本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及粉雜1號粉蕉的組培快繁方法。

背景技術(shù)：

‘粉雜1號’粉蕉，是新選育的抗枯萎病的粉蕉品種，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所、中山市農(nóng)業(yè)局研究出品，為廣粉1號粉蕉的偶然實(shí)生苗。

目前來說，雖然香蕉組培快繁技術(shù)已普遍應(yīng)用，但粉雜1號粉蕉由于其基因型為四倍體香蕉ABBB類型，用常用的三倍體香蕉（AAA類型）組培快繁方法去培養(yǎng)粉雜1號，其繁殖速度慢、效率低，生根苗移植成活低，一般來說可獲得的增殖倍數(shù)僅為1.3倍，一個吸芽一年才繁殖幾百株苗，且小苗假植成活率有時不到20%。如何提高‘粉雜1號’增殖系數(shù)而又遺傳穩(wěn)定不變異，極具現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供粉雜1號粉蕉的組培快繁方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

粉雜1號粉蕉的組培快繁方法，包括下列步驟：

1)篩選母株：挑選假莖綠色、粗壯、高度為3.2～4.5m，果穗較大，果指連體果較少，果形正常，品質(zhì)好的植株為母株；

2)外植體吸芽的處理：對吸芽噴淋多菌靈和鏈霉素的混合藥液，1周后取吸芽為外植體進(jìn)行接種；

3)分化培養(yǎng)：分化培養(yǎng)溫度控制在27℃～33℃，分化培養(yǎng)12～20天進(jìn)行繼代，繼代總數(shù)控制在12～16代；

4)生根培養(yǎng)和煉苗；用生根培養(yǎng)基接種分化芽，第一周在室內(nèi)弱光或無光條件下，促根長苗；第二周利用溫室煉苗，溫度控制在26-30℃，自然光遮蔭照射，光照強(qiáng)度控制在4000-5000lux；兩周后，光照強(qiáng)度調(diào)至8000-10000lux，到出苗為止。

優(yōu)選的，步驟1）中，新植蕉母株高度為3.2～3.5m，宿根蕉母株高度為3.8～4.5m。如果超過或者低于這個高度，有可能出現(xiàn)與種性不符的劣變現(xiàn)象。

步驟1）中將母株的要求標(biāo)準(zhǔn)化，是為了挑選符合種性、品質(zhì)優(yōu)良的植株。如果挑選假莖黃色、瘦弱、果穗較小，果指連體果較多，果形不正常，品質(zhì)不好的植株為母株，有可能出現(xiàn)與種性不符的劣變現(xiàn)象。

優(yōu)選的，步驟2）中，當(dāng)吸芽長至30～50cm高時，對吸芽噴淋50%多菌靈1000倍液和150ppm濃度的鏈霉素的混合藥液，1周后取吸芽為外植體進(jìn)行接種。

具體使用時，1000公斤的混合藥液中含有50%多菌靈1公斤，農(nóng)用鏈霉素150克，每芽灌藥液0.5公斤。

多菌靈和鏈霉素的混合藥液主要是殺滅吸芽內(nèi)分生組織的內(nèi)生細(xì)菌。

發(fā)明人經(jīng)過篩選，最終優(yōu)選出上述兩種藥以及配比濃度，所獲混合藥液對細(xì)菌效果最好，而且價(jià)格相對低廉。

優(yōu)選的，步驟3）中，分化培養(yǎng)時所用的分化培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加適量細(xì)胞分裂素6-BA、TDZ和KT-30以及生長素IBA和NAA，控制增殖倍數(shù)為2.5～2.8倍。

具體的，分化培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加 3～5mg/L得6-BA、0.004～0.015mg/L的TDZ 、0.3～0.6mg/L的KT-30 ，以及適量IBA和NAA，在上述范圍內(nèi)調(diào)整激素的濃度，控制控制分化芽體的大小及高度，使得增殖率控制在2.5～2.8倍。

增殖倍數(shù)控制在2.5-2.8倍下獲得的分化芽最佳。如果增值倍數(shù)太低，則影響效率和成本；如果增殖倍數(shù)太高，芽太多，芽體小，分化芽葉鞘松散泡化，芽體質(zhì)量差，實(shí)際上也影響整個過程的苗的繁殖速度，也有可能發(fā)展成為畸形芽。

