本發明屬于農林育種方法技術領域，尤其涉及一種歐洲山楊品系組培育苗方法。
背景技術：
歐洲山楊原產中國新疆的阿爾泰、塔城、天山東部北坡至西部伊犁山區，其抗寒、喜光、喜涼爽氣候，在我國西北、東北的同緯度地區可廣泛栽培與推廣。歐洲山楊為楊屬白楊派樹種，在自然界中，它主要依靠種子和根蘗繁殖，種子繁殖子代性狀會發生分離，不能確保優良單株性狀的表現，因此生產上使用比較廣泛是無性繁殖方法。無性繁殖方法包括扦插、嫁接、根蘗或組織培養等，歐洲山楊扦插生根困難，此種方法生產上難以利用，而利用嫁接或根蘗的繁殖方式，希望在1～2年內達到幾萬甚至幾百萬株苗木的生產能力，則初始繁殖材料至少達到上千株至幾萬株。。
而且利用“三倍體歐洲無絮山楊快速繁殖體系”中的方法進行滅菌與組織培養，在利用參考文獻“三倍體歐洲無絮山楊快速繁殖體系”中的培養方法進行繁殖的過程中，主要問題如下：滅菌方法不可行，在75％酒精中約30～60秒，在0.1％的升汞中滅菌5～10分，無菌水沖洗3～5遍，褐化率達到85％～100％，褐化會導致培育苗難以成活，而褐化率越高表明培育苗的成活率就越低；利用不定芽誘導培養基MS+6-BA0.5mg/L+0.05NAAmg/L進行腋芽誘導，不定芽誘導率僅為14.2％～25.8％；對于增殖培養基MS+6-BA0.5mg/L+0.05NAAmg/L，植株增殖率為2～3倍，且生長植株平均為1.0～1.5cm，最終導致培育苗的成活率低。
技術實現要素：
有鑒于此，本發明的目的在于針對現有技術的不足，而提供一種歐洲山楊品系組培育苗方法，能夠提高育苗的成活率。
為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：
一種歐洲山楊品系組培育苗方法，包括以下步驟：
1)將帶有腋芽的莖段依次經過酒精溶液浸泡、無菌水沖洗、消毒劑消毒和無菌水再次沖洗后，去掉莖段的兩端1～2mm，得到外植體；
2)將所述步驟1)得到的外植體接種到已滅菌的不定芽分化培養基中，分化培養30～45d，得到歐洲山楊不定芽；
3)將所述步驟2)得到的歐洲山楊不定芽接種到已滅菌的繼代增殖培養基中進行繼代培養，得到1.2～2.0cm高的歐洲山楊不定芽；
4)將所述步驟3)得到的1.2～2.0cm的歐洲山楊不定芽轉接到已滅菌的不定芽生根培養基中進行生根培養，得到歐洲山楊再生組培苗。
優選的，所述步驟1)中莖段的長度為0.5～2cm。
優選的，所述步驟1)中酒精溶液中乙醇的體積濃度為70～75％，所述酒精溶液浸泡的時間為10～20s；
所述消毒劑為氯化汞溶液，所述氯化汞溶液中氯化汞的質量濃度為0.05～0.15％，所述消毒劑消毒的時間為1.5～4.5min。
優選的，所述步驟2)中的不定芽分化培養基包括以下濃度的組分：
NH4NO3150～250mg/L、KNO3150～200mg/L、CaCl240～55mg/L、MgSO4170～200mg/L、Ca(NO3)2260～290mg/L、K2SO4140～160mg/L、KH2PO4170～200mg/L、KI 0.41～0.42mg/L、H3BO32.5～3.5mg/L、MnSO411～12mg/L、ZnSO44.0～4.5mg/L、Na2MoO40.12～0.13mg/L、CuSO40.012～0.013mg/L、FeSO413.0～14.5mg/L、Na2-EDTA 18～19mg/L、肌醇40～60mg/L、鹽酸吡哆醇0.2～0.3mg/L、煙酸0.2～0.3mg/L、鹽酸硫胺素2～3mg/L、甘氨酸0.5～1.5mg/L、6-芐基腺嘌呤0.3～1.0mg/L，余量為水。
優選的，所述分化培養的條件包括：
所述培養的溫度為20～30℃；
所述培養的光照時間為10～15h/d；
所述培養的光照強度為3500～5000Lx；
所述培養的光源為三基色色溫6500k熒光燈；
所述培養的環境濕度為70～80％。
優選的，所述步驟3)中的繼代增殖培養基包括以下濃度的組分：
KNO3300～400mg/L、NH4NO3350～450mg/L、CaCl290～100mg/L、MgSO4330～400mg/L、Ca(NO3)2500～600mg/L、K2SO4550～650mg/L、KH2PO4350～400mg/L、FeSO425～30mg/L、Na2-EDTA35～40mg/L、KI 0.05～1.0mg/L、H3BO36.0～6.5mg/L、MnSO420～25mg/L、ZnSO48.0～9.0mg/L、Na2MoO40.2～0.3mg/L、CuSO40.2～0.3mg/L、鹽酸硫胺素3～8mg/L、煙酸0.3～0.8mg/L、鹽酸吡哆醇0.3～0.8mg/L、肌醇90～110mg/L、甘氨酸1～3mg/L、6-芐基腺嘌呤0.5～1.5mg/L、萘乙酸0.03～0.08mg/L，余量為水。
優選的，所述繼代培養的條件包括：
所述培養的溫度為20～30℃；
