本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種貴港報春苣苔的組織培養方法。

背景技術：

貴港報春苣苔(primulinaguigangensis)為苦苣苔科報春苣苔屬的多年生草本植物。該種2011年于廣西貴港市樟木鎮首次發現。貴港報春苣苔生于海拔160米的石灰巖山區，能夠適應每年顯著的干濕季節交替，由于其對環境的要求仍較苛刻，生態位極為狹小，種群數量正在逐漸減少。開展人工繁殖研究是保護物種的基礎。貴港報春苣苔的繁殖可采用種子繁殖和扦插繁殖，但種子繁殖常受種源及發芽率的影響，而貴港報春苣苔又沒有伸長的莖干用于扦插，因此葉片扦插是最簡單常用的繁殖方法。葉片扦插繁殖速度慢，繁殖系數小，而組織培養具有快速且易成規模，成品苗品質優良整齊的優點，是人工繁殖的有效途徑。

目前，組織培養方法已在報春苣苔屬的其他植物上有相關研究，但該種的組織培養研究尚未有相關報道。因此，建立貴港報春苣苔的組織培養體系，對進一步保護和利用該物種具有十分重要的意義。

技術實現要素：

針對現有的貴港報春苣苔繁育技術的匱乏與不足，本發明提供一種貴港報春苣苔的組織培養方法，從而可以達到進一步保護和利用該物種的目的。

為了實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案：

一種貴港報春苣苔的組織培養方法，包括如下步驟：

(1)外植體的消毒滅菌：于春季取貴港報春苣苔帶葉柄的幼嫩葉片，先用洗衣粉浸泡10-15min后在流水下沖洗干凈10-15min，并用軟毛刷輕輕刷洗葉片；在超凈工作臺上先用棉球蘸取70％酒精拭擦葉片表面，無菌蒸餾水沖洗3-5次，將葉片在75％酒精中浸泡10-12s，無菌蒸餾水沖洗3-5次，再用0.1％升汞溶液處理8-10min，無菌蒸餾水沖洗3-5次；滅菌過程中輕輕震蕩使酒精或升汞充分接觸葉片；所述的0.1％升汞溶液中加入有吐溫-20，每100ml0.1％升汞溶液中加入2滴吐溫-20；

(2)初代誘導：將消毒滅菌好的葉片切下葉柄，余下的葉片按照以下方法切割：橫切、縱切，切下的葉片要求四周切去少許組織，保證四周均有切口；然后將葉柄接入初代培養基中培養25-30d，得到愈傷組織；將橫切葉片和縱切葉片接入初代培養基中培養24-30d，誘導出不定芽和愈傷組織；要求葉柄、葉片的正面朝上，葉背朝下，使葉背接觸培養基；

(3)增殖培養：將從葉片直接獲得的具有1對以上葉片的不定芽接入增殖培養基中培養28-35d；

(4)愈傷組織分化：將從葉片或葉柄誘導出來的愈傷組織切成1cm×1cm大小，然后接入分化培養基中培養30-32d；

(5)壯苗培養：當組培苗具有2對以上葉片時，轉接于壯苗培養基中培養15-18d；

(6)生根培養：選取生長健壯，具有2對以上葉片的植株，轉接于生根培養基中培養25-28d。

作為優選，步驟(2)中所述的橫切是在葉片中部位置垂直中脈切下，將葉片一分為二；所述的縱切是沿著葉片中脈將葉片切為兩部分。

作為優選，步驟(2)中用于葉柄的愈傷組織誘導培養基為：ms+6-ba3-5mg/l+2,4-d0.5-1.0mg/l。

作為優選，步驟(2)中用于葉片的不定芽誘導培養基為ms+6-ba3.0-5.0mg/l+iaa1.0-2.0mg/l，用于葉片的愈傷組織誘導培養基為ms+6-ba3-5mg/l+2,4-d0.5-1.0mg/l。