優(yōu)選的，步驟3）中，分化培養(yǎng)溫度控制在29℃～33℃。

香蕉的組培快繁中分化培養(yǎng)溫度一般為25～28℃，本發(fā)明優(yōu)選粉雜1號粉蕉組培快繁中分化培養(yǎng)溫度為29℃～33℃，高于以往香蕉的培養(yǎng)溫度。培養(yǎng)溫度低于29℃時分化芽容易向上生長，增殖率較低；培養(yǎng)溫度在33℃以上時，前期分化芽生長較快，后期分化芽葉鞘松散，芽體質(zhì)量差。在29℃～33℃下培養(yǎng)，分化芽嫩白粗壯，芽體較結(jié)實(shí)，高度和粗細(xì)適中。

優(yōu)選的，步驟3）中，分化培養(yǎng)15～18天進(jìn)行繼代，繼代總數(shù)控制在13～15代。

香蕉的組培快繁中一般分化培養(yǎng)20～30天進(jìn)行繼代，而本發(fā)明中分化培養(yǎng)天數(shù)控制在15～18天進(jìn)行繼代，不超期繼代轉(zhuǎn)接，以防止分化芽老化，造成大芽開葉和出根不再分化增殖；繼代數(shù)13～15代以內(nèi)。

優(yōu)選的，步驟3）中繼代轉(zhuǎn)接分化芽時，切斷截去分化芽部分上部鞘葉，縱切大芽小球莖與葉鞘交界處生長點(diǎn)分生組織而不分離小球莖，去除頂端生長優(yōu)勢，促使側(cè)芽分化叢生。

因?yàn)榉劢兜痛鷶?shù)分化芽粗大，向上生長勢強(qiáng)，容易形成單芽、開葉和出根不再分化。因此利用繼代轉(zhuǎn)接分化芽時，切斷截去分化芽的部分上部鞘葉，去除頂端生長優(yōu)勢。同時，縱切大芽小球莖與葉鞘交界處生長點(diǎn)分生組織而不分離小球莖，促使側(cè)芽分化叢生。

優(yōu)選的，步驟4）中生根培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加30g/L蔗糖、0.1～0.2mg/L的IBA和0.5～0.8mg/L的NAA。此配方有利于獲得多而小的根系，提高假植成活率。

蔗糖的含量在培養(yǎng)基中為定值，生根時濃度高會難生根，因?yàn)闈B透壓太大。

優(yōu)選的，步驟4）中，用生根培養(yǎng)基接種分化芽，第一周在室內(nèi)弱光或無光條件下，促根長苗，溫度控制在25℃-28℃；第二周利用溫室煉苗，溫度控制在26℃-30℃，自然光遮蔭照射，光照強(qiáng)度控制在4000-5000lux；2周后，光照強(qiáng)度調(diào)至8000-10000lux。即煉苗中后期光線比香蕉苗的要強(qiáng)。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明組培快繁方法是專門針對‘粉雜1號’粉蕉這個四倍體香蕉品種，區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)中常用的的三倍體香蕉的組培快繁方法。利用本發(fā)明的方法，可以解決‘粉雜1號’粉蕉繁殖速度慢、效率低，生根苗移植成活低而且遺傳不穩(wěn)定，容易變異等的問題。

采用本發(fā)明的技術(shù)繁殖的粉雜1號生根苗，根系較多，較粗壯且白色，分化增殖倍數(shù)為2.5-2.8倍，小苗假莖淺黃綠色，葉片深綠色，假植成活率可高達(dá)95%以上，生長較快且整齊，每個外植體一年時間內(nèi)可繁殖約5000-8000株小苗，定植后種性穩(wěn)定，很少出現(xiàn)變異株，蕉農(nóng)反映良好。

本發(fā)明將母株的選擇范圍標(biāo)準(zhǔn)化，目的是為了挑選符合種性、品質(zhì)優(yōu)良的植株。利用本發(fā)明標(biāo)準(zhǔn)的母株進(jìn)行組培快繁，才能保證優(yōu)良的種性。

