本發明屬于殺菌劑領域，具體涉及2‐氨基苯并咪唑殺菌微球及其合成方法和應用。

背景技術：

近年來，淡水資源污染嚴重，罐裝水和液體食品的安全問題頻發。飲用水中常用的指示菌或其它指示微生物有：總大腸菌群、糞大腸菌群、糞鏈球菌、大腸桿菌噬菌體、腸道病毒、葡萄球菌屬、雙歧桿菌屬、產氣莢膜梭菌、沙門氏菌屬、銅綠、假單胞菌、志賀氏菌屬、副溶血弧菌等。人類80％的疾病源于被污染的水，據世界衛生組織調查結果顯示：我國每年也有50萬人因飲用不健康水導致疾病死亡，引起的直接或間接損失已經超過該年gdp的1％。致病微生物的污染不但威脅生命安全，還造成食品的嚴重浪費。因此高效、安全的殺菌劑，對于改善淡水資源污染及維護人類健康意義重大。

傳統的殺菌劑主要有氧化型和非氧化型兩大類。氧化型殺菌劑是利用產生的次氯酸、原子態氧等，使微生物體內一些與代謝有密切關系的酶發生氧化作用而殺滅微生物；由于氧化型殺菌劑具有殺菌力強、價格低廉、來源廣泛等一系列優點，至今仍是應用最廣泛的一類殺菌劑，其中最常用的是氯氣、漂粉精和二氧化氯。而非氧化型殺菌劑是以致毒作用于微生物的特殊部位來達到殺菌效果的。非氧化型殺生劑種類較多，主要包括氯酚類，戊二醛，有機硫類，有機胺類，殼聚糖等。但傳統殺菌劑也有著不可克服的缺點：當水源中有機物含量稍高，氧化型殺菌劑如氯氣殺菌將產生氯代有機物，可致癌；穩定性欠佳，易分解，運輸貯藏成本高，并存在爆炸等潛在威脅；在工業水處理時，對菌垢、粘泥的剝離和洗滌作用差。由于水溶性殺菌劑使用后會殘留水和液體食品中產生一定的危害，氧化型殺菌劑會產生毒性副產物，非氧化型殺菌劑則是余毒問題，均存在“二次污染”的風險。

針對傳統殺菌劑存在上述種種弊端，近年來，人們著眼于新型殺菌劑的開發，將非氧化型殺菌劑或其有效基團引入大分子固體載體上，制成具有殺菌功能的水不溶性的殺菌劑。固定化殺菌劑具有殺菌時間短，持續時間久，基團不易從載體中脫落等優點，比小分子殺生劑有更好的殺菌性能。同時，它還較難進入動植物體內，可以有效避免“二次污染”。另一方面，固定化殺菌劑操作簡單，回收方便，能夠重復使用，增加污水處理量，降低成本，使用范圍廣泛，其應用前景十分廣闊。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種2‐氨基苯并咪唑殺菌微球的合成方法及其應用。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

本發明的2‐氨基苯并咪唑殺菌微球的合成方法，包括以下步驟：(1)以氯球為母體，將氯球置于溶劑甲苯中浸泡使其充分溶脹，加入2‐氨基苯并咪唑作為配體，加入催化劑金屬鈉，在氮氣保護下70℃～90℃以200rpm的轉速攪拌反應10-12小時，洗滌后50℃下真空干燥備用；(2)將按步驟(1)所得物置于反應容器中，在氮氣氣氛下加入環氧丙烷，15～25℃下攪拌反應5～7h后，向反應容器內加入芐氯，常溫下攪拌反應5～7h后濾出，并用無水乙醇和蒸餾水反復洗滌數次至表面無環氧丙烷殘留，過濾后將微球置于50℃下真空干燥，即得到不溶的固定化殺菌微球。