所述培養的光照時間為10～15h/d；
所述培養的光照強度為3500～5000Lx；
所述培養的光源為三基色色溫6500k熒光燈；
所述培養的環境濕度為70～80％。
優選的，所述步驟4)中的不定芽生根培養基包括以下濃度的組分：
KNO3300～400mg/L、NH4NO3350～450mg/L、CaCl290～100mg/L、MgSO4330～400mg/L、Ca(NO3)2500～600mg/L、K2SO4550～650mg/L、KH2PO4350～400mg/L、FeSO425～30mg/L、Na2-EDTA35～40mg/L、KI 0.05～1.0mg/L、H3BO36.26.0～6.5mg/L、MnSO420～25mg/L、ZnSO48.0～9.0mg/L、Na2MoO40.2～0.3mg/L、CuSO40.2～0.3mg/L、鹽酸硫胺素3～8mg/L、煙酸0.3～0.8mg/L、鹽酸吡哆醇0.3～0.8mg/L、肌醇90～110mg/L、甘氨酸1～3mg/L、乙哚丁酸1.0～2.0mg/L、萘乙酸0.005～0.015mg/L，余量為水。
優選的，所述生根培養的條件包括：
所述培養的溫度為20～30℃；
所述培養的光照時間為10～15h/d；
所述培養的光照強度為2500～3500Lx；
所述培養的光源為三基色色溫6500k熒光燈；
所述培養的環境濕度為70～80％。
本發明還包括將上述技術方案得到的歐洲山楊再生組培苗進行兩步生根，所述兩步生根包括以下步驟：
1)將歐洲山楊再生組培苗的根部用高錳酸鉀溶液浸泡后，栽入基質內培養，得到再次生根的歐洲山楊組培苗；所述培養過程中第1～3天環境濕度為80～95％，第4～7天環境濕度為70～85％，第8～10天環境濕度為45～55％，第11天以后為自然環境濕度；
2)將所述步驟1)得到的再次生根的歐洲山楊組培苗移栽到自然光下培養；所述自然光下培養的晝溫為21～29℃，所述培養的夜溫為18～21℃，所述培養的環境濕度為80～95％。
本發明提供了一種歐洲山楊品系組培育苗方法，包括以下步驟：1)將帶有腋芽的莖段依次經過酒精溶液浸泡、無菌水沖洗、消毒劑消毒和無菌水再次沖洗后，去掉莖段的兩端1～2mm，得到外植體；2)將所述步驟1)得到的外植體接種到已滅菌的不定芽分化培養基中，分化培養30～45d，得到歐洲山楊不定芽；3)將所述步驟2)得到的歐洲山楊不定芽接種到已滅菌的繼代增殖培養基中進行繼代培養，得到1.2～2.0cm高的歐洲山楊不定芽；4)將所述步驟3)得到的1.2～2.0cm的歐洲山楊不定芽轉接到已滅菌的不定芽生根培養基中進行生根培養，得到歐洲山楊再生組培苗。采用此種方法進行移栽，將煉苗與移栽同步進行，減少了以往在培養瓶中煉苗，培養基被空氣中的雜菌污染，導致苗木污染，成活率降低。另外，利用速蘸高錳酸鉀的方式替代在多菌靈溶液中浸泡的方式進行苗木滅菌，減少了苗木與藥品接觸的面積，降低了成活率。采用本發明的組培育苗方法，得到組培苗的成活率為91.4～91.6％。本發明的組培育苗方法可使以一個莖段為基數，經培養一年內可增殖到10000～100000株組培苗。
具體實施方式
本發明提供了一種歐洲山楊品系組培育苗方法，包括以下步驟：
1)將帶有腋芽的莖段依次經過酒精溶液浸泡、無菌水沖洗、消毒劑消毒和無菌水再次沖洗后，去掉莖段的兩端1～2mm，得到外植體；
2)將所述步驟1)得到的外植體接種到已滅菌的不定芽分化培養基中，分化培養30～45d，得到歐洲山楊不定芽；
3)將所述步驟2)得到的歐洲山楊不定芽接種到已滅菌的繼代增殖培養基中進行繼代培養，得到1.2～2.0cm高的歐洲山楊不定芽；
4)將所述步驟3)得到的1.2～2.0cm的歐洲山楊不定芽轉接到已滅菌的不定芽生根培養基中進行生根培養，得到歐洲山楊再生組培苗。
本發明以帶有腋芽的莖段作為原材料培養得到歐洲山楊再生組培苗。在本發明中，所述莖段的來源優選為歐洲山楊根部萌發的或者生長在植株底部的嫩枝，將所述嫩枝在流水下沖洗1～2h后，除去所述嫩枝葉片，將帶有腋芽的嫩枝剪切成0.5～2cm長的莖段，所述莖段的長度更優選為1.0～1.5cm。
得到莖段后，本發明采用酒精溶液對所述莖段進行浸泡。在本發明中，所述酒精溶液的體積濃度優選為70～75％，更優選為72～74％；所述酒精溶液浸泡的時間優選為10～20s，更優選浸泡12～18s。
所述酒精溶液浸泡后，本發明采用無菌水對酒精溶液浸泡后的莖段進行沖洗。在本發明中，所述無菌水沖洗的次數優選為2～6次，更優選為沖洗3～5次。
所述無菌水沖洗后，本發明將沖洗后的莖段用消毒劑消毒。在本發明中，所述消毒劑優選為氯化汞溶液；所述氯化汞溶液中氯化汞的質量濃度優選為0.05～0.15％，更優選為0.08～0.12％，最優選為0.10％。在本發明中，所述消毒劑消毒的時間優選為1.5～4.5min，更優選為1.8～4.2min，最優選為2.0～4.0min。