本發(fā)明使用多菌靈和鏈霉素的混合藥液，可以殺滅吸芽內(nèi)分生組織的內(nèi)生細(xì)菌，效果好，同時價(jià)格相對低廉。

本發(fā)明的分化培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加適量細(xì)胞分裂素6-BA、TDZ和KT-30以及生長素IBA和NAA，控制增殖倍數(shù)為2.5～2.8倍。增殖倍數(shù)控制在2.5～2.8倍下獲得的分化芽最佳。如果增值倍數(shù)太低，則影響效率和成本；如果增殖倍數(shù)太高，芽太多，芽體小，分化芽葉鞘松散泡化，芽體質(zhì)量差，實(shí)際上也影響整個過程的苗的繁殖速度，也有可能發(fā)展成為畸形芽。

本發(fā)明優(yōu)選粉雜1號粉蕉組培快繁中分化培養(yǎng)溫度為29℃～33℃，高于普通的香蕉組培快繁分化培養(yǎng)的溫度。當(dāng)培養(yǎng)溫度低于29℃時分化芽容易向上生長，增殖率較低，培養(yǎng)溫度在33℃以上時，前期分化芽生長較快，后期分化芽葉鞘松散，芽體質(zhì)量差。在29℃～33℃下培養(yǎng)，分化芽嫩白粗壯，芽體較結(jié)實(shí)，高度和粗細(xì)適中。

本發(fā)明分化培養(yǎng)天數(shù)控制在15～18天進(jìn)行繼代，不超期繼代轉(zhuǎn)接，以防止分化芽老化，造成大芽開葉和出根不再分化增殖；繼代數(shù)13～15代以內(nèi)。

本發(fā)明還公開了繼代轉(zhuǎn)接分切技術(shù)，去除頂端生長優(yōu)勢，促使側(cè)芽分化叢生。

本發(fā)明的生根培養(yǎng)基適當(dāng)降低了IBA濃度，增加了NAA濃度，有利于根系多而小些，提高假植成活率。

本發(fā)明煉苗培養(yǎng)中后期光線比香蕉苗的要強(qiáng)，有利于促進(jìn)苗的假莖生長為黃綠色，葉片綠色，生命力強(qiáng)。

附圖說明

圖1為粉雜1號組培增殖培養(yǎng)；

圖2為粉雜1號大棚假植杯苗。

具體實(shí)施方式

中英文縮略詞：

6-BA為6-芐基腺呤，TDZ為N-芐苯基-N'-1,2,3-噻二唑-5-脲，KT-30為N-（2-氯-4-吡啶基）-N-苯基脲，IBA為吲哚丁酸，NAA為奈乙酸。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。

實(shí)施例1

實(shí)施地點(diǎn)：廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所母本園，時間：2012年10月-11月。

（1）母株的篩選：選擇假莖綠色、粗壯、高度為3.2～3.5m，果穗較大，果指連體果較少，果形正常，品質(zhì)好的新植蕉植株，種于大棚或隔離種植園中，作為母本園，供取芽之用。

（2）外植體吸芽的處理：當(dāng)吸芽長至30-50cm時，對吸芽噴淋50%多菌靈1000倍液和150ppm農(nóng)用鏈霉素的混合藥液。具體的，1000公斤的混合藥液中含有50%多菌靈1公斤，農(nóng)用鏈霉素150克，每芽灌混合藥液0.5公斤；1周后取吸芽為外植體進(jìn)行接種。

（3）分化培養(yǎng)：分化培養(yǎng)利用玻璃瓶或聚丙烯薄膜袋為包裝容器，溫度控制在29℃～33℃。

粉蕉組培增殖倍數(shù)與溫度有極大相關(guān)性。控制分化芽增殖培養(yǎng)溫度在31±2℃。培養(yǎng)溫度低于29℃時分化芽容易向上生長，增殖率較低，培養(yǎng)溫度在33℃以上時，前期分化芽生長較快，后期分化芽葉鞘松散，芽體質(zhì)量差。