其反應路線如下：

步驟(1)中母體與配體的摩爾比為1:3～5，優選為1:4，催化劑金屬鈉的加入量為母體加入量的3～7％，優選為5％。

步驟(1)中的洗滌具體為先用反應溶劑浸泡洗滌直至洗滌液無色或微球表面無明顯附著物，用蒸餾水洗滌后，再用naoh水溶液浸泡，水洗，再依次用無水乙醇、丙酮、乙醚反復洗滌3～5次。

以步驟(1)中每100mg母體為基準，步驟(2)中環氧丙烷的加入量為50m，芐氯的加入量為125ml。

本發明的2‐氨基苯并咪唑殺菌微球的在飲用水殺菌中的應用。能有效地殺滅飲用水中的微生物，避免水溶性殺菌劑帶來的“二次污染”和水體殘留問題。

本發明中所用的氯球是交聯度為8％dvb，含氮量19.15％，比表面43m²·g^‐1的大孔型交聯氯甲基化聚苯乙烯珠體，購于南開大學化工廠，是一種極易改性修飾的高分子樹脂。

本發明的有益效果：

1.本發明所用的原材料是一種極易改性修飾的樹脂氯球，它有較高的機械強度和物理穩定性，具有耐溶脹，耐氧化，耐磨損，耐溫度變化，不易碎裂，再生方便等優點，來源廣泛，價格低廉，同時由于其有較高的化學反應活性基團氯甲基(–ch2cl)，能固定更多不同類型的殺菌功能基，性能穩定，固載量大，殺菌效果也能夠更高。本發明創造性地選用多元含氮雜環作為氯球固載的功能基因子，屬雜環季銨鹽。與目前常見的長鏈季銨鹽殺菌劑相比，不僅具有功能基不易從母體上脫落，不會造成殺菌劑失效和“二次污染”的優點，而且還可以有效地克服直鏈季銨鹽長期使用后會產生抗性影響其性能的缺點，具有明顯的經濟效益。

2.本發明提供的新型固定化殺菌劑的反應路線簡單，合成方法操作方便，只需要母體接枝功能基試劑和接枝后季銨化兩步反應即可完成，條件容易達到，兩步反應只需要在70℃～90℃和室溫下在三頸瓶中進行即可，無需大型儀器設備，所以容易實現批量生產及自動化控制，具有良好的應用前景。

3.本發明提供的新型殺菌微球主要有以下三點性能優勢：1)作用時間短，殺菌效率高，在3小時之內可達到100％殺菌，且在殺菌過程中具有持續時間久，基團不易從載體中脫落，投放量少等優點，比小分子殺菌劑有更好的殺菌性能；2)殺菌微球較難進入動植物體內，可以有效避免由殺菌劑本身造成的“二次污染”；3)本發明提供的殺菌微球是水不溶性的，可有效克服可溶性殺菌劑殘留水體的問題，且微球可回收，可重復使用，能夠提高資源的利用率。

