少1個腋芽，1.5-3cm長的莖段，視莖段木質化程度分類置放容器內，備用；
（3）初始芽誘導培養：將步驟（2）得到的外植體接種于初始芽誘導培養基中培養，置于光培養、光照1000 lx，培養溫度20±1℃的環境中培養30-35 d，初始芽萌發、生長；所述的初始芽誘導培養基的配方為：1/2改良MS培養基+6-BA 5.0 mg/L+NAA 3.0 mg/L+TDZ 1.5 mg/L+ZT 1.5 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB2 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+卡拉膠25 g/L；
（4）增殖培養：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養基中進行增殖培養，置于光培養，光照3000 lx，每日光照16 h，培養溫度25-28℃的環境中，35-40 d轉接一次，循環往復，經3-4個周期的培養，形成叢生芽；所述的增殖培養基的配方為：1/2改良MS培養基+6-BA 7.0 mg/L+NAA 2.5 mg/L+ZT 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+天冬氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+卡拉膠 30 g/L；
（5）壯芽培養：將步驟（4）得到的叢生芽進行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養基中，置于光培養，光照3000 lx，每日光照16 h，培養溫度25-28℃的環境中培養35-40 d，形成壯芽；所述的壯芽培養基的配方為：改良MS培養基+6-BA 3.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+天冬氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 25 g/L；
（6）生根培養：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養基中，余下小芽叢再次接種于步驟（4）的增殖培養基中繼續增殖，然后再重復步驟（5），循環往復，獲得大量壯芽；生根培養是置于光培養，光照3000 lx，每日光照16 h，培養溫度25-28℃的環境中誘導生根，生根率為92%；所述的生根培養基的配方為：1/2改良MS培養基+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 30 g/L。
以上所述的改良MS培養基的配方為：KNO3 660 mg·L-1；NH4NO3 850 mg·L-1；CaCl2·2H2O 275 mg·L-1；MgSO4·7H2O 280 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 600 mg·L-1；KH2PO4340 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；維生素B1 1.0 mg·L-1；維生素B6 0.5 mg·L-1；煙酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 105 mg·L-1。
實施例3：
（1）外植體選擇：采集半木質化、生長健壯的當年生油桐嫩枝作為外植體；
（2）外植體處理：將外植體置于自來水下沖洗15 min，然后去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡時間20 min，最后用純凈水洗凈藥物，將外植體裁成帶至少1個腋芽，1.5-3cm長的莖段，視莖段木質化程度分類置放容器內，備用；
（3）初始芽誘導培養：將步驟（2）得到的外植體接種于初始芽誘導培養基中培養，置于光培養、光照1000 lx，培養溫度20±1℃的環境中培養30-35 d，初始芽萌發、生長；所述的初始芽誘導培養基的配方為：1/2改良MS培養基+6-BA 6.0 mg/L+NAA 2.5 mg/L+TDZ 2.0 mg/L+ZT 2.0 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB2 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+卡拉膠25 g/L；
（4）增殖培養：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養基中進行增殖培養，置于光培養，光照4000 lx，每日光照16 h，培養溫度25-28℃的環境中，35-40 d轉接一次，循環往復，經3-4個周期的培養，形成叢生芽；所述的增殖培養基的配方為：1/2改良MS培養基+6-BA 8.0 mg/L+NAA 3.0 mg/L+ZT 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+天冬氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+卡拉膠 30 g/L；
（5）壯芽培養：將步驟（4）得到的叢生芽進行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養基中，置于光培養，光照4000 lx，每日光照16 h，培養溫度25-28℃的環境中培養35-40 d，形成壯芽；所述的壯芽培養基的配方為：改良MS培養基+6-BA 4.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+天冬氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 25 g/L；
（6）生根培養：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養基中，余下小芽叢再次接種于步驟（4）的增殖培養基中繼續增殖，然后再重復步驟（5），循環往復，獲得大量壯芽；生根培養是置于光培養，光照4000 lx，每日光照16 h，培養溫度25-28℃的環境中誘導生根，生根率為93%；；所述的生根培養基的配方為：1/2改良MS培養基+6-BA 2.5 mg/L+NAA 1.5 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 30 g/L。
以上所述的改良MS培養基的配方為：KNO3 660 mg·L-1；NH4NO3 850 mg·L-1；CaCl2·2H2O 275 mg·L-1；MgSO4·7H2O 280 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 600 mg·L-1；KH2PO4340 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；維生素B1 1.0 mg·L-1；維生素B6 0.5 mg·L-1；煙酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 105 mg·L-1。