分化培養(yǎng)15-18天進(jìn)行繼代。粉蕉低代數(shù)分化芽粗大，向上生長勢強(qiáng)，容易形成單芽、開葉和出根不再分化。繼代轉(zhuǎn)接分化芽時，切斷截去分化芽的部分上部鞘葉，縱切大芽小球莖與葉鞘交界處生長點(diǎn)分生組織而不分離小球莖，以去除頂端生長優(yōu)勢，促使側(cè)芽分化叢生。繼代總數(shù)控制在13～15代。

分化培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基，包括下列組分：在常規(guī)香牙蕉（AAA類型）培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加適量細(xì)胞分裂素6-BA、TDZ和KT-30以及生長素IBA和NAA，調(diào)整上述激素的濃度，控制分化芽體的大小及高度，使得增殖倍數(shù)控制在2.5-2.8倍，所獲分化芽生長結(jié)實(shí)質(zhì)優(yōu)。

（4）生根培養(yǎng)和煉苗：所用生根培養(yǎng)基在香蕉生根培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上適當(dāng)降低IBA濃度，增加NAA濃度，促進(jìn)生長的根系多而小，提高假植成活率。具體的，生根培養(yǎng)基包括下列組分：MS+蔗糖30g/L+IBA0.1mg/L+NAA0.6mg/L。生根培養(yǎng)用聚丙烯薄膜袋為包裝容器，每袋接種8株大小一致的較粗壯分化芽。

用生根培養(yǎng)基接種分化芽，第一周在室內(nèi)弱光或無光條件下，促根長苗；第二周利用溫室煉苗，溫度控制在26-30℃，自然光遮蔭照射，光照強(qiáng)度控制在4000-5000lux；兩周后，光照強(qiáng)度調(diào)至8000-10000lux，其他條件同第二周。四周后組培苗莖干充實(shí)葉片濃綠（見圖1），移植成活率較高，可達(dá)95%以上。

采用本技術(shù)，本單位每年快繁粉雜1號粉蕉40-80萬株苗，種植后深受蕉農(nóng)好評。

實(shí)施例2

實(shí)施地點(diǎn)：廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所母本園，時間：2013年10月開始。

（1）母株的篩選：選擇假莖綠色、粗壯、高度為3.4m的新植蕉和4.1m的宿根蕉，果穗較大，果指連體果較少，果形正常，品質(zhì)好的植株，作為母本樹，供取芽之用。

（2）外植體吸芽的處理：當(dāng)吸芽長至30-50cm時，對吸芽噴淋50%多菌靈1000倍液加150ppm農(nóng)用鏈霉素的混合藥液，每芽灌混合藥液0.5公斤；1周后取吸芽為外植體進(jìn)行接種。

（3）分化培養(yǎng)：分化培養(yǎng)利用聚丙烯薄膜袋為包裝容器，溫度控制在29℃～33℃。分化培養(yǎng)15天進(jìn)行繼代，繼代轉(zhuǎn)接分化芽時，切斷截去分化芽的部分上部鞘葉，縱切大芽小球莖與葉鞘交界處生長點(diǎn)分生組織而不分離小球莖，以去除頂端生長優(yōu)勢，促使側(cè)芽分化叢生。繼代總數(shù)控制在15代。

分化培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基，包括下列組分：在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加細(xì)胞分裂素3～5mg/L得6-BA、0.004～0.015mg/L的TDZ 、0.3～0.6mg/L的KT-30以及適量生長素IBA和NAA，調(diào)整上述激素的濃度（主要調(diào)整細(xì)胞分裂素的濃度），控制分化芽體的大小及高度，使得增殖率控制在2.6倍。

（4）生根培養(yǎng)：所用生根培養(yǎng)基包括下列組分：MS+蔗糖30g/L+IBA 0.1mg/L+NAA 0.5mg/L。生根培養(yǎng)用聚丙烯薄膜袋為包裝容器，每袋接種8株大小一致的較粗壯分化芽。

用生根培養(yǎng)基接種分化芽后在室內(nèi)弱光或無光條件下促根假莖拉高培養(yǎng)，溫度控制在25℃-28℃；第二周開始在溫室煉苗，自然光遮蔭照射，光照強(qiáng)度控制在4000-5000lux；2周后光照強(qiáng)度調(diào)至8000-10000lux，到出苗為止。4周后組培苗莖干充實(shí)葉片濃綠，移植成活率達(dá)96%以上。