附圖說明

圖1是微球合成裝置搭建示意圖；

圖2為氯球、abm、abmr的紅外光譜圖；

圖3為加入濃度為mbc的abmr后對大腸桿菌殺菌的平板結果；

圖4為加入濃度為mbc的abmr后對金黃色葡萄球菌殺菌的平板結果；

圖5為不同轉化率的abmr對大腸桿菌的殺菌率的對比圖；

圖6為不同轉換率的abmr對金黃色葡萄球菌的殺菌率的對比圖；

圖7為濃度為mbc的abmr重復使用對大腸桿菌的殺菌率的對比圖；

圖8為濃度為mbc的abmr重復使用對金黃色葡萄球菌的殺菌率的對比圖；

圖9為濃度為mbc的abmr對礦泉水和生理鹽水中e.coli的殺菌率變化曲線對比圖；

圖10為濃度為mbc的abmr對礦泉水和生理鹽水中s.aureus的殺菌率變化曲線對比圖。

圖1中，1-三頸瓶，2-冷凝管，3-攪拌棒，4-溫度計，5-氮氣管道。

具體實施方式

實施例1

量取40ml反應溶劑至容積為100ml的三頸燒瓶中，并加入60.0mg母體(氯球)浸泡過夜。母體充分溶脹后，向三頸燒瓶內加入摩爾比為1:3～5的2‐氨基苯并咪唑和占母體加入量的3～7％的催化劑金屬鈉。在70℃～90℃下攪拌反應，并且反應全程通氮氣保護。反應10‐12h后，將三頸燒瓶內微球濾出，然后用反應溶劑浸泡洗滌直至洗滌液無色或微球表面無明顯附著物，用蒸餾水洗滌后，再用naoh水溶液浸泡，水洗，再依次用無水乙醇、丙酮、乙醚反復洗滌數次后，過濾微球置于50℃下真空干燥備用。

合成微球的季銨化：將按上述過程的所得物放入250ml的三頸燒瓶內，用氮氣將瓶內空氣排盡后加入30ml的環氧丙烷，15～25℃下攪拌反應5～7h后，向瓶內加入75ml的芐氯，常溫下攪拌反應6h后濾出，并用無水乙醇和蒸餾水反復洗滌數次至表面無環氧丙烷殘留，過濾后將微球置于50℃下真空干燥，即得到不溶的固定化殺菌微球(以下簡稱abmr)。

本發明用傅里葉紅外光譜對合成的新化合物abmr進行結構表征：如圖2所示，在abmr中，原來氯球中的676cm^‐1峰明顯減弱,配體中伯胺的雙吸收峰消失，同時3000‐3400cm^‐1出現一個寬的吸收帶，為季銨化后‐oh吸收峰與‐nh彎曲振動峰共同作用的結果，1463‐1685cm^‐1的譜帶表明了雜芳環的存在，其中1685cm^‐1處為環狀共軛化合物中的c＝n共軛的伸縮振動峰，1332cm^‐1為c‐n的伸縮振動峰，表明功能基試劑成功接枝載體，并且是通過功能基試劑的‐nh2與載體‐ch2cl反應實現的。結合元素分析結果，abmr中含氮量計算c‐cl鍵的轉化率71.8％，氯球上的氯甲基未全部參與反應，因而根據abmr中674cm^‐1處的弱峰可推測，微球季銨化時，主要由加入的芐氯試劑參與反應，而非氯球上的氯甲基。

通過以上分析可推斷本發明所制備的2‐氨基苯并咪唑殺菌微球的結構式如下：

實施例2

本實施例的2‐氨基苯并咪唑殺菌微球的合成方法，包括以下步驟：

(1)以氯球為母體，將氯球置于溶劑甲苯中浸泡使其充分溶脹，加入2‐氨基苯并咪唑作為配體，母體與配體的摩爾比為1:4，加入催化劑金屬鈉，加入量為母體加入量的5％；在氮氣保護下80℃以200rpm的轉速攪拌反應11小時，先用反應溶劑甲苯浸泡洗滌直至洗滌液無色或微球表面無明顯附著物，用蒸餾水洗滌后，再用naoh水溶液浸泡，水洗，再依次用無水乙醇、丙酮、乙醚反復洗滌3～5次。洗滌后50℃下真空干燥備用；

(2)將按步驟(1)所得物置于反應容器中，在氮氣氣氛下加入環氧丙烷，20℃下攪拌反應6h后，向反應容器內加入芐氯，以每100mg母體為基準，步驟(2)中環氧丙烷的加入量為50m，芐氯的加入量為125ml。常溫下攪拌反應6h后濾出，并用無水乙醇和蒸餾水反復洗滌數次至表面無環氧丙烷殘留，過濾后將微球置于50℃下真空干燥，即得到不溶的固定化殺菌微球。由元素分析法及以下公式可得出：樹脂功能基轉換率為73.8％。

