本發(fā)明屬于甘草組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種篩選促進甘草愈傷組織增殖培養(yǎng)條件的方法。
背景技術(shù)：
甘草，（學(xué)名：Glycyrrhiza uralensis Fisch）別名：國老、甜草、烏拉爾甘草、甜根子。豆科、甘草屬多年生草本，根與根狀莖粗壯，是一種補益中草藥。對人體很好的一種藥，藥用部位是根及根莖，藥材性狀根呈圓柱形，長25～100厘米，直徑0.6～3.5厘米。外皮松緊不一，表面紅棕色或灰棕色。根莖呈圓柱形，表面有芽痕，斷面中部有髓。氣微，味甜而特殊。功能主治清熱解毒、祛痰止咳、脘腹等。喜陰暗潮濕，日照長氣溫低的干燥氣候。甘草多生長在干旱、半干旱的荒漠草原、沙漠邊緣和黃土丘陵地帶。根和根狀莖供藥用。傳統(tǒng)的甘草獲取方法是采挖葉生植物資源，造成水土流失和嚴重土壤沙漠化。另外，甘草種子主要來自野生甘草，其品種混雜，種子稀缺，發(fā)芽率極低，野生資源不適應(yīng)規(guī)?；蜆?biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的需要。同時由于人們破壞性地對葉生甘草采挖，使野生植物幾乎滅絕，對甘草的保護性利用迫在眉睫，但由于甘草種植發(fā)芽率不高和人們對其此生代謝物的需求，從而使甘草的組織培養(yǎng)對研究和生產(chǎn)具有重要作用，然而現(xiàn)有的甘草培養(yǎng)基中極少有通過增強光源調(diào)節(jié)甘草生長的技術(shù)。
綠色植物是一部以光為動力的機器，許多生理生化過程受光的調(diào)節(jié)控制，形態(tài)構(gòu)建受光作用的誘導(dǎo)。不同光質(zhì)對植物的光形態(tài)建成、生理生化過程的調(diào)節(jié)已有報道。在日光燈光照條件下，輔助不同光質(zhì)的光照，對甘草組培誘導(dǎo)生長進行調(diào)整，提高甘草組織培養(yǎng)的生產(chǎn)效率。
鈰是周期系第ΙΙΙ族副族鑭系元素，一種稀土元素。原子序數(shù)58。穩(wěn)定同位素：136、138、140、142?；疑饘?，有展性。密度：正方晶體6.9，立方晶體6.7。熔點799℃，沸點3426℃。鈰是一種銀灰色的活潑金屬，粉末在空氣中易自燃，易溶于酸。鈰的名稱來源于小行星谷神星的英文名。鈰在地殼中的含量約0.0046%，是稀土元素中豐度最高的。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
基于現(xiàn)有技術(shù)存在上述問題，本發(fā)明提供一種篩選促進甘草愈傷組織增殖培養(yǎng)條件的方法，通過使用單一變量法調(diào)整測試增強光源的波長對甘草組織培養(yǎng)苗的生理影響，確定最適增強光源波長，并根據(jù)不同波長光源對甘草組培苗的影響，確定不同波長光源出組合，并通過保持增強光源不變反向確定基礎(chǔ)培養(yǎng)基，同時引入組培苗的實際增殖系數(shù)作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，更加適合商業(yè)工廠化生產(chǎn)。
一種篩選促進甘草愈傷組織增殖培養(yǎng)條件的方法，其包括以下步驟：
步驟S10確定初步篩選范圍，檢索查閱相關(guān)文獻資料，對比其他植物物種組培增殖過程中添加增強光源的種類并確定光源波長，初步篩選范圍；
步驟S20選擇外植體，選擇健康、生長環(huán)境一致并且生長狀態(tài)相似的甘草愈傷組織，將愈傷組織切割成0.5cm3大小的組織塊；
步驟S30對照培養(yǎng)，以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加TDZ（噻苯隆）的濃度為0.06mg/L、NAA（萘乙酸）的濃度為2.5 mg/L、活性炭的濃度為0.15 mg/L、硝酸鈰的濃度為3g/L，維生素C的濃度為0.3mg/L，瓊脂粉的濃度為10g/L、白砂糖的濃度為7g/L，配制成測試用培養(yǎng)基，分別接種相同量的甘草愈傷組織，并進行常規(guī)增殖組織培養(yǎng)作為對照組，在常規(guī)培養(yǎng)的基礎(chǔ)上添加不同波段增強增強光源作為實驗組，對照組和實驗組都設(shè)置多個平行組；
步驟S40記錄檢測參數(shù)，培養(yǎng)20天后統(tǒng)計每個對照組和實驗組的褐化的數(shù)量，并計算褐化率；
步驟S50生長量計算，分別將相同實驗組或者對照組的愈傷組織取出，用清水沖洗干凈，擦干表面水分并對愈傷組織進行稱重，記錄重量；
步驟S60計算評估因數(shù)，將愈傷組織培養(yǎng)后的重量減去褐化的重量，再除以培養(yǎng)前的重量，計算出實際增殖系數(shù)，將實際增殖系數(shù)減去褐化率得出評估因數(shù)，對比不同濃度梯度的評估因數(shù)，挑選出數(shù)值最大的評估因數(shù)對應(yīng)的增強光源波長；