作為優選，步驟(3)中所述的增殖培養基為ms+zt0.5-1.0mg/l+naa0.05-0.10mg/l+土豆30g/l+香蕉30g/l+蘋果20g/l+椰汁100ml/l。

作為優選，步驟(4)中所述的分化培養基為ms+kt0.5-1.5mg/l+naa0.1-0.3mg/l+土豆30g/l+香蕉30g/l+蘋果20g/l+椰汁100ml/l。

作為優選，步驟(5)中所述的壯苗培養基為1/2ms+土豆10-30g/l+香蕉15-45g/l+椰汁100-200ml/l。

作為優選，所述的1/2ms培養基為：將ms培養基中的大量元素減至一半，蔗糖為15g/l，其余成分及用量與ms保持一致。

作為優選，步驟(6)中所述的生根培養基為3/4ms+naa0.01-0.05mg/l+活性炭1.0-3.0g/l。

作為優選，所述的3/4ms培養基為：將ms培養基中的大量元素減為3/4，蔗糖為22.5g/l，其余成分及用量與ms保持一致。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：

本發明的貴港報春苣苔的組織培養方法具有后代長勢良好，繁殖速度快、繁殖系數大，繁殖后代整齊一致和生根率高的優點。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和本質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。

實施例1：

一種貴港報春苣苔的組織培養方法，包括如下步驟：

(1)外植體的消毒滅菌：于春季取貴港報春苣苔帶葉柄的幼嫩葉片，先用洗衣粉浸泡10min后在流水下沖洗干凈10min，并用毛筆輕輕刷洗葉片；在超凈工作臺上先用棉球蘸取70％酒精拭擦葉片表面，無菌蒸餾水沖洗3次，將葉片在75％酒精中浸泡10s，無菌蒸餾水沖洗3次，再用0.1％升汞溶液處理8min，無菌蒸餾水沖洗3次；滅菌過程中輕輕震蕩使酒精或升汞充分接觸葉片；所述的0.1％升汞溶液中加入有吐溫-20，每100ml0.1％升汞溶液中加入2滴吐溫-20；

(2)初代誘導：將消毒滅菌好的葉片切下葉柄，余下的葉片按照以下方法切割：橫切、縱切，切下的葉片要求四周均切去少許組織，保證四周均有傷口；然后將葉柄接入愈傷組織誘導培養基中培養25d，得到愈傷組織；將橫切葉片和縱切葉片接入不定芽誘導培養基和愈傷組織誘導培養基中培養24d，誘導出不定芽和愈傷組織；要求葉柄、葉片的正面朝上，葉背朝下，使葉背接觸培養基；所述的橫切是在葉片中部位置垂直中脈切下，將葉片一分為二；所述的縱切是沿著葉片中脈將葉片切為兩部分；用于葉柄的愈傷組織誘導培養基為：ms+6-ba3mg/l+2,4-d0.5mg/l；用于葉片的不定芽誘導培養基為ms+6-ba3.0mg/l+iaa1.0mg/l，用于葉片的愈傷組織誘導培養基為ms+6-ba3mg/l+2,4-d0.5mg/l；

(3)增殖培養：將從葉片直接獲得的具有1對以上葉片的不定芽接入增殖培養基中培養28d；所述的增殖培養基為ms+zt0.5mg/l+naa0.05mg/l+土豆30g/l+香蕉30g/l+蘋果20g/l+椰汁100ml/l；

(4)愈傷組織分化：將從葉片誘導出來的愈傷組織切成1cm×1cm大小，然后接入分化培養基中培養30d；所述的分化培養基為ms+kt0.5mg/l+naa0.1mg/l+土豆30g/l+香蕉30g/l+蘋果20g/l+椰汁100ml/l；

(5)壯苗培養：當組培苗具有2對以上葉片時，轉接于壯苗培養基中培養15d；所述的壯苗培養基為1/2ms+土豆10g/l+香蕉15g/l+椰汁100ml/l；所述的1/2ms培養基為：將ms培養基中的大量元素減至一半，蔗糖為15g/l，其余成分及用量與ms保持一致；