所述消毒后，本發明將所述消毒后的莖段再次用無菌水進行沖洗，所述無菌水沖洗的次數優選為2～6次，更優選為3～5次。
所述無菌水再次沖洗后，本發明優選采用無菌濾紙將所述再次沖洗后的莖段上的無菌水吸干。
上述技術方案所述前處理過程后，本發明將得到的莖段去掉兩端1～2mm，得到外植體。在本發明的實施例中，具體采用已消毒的解剖刀對莖段的兩端切除。
得到外植體后，本發明將所述外植體接種到已滅菌的不定芽分化培養基中進行分化培養，得到歐洲山楊不定芽。在本發明中，所述分化培養的條件優選包括：所述培養的溫度優選為20～30℃，更優選為23～26℃；所述培養的光照時間優選為10～15h/d，更優選為12～14h/d；所述培養的光照強度優選為3500～5000Lx，更優選為3800～4800Lx；所述培養的光源為三基色色溫6500k熒光燈；所述培養的環境濕度優選為70～80％，更優選為72～78％；所述培養的天數為30～45d，優選為35～40d。
在本發明中，所述不定芽分化培養基優選包括以下組分：NH4NO3150～250mg/L、KNO3150～200mg/L、CaCl240～55mg/L、MgSO4170～200mg/L、Ca(NO3)2260～290mg/L、K2SO4140～160mg/L、KH2PO4170～200mg/L、KI0.41～0.42mg/L、H3BO32.5～3.5mg/L、MnSO411～12mg/L、ZnSO44.0～4.5mg/L、Na2MoO40.12～0.13mg/L、CuSO40.012～0.013mg/L、FeSO413.0～14.5mg/L、Na2-EDTA 18～19mg/L、肌醇40～60mg/L、鹽酸吡哆醇0.2～0.3mg/L、煙酸0.2～0.3mg/L、鹽酸硫胺素2～3mg/L、甘氨酸0.5～1.5mg/L、6-芐基腺嘌呤0.3～1.0mg/L，余量為水；更優選包括NH4NO3180～220mg/L、KNO3160～180mg/L、CaCl2 45～50mg/L、MgSO4 180～190mg/L、Ca(NO3)2270～280mg/L、K2SO4145～155mg/L、KH2PO4180～190mg/L、KI0.412～0.418mg/L、H3BO32.8～3.3mg/L、MnSO411.10～11.18mg/L、ZnSO44.1～4.4mg/L、Na2MoO40.121～0.128mg/L、CuSO40.0121～0.0128mg/L、FeSO413.3～14.2mg/L、Na2-EDTA 18.2～18.8mg/L、肌醇45～55mg/L、鹽酸吡哆醇0.22～0.28mg/L、煙酸0.22～0.28mg/L、鹽酸硫胺素2.2～2.8mg/L、甘氨酸0.8～1.2mg/L、6-芐基腺嘌呤0.4～0.8mg/L，余量為水；最優選包括NH4NO3200mg/L、KNO3170mg/L、CaCl248mg/L、MgSO4185mg/L、Ca(NO3)2275mg/L、K2SO4300mg/L、KH2PO4185mg/L、KI 0.415mg/L、H3BO33.1mg/L、MnSO411.15mg/L、ZnSO44.3mg/L、Na2MoO40.125mg/L、CuSO40.0125mg/L、FeSO413.9mg/L、Na2-EDTA 18.6mg/L、肌醇50mg/L、鹽酸吡哆醇0.25mg/L、煙酸0.25mg/L、鹽酸硫胺素2.5mg/L、甘氨酸1.0mg/L、6-芐基腺嘌呤0.5mg/L，余量為水。
本發明對所述不定芽分化培養基的滅菌條件沒有特殊限定，采用本領域技術人員常規選用的方法即可，如115～121℃滅菌15～30min。
得到歐洲山楊不定芽后，本發明將所述所述歐洲山楊不定芽接種到已滅菌的繼代增殖培養基中進行繼代培養，得到1.2～2.0cm高的歐洲山楊不定芽。在本發明中，所述繼代培養的條件包括：所述培養的溫度優選為20～30℃，更優選為23～26℃；所述培養的光照時間優選為10～15h/d，更優選為12～14h/d；所述培養的光照強度優選為3500～5000Lx，更優選為3800～4800Lx；所述培養的光源為三基色色溫6500k熒光燈；所述培養的環境濕度優選為70～80％，更優選為72～78％；所述培養的天數為20～30d，優選為23～28d。