即

式中

fn‐單位功能及含量(mmol·g^‐1)；

m‐氮原子或硫原子的摩爾質量(14或32g·mol^‐1)；

n％‐螯合樹脂中含氮量百分數；

n‐螯合樹脂氮原子數；

x‐配體的轉化率(％)；

△m‐合成反應樹脂的增量(g·mol^‐1)；

f0‐(5.394mmol·g^‐1)為氯球的含氯量。

實施例3

本實施例的2‐氨基苯并咪唑殺菌微球的合成方法，包括以下步驟：

(1)以氯球為母體，將氯球置于溶劑中浸泡使其充分溶脹，加入2‐氨基苯并咪唑作為配體，母體與配體的摩爾比為1:3，加入催化劑金屬鈉，加入量為母體加入量的3％；在氮氣保護下70℃以200rpm的轉速攪拌反應12小時，先用反應溶劑浸泡洗滌直至洗滌液無色或微球表面無明顯附著物，用蒸餾水洗滌后，再用naoh水溶液浸泡，水洗，再依次用無水乙醇、丙酮、乙醚反復洗滌3～5次。洗滌后50℃下真空干燥備用；

(2)將按步驟(1)所得物置于反應容器中，在氮氣氣氛下加入環氧丙烷，15℃下攪拌反應7h后，向反應容器內加入芐氯，以每100mg母體為基準，步驟(2)中環氧丙烷的加入量為50m，芐氯的加入量為125ml。常溫下攪拌反應5～7h后濾出，并用無水乙醇和蒸餾水反復洗滌數次至表面無環氧丙烷殘留，過濾后將微球置于50℃下真空干燥，即得到不溶的固定化殺菌微球。樹脂功能基轉換率為73.8％。

實施例4

本實施例的2‐氨基苯并咪唑殺菌微球的合成方法，包括以下步驟：

(1)以氯球為母體，將氯球置于溶劑中浸泡使其充分溶脹，加入2‐氨基苯并咪唑作為配體，母體與配體的摩爾比為1:5，加入催化劑金屬鈉，加入量為母體加入量的7％；在氮氣保護下90℃以200rpm的轉速攪拌反應10小時，先用反應溶劑浸泡洗滌直至洗滌液無色或微球表面無明顯附著物，用蒸餾水洗滌后，再用naoh水溶液浸泡，水洗，再依次用無水乙醇、丙酮、乙醚反復洗滌3～5次。洗滌后50℃下真空干燥備用；

(2)將按步驟(1)所得物置于反應容器中，在氮氣氣氛下加入環氧丙烷，25℃下攪拌反應5h后，向反應容器內加入芐氯，以每100mg母體為基準，步驟(2)中環氧丙烷的加入量為50m，芐氯的加入量為125ml。常溫下攪拌反應5～7h后濾出，并用無水乙醇和蒸餾水反復洗滌數次至表面無環氧丙烷殘留，過濾后將微球置于50℃下真空干燥，即得到不溶的固定化殺菌微球。樹脂功能基轉換率為73.4％。

實驗1:

(1)殺菌實驗

本實驗以革蘭氏陰性代表細菌大腸桿菌(e.coli)cicc21524和革蘭氏陽性代表細菌金黃色葡萄球菌(s.aureus)cicc10384作為受試菌，這兩種菌種均購于中國工業微生物菌種保藏管理中心。具體實驗操作步驟及評價方法如下：

所有菌株均作為儲備培養物輔以15％(v/v)甘油的營養肉體培養基中，保持于‐20℃儲存。菌株置于在lb培養基內，37℃恒溫振蕩器中培養18小時；活化后用移液槍取出一定量菌液，在4000rmp下離心洗滌。將所得菌斑用0.85％的生理鹽水通過十倍稀釋法稀釋成濃度約為10⁶cfu/ml的菌懸液備用。

(2)殺菌活性測試

取若干無菌的100ml搖瓶，加入50ml上述制備的菌懸液；在樣品組中加入一定量充分溶脹的殺菌微球abmr，對照組不加入殺菌微球；振蕩各混合液，接觸不同時間后，根據gb/t4789.3‐2010提供的方法，將不同接觸時間上清液分別逐級稀釋，稀釋至適宜濃度后用玻璃涂布棒涂勻，倒置平板于37℃下培養進行平板活菌計數。通過以下公式計算微球殺菌率：