(6)生根培養：選取生長健壯，具有2對以上葉片的植株，轉接于生根培養基中培養25d；所述的生根培養基為3/4ms+naa0.01mg/l+活性炭1.0g/l；所述的3/4ms培養基為：將ms培養基中的大量元素減為3/4，蔗糖為22.5g/l，其余成分及用量與ms保持一致。

實施例2：

一種貴港報春苣苔的組織培養方法，包括如下步驟：

(1)外植體的消毒滅菌：于春季取貴港報春苣苔帶葉柄的幼嫩葉片，先用洗衣粉浸泡15min后在流水下沖洗干凈15min，并用毛筆輕輕刷洗葉片；在超凈工作臺上先用棉球蘸取70％酒精拭擦葉片表面，無菌蒸餾水沖洗5次，將葉片在75％酒精中浸泡12s，無菌蒸餾水沖洗5次，再用0.1％升汞溶液處理10min，無菌蒸餾水沖洗5次；滅菌過程中輕輕震蕩使酒精或升汞充分接觸葉片；所述的0.1％升汞溶液中加入有吐溫-20，每100ml0.1％升汞溶液中加入2滴吐溫-20；

(2)初代誘導：將消毒滅菌好的葉片切下葉柄，余下的葉片按照以下方法切割：橫切、縱切，切下的葉片要求四周均切去少許組織，保證四周均有傷口；然后將葉柄接入愈傷組織誘導培養基中培養30d，得到愈傷組織；將橫切葉片和縱切葉片接入不定芽誘導培養基和愈傷組織誘導培養基中培養30d，誘導出不定芽和愈傷組織；要求葉柄、葉片的正面朝上，葉背朝下，使葉背接觸培養基；所述的橫切是在葉片中部位置垂直中脈切下，將葉片一分為二；所述的縱切是沿著葉片中脈將葉片切為兩部分；用于葉柄的愈傷組織誘導培養基為：ms+6-ba5mg/l+2,4-d1.0mg/l；用于葉片的不定芽誘導培養基為ms+6-ba5.0mg/l+iaa2.0mg/l，用于葉片的愈傷組織誘導培養基為ms+6-ba5mg/l+2,4-d1.0mg/l；

(3)增殖培養：將從葉片直接獲得的具有1對以上葉片的不定芽接入增殖培養基中培養35d；所述的增殖培養基為ms+zt1.0mg/l+naa0.10mg/l+土豆30g/l+香蕉30g/l+蘋果20g/l+椰汁100ml/l；

(4)愈傷組織分化：將從葉片誘導出來的愈傷組織切成1cm×1cm大小，然后接入分化培養基中培養32d；所述的分化培養基為ms+kt1.5mg/l+naa0.3mg/l+土豆30g/l+香蕉30g/l+蘋果20g/l+椰汁100ml/l；

(5)壯苗培養：當組培苗具有2對以上葉片時，轉接于壯苗培養基中培養18d；所述的壯苗培養基為1/2ms+土豆30g/l+香蕉45g/l+椰汁200ml/l；所述的1/2ms培養基為：將ms培養基中的大量元素減至一半，蔗糖為15g/l，其余成分及用量與ms保持一致；

(6)生根培養：選取生長健壯，具有2對以上葉片的植株，轉接于生根培養基中培養28d；所述的生根培養基為3/4ms+naa0.05mg/l+活性炭3.0g/l；所述的3/4ms培養基為：將ms培養基中的大量元素減為3/4，蔗糖為22.5g/l，其余成分及用量與ms保持一致。