在本發明中，所述繼代增殖培養基優選包括以下濃度的組分：KNO3300～400mg/L、NH4NO3350～450mg/L、CaCl290～100mg/L、MgSO4330～400mg/L、Ca(NO3)2500～600mg/L、K2SO4550～650mg/L、KH2PO4350～400mg/L、FeSO425～30mg/L、Na2-EDTA35～40mg/L、KI 0.5～1.0mg/L、H3BO36.0～6.5mg/L、MnSO420～25mg/L、ZnSO48.0～9.0mg/L、Na2MoO40.2～0.3mg/L、CuSO40.2～0.3mg/L、鹽酸硫胺素3～8mg/L、煙酸0.3～0.8mg/L、鹽酸吡哆醇0.3～0.8mg/L、肌醇90～110mg/L、甘氨酸1～3mg/L、6-芐基腺嘌呤0.5～1.5mg/L、萘乙酸0.03～0.08mg/L，余量為水；更優選包括KNO3320～360mg/L、NH4NO3380～420mg/L、CaCl293～97mg/L、MgSO4350～380mg/L、Ca(NO3)2520～580mg/L、K2SO4580～620mg/L、KH2PO4360～380mg/L、FeSO426～29mg/L、Na2-EDTA36～38mg/L、KI 0.5～0.9mg/L、H3BO36.1～6.3mg/L、MnSO421～24mg/L、ZnSO48.4～8.8mg/L、Na2MoO40.22～0.28mg/L、CuSO40.22～0.28mg/L、鹽酸硫胺素5～7mg/L、煙酸0.4～0.7mg/L、鹽酸吡哆醇0.4～0.7mg/L、肌醇95～105mg/L、甘氨酸1.5～2.5mg/L、6-芐基腺嘌呤0.8～1.2mg/L、萘乙酸0.04～0.07mg/L，余量為水；最優選包括KNO3340mg/L、NH4NO3400mg/L、CaCl296mg/L、MgSO4370mg/L、Ca(NO3)2550mg/L、K2SO4600mg/L、KH2PO4370mg/L、FeSO427.8mg/L、Na2-EDTA37.3mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO422.3mg/L、ZnSO48.6mg/L、Na2MoO40.25mg/L、CuSO40.25mg/L、鹽酸硫胺素5mg/L、煙酸0.5mg/L、鹽酸吡哆醇0.5mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、6-芐基腺嘌呤1.0mg/L、萘乙酸0.05mg/L，余量為水。
本發明對所述繼代增殖培養基的滅菌條件沒有特殊限定，采用本領域技術人員常規選用的方法即可，如115～121℃滅菌15～30min。
得到1.2～2.0cm高的歐洲山楊不定芽后，本發明將所述1.2～2.0cm高的歐洲山楊不定芽轉接到已滅菌的不定芽生根培養基中進行生根培養，得到歐洲山楊再生組培苗。在本發明中，所述生根培養的條件包括：所述培養的溫度優選為20～30℃，更優選為23～26℃；所述培養的光照時間優選為10～15h/d，更優選為12～14h/d；所述培養的光照強度優選為2000～4000Lx，更優選為2500～3500Lx；所述培養的光源為三基色色溫6500k熒光燈；所述培養的環境濕度優選為70～80％，更優選為72～78％，所述培養的天數為20～30d，優選為23～28d。
在本發明中，所述組培苗的高度優選為3～6cm，更優選為4～5cm；所述組培苗優選具有2～6片葉片，更優選為3～5片。
在本發明中，所述不定芽生根培養基優選包括以下濃度的組分：KNO3300～400mg/L、NH4NO3350～450mg/L、CaCl290～100mg/L、MgSO4330～400mg/L、Ca(NO3)2500～600mg/L、K2SO4550～650mg/L、KH2PO4350～400mg/L、FeSO425～30mg/L、Na2-EDTA35～40mg/L、KI 0.05～1.0mg/L、H3BO36.0～6.5mg/L、MnSO420～25mg/L、ZnSO48.0～9.0mg/L、Na2MoO40.2～0.3mg/L、CuSO40.2～0.3mg/L、鹽酸硫胺素3～8mg/L、煙酸0.3～0.8mg/L、鹽酸吡哆醇0.3～0.8mg/L、肌醇90～110mg/L、甘氨酸1～3mg/L、乙哚丁酸1.0～2.0mg/L、萘乙酸0.005～0.015mg/L，余量為水；更優選包括KNO3320～360mg/L、NH4NO3380～420mg/L、CaCl294～98mg/L、MgSO4350～390mg/L、Ca(NO3)2520～570mg/L、K2SO4580～620mg/L、KH2PO4360～380mg/L、FeSO426～19mg/L、Na2-EDTA 36～38mg/L、KI 