為提高殺菌率的準確性，殺菌率由同一時間點對照組和樣品組取樣進行平板計數后結果根據公式計算得到。

圖3為加入濃度為mbc的abmr后對大腸桿菌殺菌的平板結果，圖4為加入濃度為mbc的abmr后對金黃色葡萄球菌殺菌的平板結果。

表1所示為殺菌微球abmr對e.coli,s.aureus的最低殺菌濃度(mbc)，其中，殺菌時間為3小時。

表1殺菌微球abmr對e.coli,s.aureus的最低殺菌濃度(mbc)

此外，圖5所示為不同轉化率的abmr對大腸桿菌的殺菌率的對比圖；圖6所示為不同轉換率的abmr對金黃色葡萄球菌的殺菌率的對比圖。由圖5可知，abmr的轉化率越高，大腸桿菌的殺菌率越高；由圖6可知，abmr的轉化率越高，金黃色葡萄球菌的殺菌率越高。

實驗2：殺菌微球的重復使用

將殺菌后的微球過濾晾干，置于搖瓶中，加入hcl與etoh以1:8(v/v)的混合溶液30ml，振蕩2.5h后，用蒸餾水和生理鹽水沖洗3～5遍后重新用于殺菌，殺菌時間與再生前相同，都為3h。

圖7所示為濃度為mbc的abmr重復使用對大腸桿菌的殺菌率的對比圖；圖8所示為濃度為mbc的abmr重復使用對金黃色葡萄球菌的殺菌率的對比圖。由圖7及圖8可知，本發明較佳實施例提供的殺菌微球的重復使用后對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的殺菌率影響不大。換言之，本發明較佳實施例提供的殺菌微球的重復使用效果好。

實驗3：abmr殺菌微球在礦泉水中的實際應用

菌株活化后用移液槍取出一定量菌液，在4000rpm下離心洗滌。將所得菌斑用礦泉水調節濃度為106cfu·ml-1的菌懸液備用。

取若干無菌的100ml搖瓶，加入50.0ml上述制備的菌懸液；在樣品組中加入上述殺菌實驗的最低殺菌濃度的殺菌微球，空白組不加入微球。振蕩各組溶液，接觸不同時間后，將不同接觸時間上清液分別逐級稀釋，進行平板活菌計數。通過上述公式計算微球殺菌率，其中計算殺菌率所用的均為同一時間點樣品組和對照組進行平板計數的結果。

利用平板計數法測試所購的礦泉水的本身的含菌情況，未有明顯菌落檢出。圖9為在礦泉水中加入濃度為mbc的abmr殺菌微球作用于大腸桿菌的殺菌率曲線與該殺菌微球在生理鹽水中作用于大腸桿菌的殺菌率曲線的對比圖。從圖中可看出殺菌微球在礦泉水中殺滅大腸桿菌的時間均比在生理鹽水中有所延長，但與受試菌作用一定時間后還是能夠達將活菌全部殺死。

圖10為在礦泉水中加入濃度為mbc的abmr殺菌微球作用于金黃色葡萄球菌的殺菌率曲線與該殺菌微球在生理鹽水中作用于金黃色葡萄球菌的殺菌率曲線的對比圖。微球在礦泉水中殺滅金黃色葡萄球菌的時間與殺滅大腸桿菌一樣，均比在生理鹽水中有所延長，但abmr與受試菌充分接觸后，受試菌的數量下降程度也達到90％以上。

礦泉水是從地下深處自然涌出的或經人工揭露的、未受污染的地下礦水，含有一定量的礦物鹽、微量元素或二氧化碳氣體。abmr殺菌微球對礦泉水中的部分礦物質存在一定的吸附作用。吸附礦物質后的殺菌微球殺菌性能受到影響，表現為殺菌時間的延長和殺菌效果的下降。

上述實施例不以任何方式限制本發明，凡是采用等同替換或等效變換的方式獲得的技術方案均落在本發明的保護范圍內。