實施例3：

一種貴港報春苣苔的組織培養方法，包括如下步驟：

(1)外植體的消毒滅菌：于春季取貴港報春苣苔帶葉柄的幼嫩葉片，先用洗衣粉浸泡12min后在流水下沖洗干凈12min，并用毛筆輕輕刷洗葉片；在超凈工作臺上先用棉球蘸取70％酒精拭擦葉片表面，無菌蒸餾水沖洗4次，將葉片在75％酒精中浸泡11s，無菌蒸餾水沖洗4次，再用0.1％升汞溶液處理9min，無菌蒸餾水沖洗4次；滅菌過程中輕輕震蕩使酒精或升汞充分接觸葉片；所述的0.1％升汞溶液中加入有吐溫-20，每100ml0.1％升汞溶液中加入2滴吐溫-20；

(2)初代誘導：將消毒滅菌好的葉片切下葉柄，余下的葉片按照以下方法切割：橫切、縱切，切下的葉片要求四周均切去少許組織，保證四周均有傷口；然后將葉柄接入愈傷組織誘導培養基中培養28d，得到愈傷組織；將橫切葉片和縱切葉片接入不定芽誘導培養基和愈傷組織誘導培養基中培養26d，誘導出不定芽和愈傷組織；要求葉柄、葉片的正面朝上，葉背朝下，使葉背接觸培養基；所述的橫切是在葉片中部位置垂直中脈切下，將葉片一分為二；所述的縱切是沿著葉片中脈將葉片切為兩部分；用于葉柄的愈傷組織誘導培養基為：ms+6-ba4mg/l+2,4-d0.8mg/l；用于葉片的不定芽誘導培養基為ms+6-ba4.0mg/l+iaa1.5mg/l，用于葉片的愈傷組織誘導培養基為ms+6-ba4mg/l+2,4-d0.8mg/l；

(3)增殖培養：將從葉片直接獲得的具有1對以上葉片的不定芽接入增殖培養基中培養30d；所述的增殖培養基為ms+zt0.8mg/l+naa0.07mg/l+土豆30g/l+香蕉30g/l+蘋果20g/l+椰汁100ml/l；

(4)愈傷組織分化：將從葉片誘導出來的愈傷組織切成1cm×1cm大小，然后接入分化培養基中培養31d；所述的分化培養基為ms+kt1.0mg/l+naa0.2mg/l+土豆30g/l+香蕉30g/l+蘋果20g/l+椰汁100ml/l；

(5)壯苗培養：當組培苗具有2對以上葉片時，轉接于壯苗培養基中培養16d；所述的壯苗培養基為1/2ms+土豆20g/l+香蕉30g/l+椰汁150ml/l；所述的1/2ms培養基為：將ms培養基中的大量元素減至一半，蔗糖為15g/l，其余成分及用量與ms保持一致；

(6)生根培養：選取生長健壯，具有2對以上葉片的植株，轉接于生根培養基中培養26d；所述的生根培養基為3/4ms+naa0.03mg/l+活性炭2.0g/l；所述的3/4ms培養基為：將ms培養基中的大量元素減為3/4，蔗糖為22.5g/l，其余成分及用量與ms保持一致。

將上述實施例1-3得到的貴港報春苣苔的組織培養方法中不定芽誘導、愈傷組織誘導、不定芽的增殖、愈傷組織分化、生根情況進行調查統計，結果見表1。

表1本發明的貴港報春苣苔的組織培養方法對不定芽誘導、愈傷組織誘導、不定芽的增殖、愈傷組織分化、生根情況的測定

由表1可知，本發明的貴港報春苣苔的組織培養方法得到的不定芽長勢良好，不定芽多；其誘導率和生根率均為100％。可見，本發明的方法具有明顯的技術優勢，值得進一步推廣和應用。

前述對本發明的具體示例性實施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據上述教導，可以進行很多改變和變化。對示例性實施例進行選擇和描述的目的在于解釋本發明的特定原理及其實際應用，從而使得本領域的技術人員能夠實現并利用本發明的各種不同的示例性實施方案以及各種不同的選擇和改變。本發明的范圍意在由權利要求書及其等同形式所限定。