0.7～0.9mg/L、H3BO36.1～6.4mg/L、MnSO421～24mg/L、ZnSO48.4～8.8mg/L、Na2MoO40.22～0.0.28mg/L、CuSO40.22～0.28mg/L、鹽酸硫胺素6～7mg/L、煙酸0.4～0.6mg/L、鹽酸吡哆醇0.4～0.6mg/L、肌醇95～105mg/L、甘氨酸1.5～2.5mg/L、乙哚丁酸1.2～1.8mg/L、萘乙酸0.008～0.012mg/L，余量為水；最優選包括KNO3340mg/L、NH4NO3400mg/L、CaCl2370mg/L、MgSO4370mg/L、Ca(NO3)2550mg/L、K2SO4600mg/L、KH2PO4370mg/L、FeSO427.8mg/L、Na2-EDTA37.3mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO422.3mg/L、ZnSO48.6mg/L、Na2MoO40.25mg/L、CuSO40.25mg/L、鹽酸硫胺素5mg/L、煙酸0.5mg/L、鹽酸吡哆醇0.5mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、乙哚丁酸1.5mg/L、萘乙酸0.01mg/L，余量為水。
本發明對所述不定芽生根培養基的滅菌條件沒有特殊限定，采用本領域技術人員常規選用的方法即可，如115～121℃滅菌15～30min。
得到歐洲山楊再生組培苗后，優選將所述組培苗的根部沾入高錳酸鉀溶液中，滅菌后直接栽入已滅菌的裝有蛭石的育苗盤內。在本發明中，高錳酸鉀溶液中高錳酸鉀的質量濃度優選為0.3～0.8％，更優選為0.5％。在本發明中，所述育苗盤內，組培苗的株行距為3cm×4cm。
在本發明中，所述組培苗移栽到育苗盤內的當日澆透水，優選在以后3d內用塑料膜將育苗盤連同所述組培苗一同蓋嚴，第4～10d逐漸揭去塑料膜。第1～3天空氣濕度優選保持在80～95％，更優選為85～90％；第4～7天空氣濕度優選保持在70～85％，更優選為75～80％；第8～10d空氣濕度優選保持在45～55％更優選為50％。優選在第2、7d分別以1/4MS培養基大量元素溶液進行葉面施肥，施肥量優選為25～35ml/m2，更優選為30ml/m2；移栽第7～15d后組培苗木長出新根。
在本發明中，將所述已經長出新根的組培苗連同粘在上面的蛭石優選一起植入輕基質網袋育苗容器內，在溫室中緩苗2～3d后移入自然光下，整個過程環境條件為：晝溫21℃～29℃、夜溫18℃～21℃、濕度80％～95％。
在本發明中，移栽到輕基質網袋育苗容器內的組培苗的水肥管理優選為容器內的基質濕度優選保持在45～85％，更優選為60％～70％。組培苗恢復生長后25～35d，用復合肥和尿素每隔10d噴施1次。所述復合肥與尿素的質量比優選為(0.5～1.5):(0.5～1.5)，更優選為1:1。所述噴施的濃度優選為0.3～0.8％，更優選為0.5％。所述噴施的噴施量優選為0.1～0.5％，更優選為0.3％。第二個月，所述噴施的濃度優選為0.5～0.6％，更優選為0.55％。第三個月，所述噴施的濃度優選為0.7～1.1％，更優選為0.8～1.0％。在本發明中，噴施復合肥和尿素后，優選采用清水沖洗液面，以免造成肥害。
在本發明中，移栽到輕基質網袋育苗容器內的組培苗的病害防治優選為每月用質量濃度為0.5％波爾多液與多菌靈500倍藥液交替噴灑1次，以防止立枯病的發生。所述0.5％波爾多液中的活性物質為硫酸銅和生石灰，質量比為1:1。
下面結合實施例對本發明提供的一種歐洲山楊品系組培育苗方法進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發明保護范圍的限定。
實施例1
將歐洲山楊根部萌發的嫩枝剪下，在流水下沖洗1h后，去除嫩枝葉片，將帶腋芽的嫩枝剪成1.0cm的莖段，用質量濃度為70％乙醇溶液對莖段表面進行消毒10ss，然后用無菌水沖洗3遍，再用質量濃度為0.1％氯化汞消毒2.0min后，再次用無菌水沖洗3遍，最后用無菌濾紙吸干無菌水，用已消毒的解剖刀切除帶腋芽莖段的兩端1mm，得到外植體；
將外植體接種到已滅菌的不定芽分化培養基中進行分化培養，得到歐洲山楊不定芽，培養的條件包括溫度23℃、光照時間12h/d，光強3500Lx、光源為三基色色溫6500k熒光燈和濕度70％的條件下培養30d，得到歐洲山楊的不定芽；不定芽分化培養基的組分為：NH4NO3200mg/L、KNO3170mg/L、CaCl248mg/L、MgSO4 185mg/L、Ca(NO3)2275mg/L、K2SO4300mg/L、KH2PO4185mg/L、KI 0.415mg/L、H3BO33.1mg/L、MnSO411.15mg/L、ZnSO44.3mg/L、Na2MoO40.125mg/L、CuSO40.0125mg/L、FeSO413.9mg/L、Na2-EDTA 18.65mg/L、肌醇50mg/L、鹽酸吡哆醇0.25mg/L、煙酸0.25mg/L、鹽酸硫胺素2.5mg/L、甘氨酸1.0mg/L、6-芐基腺嘌呤0.5mg/L，余量為水。