所得到的粉雜1號生根苗，根系較多，較粗壯且白色，小苗假莖淺黃綠色，葉片深綠色，假植成杯苗（圖2）的成活率高，達(dá)到95%以上，生長較快且整齊，每個外植體（吸芽）一年可繼代培養(yǎng)13-15代，總共可繁殖約5000-8000株小苗，定植后種性穩(wěn)定，很少出現(xiàn)變異株，蕉農(nóng)反映良好。

實(shí)施例3

實(shí)施地點(diǎn)：廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所母本園，時間：2014年10月開始。

（1）母株的篩選：選擇假莖綠色、粗壯、高度為4.0m，果穗較大，果指連體果較少，果形正常的宿根蕉植株，作為母本樹，供取芽之用。

（2）外植體吸芽的處理：當(dāng)吸芽長至40cm時，對吸芽噴淋50%多菌靈1000倍液加150ppm農(nóng)用鏈霉素的混合藥液，每芽灌混合藥液0.5公斤；1周后取吸芽為外植體進(jìn)行接種。

（3）分化培養(yǎng)：分化培養(yǎng)利用玻璃瓶為包裝容器，溫度控制在29℃～33℃。分化培養(yǎng)17天進(jìn)行繼代，繼代轉(zhuǎn)接分化芽時，切斷截去分化芽的部分上部鞘葉，縱切大芽小球莖與葉鞘交界處生長點(diǎn)分生組織而不分離小球莖，以去除頂端生長優(yōu)勢，促使側(cè)芽分化叢生。繼代總數(shù)控制在13代。

分化培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加 3～5mg/L得6-BA、0.004～0.015mg/L的TDZ 、0.3～0.6mg/L的KT-30 ，以及適量IBA和NAA，在上述范圍內(nèi)調(diào)整激素的濃度，控制控制分化芽體的大小及高度，使得增殖率控制在2.8倍。

（4）生根培養(yǎng)和煉苗：所用生根培養(yǎng)基包括下列組分：MS+蔗糖30g/L+IBA0.2mg/L+NAA0.7mg/L。生根培養(yǎng)用聚丙烯薄膜袋為包裝容器，每袋接種8株大小一致的較粗壯分化芽。

在室內(nèi)弱光或無光促根長促苗，溫度控制在25℃-28℃；一周后利用溫室煉苗，溫度控制在26℃-30℃，自然光遮蔽下培養(yǎng)一周，光照強(qiáng)度控制在4000-5000lux；兩周后，光照強(qiáng)度調(diào)至8000-10000lux。4周后組培苗莖干充實(shí)葉片濃綠，移植成活率較高。

用這種技術(shù)繁殖的粉雜1號生根苗，根系較多，較粗壯且白色，小苗假莖淺黃綠色，葉片深綠色，假植成活率高，達(dá)到96%，生長較快且整齊，每個外植體一年時間內(nèi)可繁殖約6000～7000株小苗，共繁殖了近80萬株，定植后種性穩(wěn)定，產(chǎn)量高，果形好，變異株約1%，蕉農(nóng)反映良好。

對比例1

其他方法同實(shí)施例1，不同之處在于：

利用香牙蕉如巴西蕉的分化培養(yǎng)基MS+6-BA 3～4mg/L+IBA0.2mg/L替代本發(fā)明的分化培養(yǎng)基，進(jìn)行粉雜1號粉蕉的培養(yǎng)，結(jié)果是分化芽增殖率低，芽體向上直長，長時間培養(yǎng)粉雜1號粉蕉組培苗僅長根長葉而不分化。

對比例2

其他方法同實(shí)施例1，不同之處在于：

利用香蕉生根培養(yǎng)基配方MS+蔗糖20g/L+IBA1mg/L+NAA0.2mg/L替代本發(fā)明的生根培養(yǎng)基來進(jìn)行粉雜1號粉蕉的促根，結(jié)果是根少而粗，小苗假植成活率較低，有時僅達(dá)20%。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。