步驟S70縮小篩選范圍，使用步驟S60中挑選出的增強光源波長范圍重復(fù)進行步驟S10-S60縮小篩選范圍或者確定最適波長范圍；
步驟S80反向篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基，使用步驟S70確定的最適波長范圍搭配不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基，重復(fù)步驟S40和步驟S50，并使用步驟S60的計算方法計算評估因數(shù)，確定最適基礎(chǔ)培養(yǎng)基；
步驟S90不同波長組合篩選，通過單一因數(shù)確定不同波長對甘草愈傷組織增殖的生理參數(shù)影響，調(diào)整最適合波長組合。
優(yōu)選地，所述的步驟S30中每個實驗組或者對照組設(shè)置5-15個平行組。
優(yōu)選地，所述的步驟S70中重復(fù)的次數(shù)是2-3次。
優(yōu)選地，所述的步驟S80中不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括MS培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、Nitsh培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基和Miller培養(yǎng)基。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的描述。
一種篩選促進甘草愈傷組織增殖培養(yǎng)條件的方法，其包括以下步驟：
步驟S10確定初步篩選范圍，檢索查閱相關(guān)文獻資料，對比其他植物物種組培增殖過程中添加增強光源的種類并確定光源波長，初步篩選范圍；
步驟S20選擇外植體，選擇健康、生長環(huán)境一致并且生長狀態(tài)相似的甘草愈傷組織，將愈傷組織切割成0.5cm3大小的組織塊；
步驟S30對照培養(yǎng)，以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加TDZ（噻苯?。┑臐舛葹?.06mg/L、NAA（萘乙酸）的濃度為2.5 mg/L、活性炭的濃度為0.15 mg/L、硝酸鈰的濃度為3g/L，維生素C的濃度為0.3mg/L，瓊脂粉的濃度為10g/L、白砂糖的濃度為7g/L，配制成測試用培養(yǎng)基，分別接種相同量的甘草愈傷組織，并進行常規(guī)增殖組織培養(yǎng)作為對照組，在常規(guī)培養(yǎng)的基礎(chǔ)上添加不同波段增強增強光源作為實驗組，對照組和實驗組都設(shè)置多個平行組；
步驟S40記錄檢測參數(shù)，培養(yǎng)20天后統(tǒng)計每個對照組和實驗組的褐化的數(shù)量，并計算褐化率；
步驟S50生長量計算，分別將相同實驗組或者對照組的愈傷組織取出，用清水沖洗干凈，擦干表面水分并對愈傷組織進行稱重，記錄重量；
步驟S60計算評估因數(shù)，將愈傷組織培養(yǎng)后的重量減去褐化的重量，再除以培養(yǎng)前的重量，計算出實際增殖系數(shù)，將實際增殖系數(shù)減去褐化率得出評估因數(shù)，對比不同濃度梯度的評估因數(shù)，挑選出數(shù)值最大的評估因數(shù)對應(yīng)的增強光源波長；
步驟S70縮小篩選范圍，使用步驟S60中挑選出的增強光源波長范圍重復(fù)進行步驟S10-S60縮小篩選范圍或者確定最適波長范圍；
步驟S80反向篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基，使用步驟S70確定的最適波長范圍搭配不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基，重復(fù)步驟S40和步驟S50，并使用步驟S60的計算方法計算評估因數(shù)，確定最適基礎(chǔ)培養(yǎng)基；
步驟S90不同波長組合篩選，通過單一因數(shù)確定不同波長對甘草愈傷組織增殖的生理參數(shù)影響，調(diào)整最適合波長組合。
作為優(yōu)選實施例，所述的步驟S30中每個實驗組或者對照組設(shè)置10個平行組。
作為優(yōu)選實施例，所述的步驟S70中重復(fù)的次數(shù)是3次。
作為優(yōu)選實施例，所述的步驟S80中不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括MS培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、Nitsh培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基和Miller培養(yǎng)基。
經(jīng)過篩選確定如下增強光源具有比更高的實際增殖系數(shù)：使用白光、藍光增強光源和綠光增強光源照射愈傷組織，綠色光源是波段為550nm-580nm的綠光，藍色光源是波段為450nm-470nm的藍光，光照時間為光照12小時/黑暗12小時。