將歐洲山楊不定芽接種到已滅菌的繼代增殖培養基中進行增殖培養，得到1.5cm高的歐洲山楊不定芽。繼代培養的條件包括：溫度23℃、光照時間12h/d、光強3500Lx、光源為三基色色溫6500k熒光燈和濕度70％；繼代增殖培養基的組分為：KNO3340mg/L、NH4NO3400mg/L、CaCl296mg/L、MgSO4370mg/L、Ca(NO3)2550mg/L、K2SO4600mg/L、KH2PO4370mg/L、FeSO427.8mg/L、Na2-EDTA37.3mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO422.3mg/L、ZnSO48.6mg/L、Na2MoO40.25mg/L、CuSO40.25mg/L、鹽酸硫胺素5mg/L、煙酸0.5mg/L、鹽酸吡哆醇0.5mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、6-芐基腺嘌呤1.0mg/L、萘乙酸0.05mg/L，余量為水。
將1.5cm苗高的歐洲山楊不定芽轉接到已滅菌的不定芽生根培養基中進行生根培養，得到歐洲山楊再生組培苗。生根培養的條件包括：溫度23℃、光照時間12h/d、光強2500Lx、光源為三基色色溫6500k熒光燈、濕度70％～80％，得到苗高為4cm且具有3片葉片的歐洲山楊再生組培苗。不定芽生根培養基的組分為：KNO3340mg/L、NH4NO3400mg/L、CaCl296mg/L、MgSO4370mg/L、Ca(NO3)2550mg/L、K2SO4600mg/L、KH2PO4370mg/L、FeSO427.8mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO422.3mg/L、ZnSO48.6mg/L、Na2MoO40.25mg/L、CuSO40.25mg/L、鹽酸硫胺素5mg/L、煙酸0.5mg/L、鹽酸吡哆醇0.5mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、乙哚丁酸1.5mg/L、萘乙酸0.01mg/L，余量為水。
將歐洲山楊組培苗從不定芽生根培養基中拔出，洗掉根上附著的培養基，將根沾入質量濃度為0.5％的高錳酸鉀溶液中滅菌后直接栽入已滅菌的裝有蛭石的育苗盤內，株行距為3cm×4cm，當日澆透水，以后3d內用塑料膜將育苗盤連同移栽小苗一同蓋嚴，以保持相對濕度，第4～10d逐漸揭去塑料膜，第1～3d空氣濕度保持在85％，第4～7d空氣濕度保持在75％，第8～10d空氣濕度保持在50％。期間第2、7d分別以1/4MS培養基大量元素溶液進行葉面施肥，施肥量30ml/m2，移栽第7～15d后苗木長出新根。將已經長出新根的小苗連同粘在上面的蛭石一起植入輕基質網袋育苗容器內在溫室中緩苗2～3d，移入自然光下，正常生長和管理。
容器苗苗期水肥管理與病蟲害防治：輕基質網袋育苗法苗期生長要特別注意水肥的管理，基質濕度保持在25％。芽苗恢復生長后約30d，用復合肥和尿素對半拌勻，每隔10d追施1次，施肥濃度按0.5％，施肥量0.3g/株，隨著苗木增大，移栽后第二個月施肥濃度調整為0.55％，第三個月后調整為0.8％，同時施肥后用清水沖洗葉面，以免肥害。芽苗移栽成活后，每月用0.5％波爾多液與多菌靈500倍藥液交替噴灑1次，以防止立枯病的發生。
莖段經過酒精溶液浸泡和氯化汞溶液消毒后，對莖段的殺傷率為7.5％，對莖段的污染率為12.5％；莖段在不定芽分化培養基中分化培養后，分化率為87％，分化系數為4.23；歐洲山楊不定芽接種到繼代增殖培養基中進行增殖培養，增殖系數為4.5；歐洲山楊不定芽轉接到不定芽生根培養基中進行生根培養，生根率為89.6％，每組培苗生根條數為10條，成活率為91.4％；本發明的莖段經過分化培養、增殖培養和生根培養三個階段，使莖段的繁殖周期縮短1～2個月；將歐洲山楊組培苗移栽到育苗盤內，待長出新根后再移栽到育苗容器內培養，可使組培苗的移栽成活率在95％以上；移栽的歐洲山楊組培苗的莖、根干質量比例為1.5:1，組培苗的苗干90％以上達到木質化。
實施例2
將歐洲山楊根部萌發的嫩枝剪下，在流水下沖洗2h后，去除嫩枝葉片，將帶腋芽的嫩枝剪成1.5cm的莖段，用質量濃度為75％乙醇溶液對莖段表面進行消毒15s，然后用無菌水沖洗3遍，再用質量濃度為0.12％氯化汞消毒4.0min后，再次用無菌水沖洗3遍，最后用無菌濾紙吸干無菌水，用已消毒的解剖刀切除帶腋芽莖段的兩端2mm，得到外植體；
將外植體接種到已滅菌的不定芽分化培養基中進行分化培養，得到歐洲山楊不定芽，培養的條件包括溫度26℃、光照時間14h/d，光強5000Lx、光源為三基色色溫6500k熒光燈和濕度80％的條件下培養45d，得到歐洲山楊的不定芽；不定芽分化培養基的組分為：NH4NO3150mg/L、KNO3150mg/L、CaCl240mg/L、MgSO4200mg/L、Ca(NO3)2260mg/L、K2SO4140mg/L、KH2PO4200mg/L、KI 0.41mg/L、H3BO33.5mg/L、MnSO412mg/L、ZnSO44.5mg/L、Na2MoO40.12mg/L、CuSO40.012mg/L、FeSO413.0mg/L、Na2-EDTA18mg/L、肌醇40mg/L、鹽酸吡哆醇0.3mg/L、煙酸0.3mg/L、鹽酸硫胺素2.0mg/L、甘氨酸1.5mg/L、6-芐基腺嘌呤0.3mg/L，余量為水。
將歐洲山楊不定芽接種到已滅菌的繼代增殖培養基中進行增殖培養，得到2.0cm高的歐洲山楊不定芽。繼代培養的條件包括：溫度26℃、光照時間14h/d、光強5000Lx、光源為三基色色溫6500k熒光燈和濕度80％；繼代增殖培養基的組分為：KNO3300mg/L、NH4NO3350mg/L、CaCl290mg/L、MgSO4330mg/L、Ca(NO3)2500mg/L、K2SO4550mg/L、KH2PO4350mg/L、FeSO425mg/L、Na2-EDTA40mg/L、KI 0.5mg/L、H3BO36.5mg/L、MnSO425mg/L、ZnSO49.0mg/L、Na2MoO40.3mg/L、CuSO40.3mg/L、鹽酸硫胺素8mg/L、煙酸0.8mg/L、鹽酸吡哆醇0.3mg/L、肌醇110mg/L、甘氨酸3mg/L、6-芐基腺嘌呤1.5mg/L、萘乙酸0.08mg/L，余量為水。
將2.0cm苗高的歐洲山楊不定芽轉接到已滅菌的不定芽生根培養基中進行生根培養，得到歐洲山楊再生組培苗。生根培養的條件包括：溫度26℃、光照時間14h/d、光強2500Lx、光源為三基色色溫6500k熒光燈、濕度80％，得到苗高為4cm且具有5片葉片的歐洲山楊再生組培苗。不定芽生根培養基的組分為：KNO3300mg/L、NH4NO3350mg/L、CaCl296mg/L、MgSO4330mg/L、Ca(NO3)2500mg/L、K2SO4550mg/L、KH2PO4350mg/L、FeSO425mg/L、Na2-EDTA40mg/L、KI 0.5mg/L、H3BO36.5mg/L、MnSO425mg/L、ZnSO49.0mg/L、Na2MoO40.3mg/L、CuSO40.3mg/L、鹽酸硫胺素8mg/L、煙酸0.8mg/L、鹽酸吡哆醇0.3mg/L、肌醇90mg/L、甘氨酸1mg/L、乙哚丁酸1.0mg/L、萘乙酸0.015mg/L，余量為水。
將歐洲山楊組培苗從不定芽生根培養基中拔出，洗掉根上附著的培養基，將根沾入質量濃度為0.5％的高錳酸鉀溶液中滅菌后直接栽入已滅菌的裝有蛭石的育苗盤內，株行距為3cm×4cm，當日澆透水，以后3d內用塑料膜將育苗盤連同移栽小苗一同蓋嚴，以保持相對濕度，第4～10d逐漸揭去塑料膜，第1～3d空氣濕度保持在85％，第4～7d空氣濕度保持在75％，第8～10d空氣濕度保持在50％。期間第2、7d分別以1/4MS培養基大量元素溶液進行葉面施肥，施肥量30ml/m2，移栽第7～15d后苗木長出新根。將已經長出新根的小苗連同粘在上面的蛭石一起植入輕基質網袋育苗容器內在溫室中緩苗2～3d，移入自然光下，正常生長和管理。
容器苗苗期水肥管理與病蟲害防治：輕基質網袋育苗法苗期生長要特別注意水肥的管理，基質濕度保持在25％。芽苗恢復生長后約30d，用復合肥和尿素對半拌勻，每隔10d追施1次，施肥濃度按0.5％，施肥量0.3g/株，隨著苗木增大，移栽后第二個月施肥濃度調整為0.55％，第三個月后調整為0.8％，同時施肥后用清水沖洗葉面，以免肥害。芽苗移栽成活后，每月用0.5％波爾多液與多菌靈500倍藥液交替噴灑1次，以防止立枯病的發生。
莖段經過酒精溶液浸泡和氯化汞溶液消毒后，對莖段的殺傷率為7.4％，對莖段的污染率為12.0％；莖段在不定芽分化培養基中分化培養后，分化率為88％，分化系數為4.23；歐洲山楊不定芽接種到繼代增殖培養基中進行增殖培養，增殖系數為4.6；歐洲山楊不定芽轉接到不定芽生根培養基中進行生根培養，生根率為90％，每組培苗生根條數為14條，成活率為91.6％；本發明的莖段經過分化培養、增殖培養和生根培養三個階段，使莖段的繁殖周期縮短1～2個月；將歐洲山楊組培苗移栽到育苗盤內，待長出新根后再移栽到育苗容器內培養，可使組培苗的移栽成活率在95％以上，移栽的歐洲山楊組培苗的莖、根干質量比例為1.5:1，組培苗的苗干90％以上達到木質化。
實施例3
將歐洲山楊根部萌發的嫩枝剪下，在流水下沖洗1.5h后，去除嫩枝葉片，將帶腋芽的嫩枝剪成1.5cm的莖段，用質量濃度為75％乙醇溶液對莖段表面進行消毒20s，然后用無菌水沖洗3遍，再用質量濃度為0.08％氯化汞消毒3.5min后，再次用無菌水沖洗3遍，最后用無菌濾紙吸干無菌水，用已消毒的解剖刀切除帶腋芽莖段的兩端1.5mm，得到外植體；
將外植體接種到已滅菌的不定芽分化培養基中進行分化培養，得到歐洲山楊不定芽，培養的條件包括溫度24℃、光照時間13h/d，光強4000Lx、光源為三基色色溫6500k熒光燈和濕度75％的條件下培養35d，得到歐洲山楊的不定芽；不定芽分化培養基的組分為：NH4NO3250mg/L、KNO3200mg/L、CaCl255mg/L、MgSO4 170mg/L、Ca(NO3)2290mg/L、K2SO4160mg/L、KH2PO4170mg/L、KI 0.42mg/L、H3BO32.5mg/L、MnSO411mg/L、ZnSO44.0mg/L、Na2MoO40.13mg/L、CuSO40.013mg/L、FeSO414.5mg/L、Na2-EDTA19mg/L、肌醇60mg/L、鹽酸吡哆醇0.2mg/L、煙酸0.2mg/L、鹽酸硫胺素3.0mg/L、甘氨酸0.5mg/L、6-芐基腺嘌呤1.0mg/L，余量為水。
將歐洲山楊不定芽接種到已滅菌的繼代增殖培養基中進行增殖培養，得到2.0cm高的歐洲山楊不定芽。繼代培養的條件包括：溫度25℃、光照時間13h/d、光強4000Lx、光源為三基色色溫6500k熒光燈和濕度75％；繼代增殖培養基的組分為：KNO3400mg/L、NH4NO3450mg/L、CaCl2100mg/L、MgSO4400mg/L、Ca(NO3)2600mg/L、K2SO4650mg/L、KH2PO4400mg/L、FeSO430mg/L、Na2-EDTA35mg/L、KI 1.0mg/L、H3BO36.0mg/L、MnSO430mg/L、ZnSO48.0mg/L、Na2MoO40.2mg/L、CuSO40.2mg/L、鹽酸硫胺素3mg/L、煙酸0.8mg/L、鹽酸吡哆醇0.8mg/L、肌醇90mg/L、甘氨酸1mg/L、6-芐基腺嘌呤0.5mg/L、萘乙酸0.03mg/L，余量為水。
將2.0cm苗高的歐洲山楊不定芽轉接到已滅菌的不定芽生根培養基中進行生根培養，得到歐洲山楊再生組培苗。生根培養的條件包括：溫度24℃、光照時間13h/d、光強3000Lx、光源為三基色色溫6500k熒光燈、濕度75％，得到苗高為4cm且具有4片葉片的歐洲山楊再生組培苗。不定芽生根培養基的組分為：KNO3400mg/L、NH4NO3350mg/L、CaCl296mg/L、MgSO4330mg/L、Ca(NO3)2500mg/L、K2SO4550mg/L、KH2PO4350mg/L、FeSO425mg/L、Na2-EDTA40mg/L、KI 0.5mg/L、H3BO36.5mg/L、MnSO425mg/L、ZnSO49.0mg/L、Na2MoO40.3mg/L、CuSO40.3mg/L、鹽酸硫胺素8mg/L、煙酸0.8mg/L、鹽酸吡哆醇0.3mg/L、肌醇90mg/L、甘氨酸1mg/L、乙哚丁酸1.0mg/L、萘乙酸0.015mg/L，余量為水。
將歐洲山楊組培苗從不定芽生根培養基中拔出，洗掉根上附著的培養基，將根沾入質量濃度為0.5％的高錳酸鉀溶液中滅菌后直接栽入已滅菌的裝有蛭石的育苗盤內，株行距為3cm×4cm，當日澆透水，以后3d內用塑料膜將育苗盤連同移栽小苗一同蓋嚴，以保持相對濕度，第4～10d逐漸揭去塑料膜，第1～3d空氣濕度保持在85％，第4～7d空氣濕度保持在75％，第8～10d空氣濕度保持在50％。期間第2、7d分別以1/4MS培養基大量元素溶液進行葉面施肥，施肥量30ml/m2，移栽第7～15d后苗木長出新根。將已經長出新根的小苗連同粘在上面的蛭石一起植入輕基質網袋育苗容器內在溫室中緩苗2～3d，移入自然光下，正常生長和管理。
容器苗苗期水肥管理與病蟲害防治：輕基質網袋育苗法苗期生長要特別注意水肥的管理，基質濕度保持在25％。芽苗恢復生長后約30d，用復合肥和尿素對半拌勻，每隔10d追施1次，施肥濃度按0.5％，施肥量0.3g/株，隨著苗木增大，移栽后第二個月施肥濃度調整為0.55％，第三個月后調整為0.8％，同時施肥后用清水沖洗葉面，以免肥害。芽苗移栽成活后，每月用0.5％波爾多液與多菌靈500倍藥液交替噴灑1次，以防止立枯病的發生。
莖段經過酒精溶液浸泡和氯化汞溶液消毒后，對莖段的殺傷率為7.3％，對莖段的污染率為12.2％；莖段在不定芽分化培養基中分化培養后，分化率為89％，分化系數為4.23；歐洲山楊不定芽接種到繼代增殖培養基中進行增殖培養，增殖系數為4.6；歐洲山楊不定芽轉接到不定芽生根培養基中進行生根培養，生根率為90％，每組培苗生根條數為9條，成活率為91.6％；本發明的莖段經過分化培養、增殖培養和生根培養三個階段，使莖段的繁殖周期縮短1～2個月；將歐洲山楊組培苗移栽到育苗盤內，待長出新根后再移栽到育苗容器內培養，可使組培苗的移栽成活率在95％以上，移栽的歐洲山楊組培苗的莖、根干質量比例為1.5:1，組培苗的苗干90％以上達到木質化。
由以上實施例可知，采用本發明的歐洲山楊品系組培育苗方法，得到組培苗的成活率為91.4～91.6％。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。