本發(fā)明屬于組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種龍腦樟試管苗增殖及復(fù)壯的方法。
背景技術(shù)：
龍腦樟系我國首次發(fā)現(xiàn)的一種樟樹(cinnamomumcamphora)特異化學(xué)型——龍腦型樟，其葉片精油富含右旋龍腦(天然冰片)，是目前最適宜提取天然冰片的植物資源，龍腦樟的發(fā)現(xiàn)也填補(bǔ)了我國不產(chǎn)天然冰片的歷史空白。近年來龍腦樟的繁殖以扦插為主，也可播種和嫁接。然而傳統(tǒng)繁殖方法增殖系數(shù)低、周期長、占地面積大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足商品苗規(guī)模化、規(guī)范化生產(chǎn)的需要，是阻礙我國天然冰片產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素。植物組織培養(yǎng)技術(shù)具有繁殖周期短，增殖系數(shù)高等優(yōu)點，已是公認(rèn)的植物快速繁殖的有效途徑。
目前，關(guān)于龍腦樟組織培養(yǎng)技術(shù)的研究極少，有關(guān)龍腦樟試管苗在長期離體培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的玻璃化、褐化及葉片萎蔫等問題的系統(tǒng)研究更未見報道。劉秀芳(2011)等人雖然對龍腦樟組織培養(yǎng)程序和步驟進(jìn)行了初步探究，但該技術(shù)仍然難以應(yīng)用于生產(chǎn)，其試管苗增殖系數(shù)低、玻璃化及褐化嚴(yán)重是主要原因。最新發(fā)表的龍腦樟增殖方法如下：
(1)切取龍腦樟不定芽接種至含細(xì)胞分裂素6-ba2.0mg/l、zt0.1mg/l以及生長素iba0.5mg/l的增殖培養(yǎng)基ms中，并添加卡拉膠3.0g/l，蔗糖30g/l，ph＝7.0。接種后，組培苗置于25～26℃下光照培養(yǎng)40天以促進(jìn)增殖。光照時間和光照強(qiáng)度未說明。(戴小英，2016)
(2)切取龍腦樟不定芽接種至含細(xì)胞分裂素6-ba2.0mg/l、生長素naa0.05mg/l的增殖培養(yǎng)基改良ms(硝酸銨減至原濃度的1/2)中，并添加卡拉膠6.5g/l，蔗糖30g/l，ph＝5.8。置于25℃下光照培養(yǎng)30天以促進(jìn)增殖，光照時間11h/d，光照強(qiáng)度3000lx。(劉秀芳，2011)
(3)將愈傷組織和不定芽接種于附加6-ba0.3～2.0mg/l，生長素naa0.05～0.2mg/l，na2s2o3100～300mg/l的增殖培養(yǎng)基改良ms(硝酸鉀和硝酸銨減至原濃度的1/2，氯化鈣成分增加20％，硫酸鹽成分加倍)中，并添加卡拉膠0.8％，蔗糖3％，ph＝5.5。置于26～28℃下光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1500lx～2000lx，光照周期為12h/d。(胡慶和彭建軍，2015)
上述技術(shù)(1)與(2)中，隨分裂素6-ba濃度增加，試管苗增殖系數(shù)可達(dá)2.0～6.4。但試管苗長期培養(yǎng)在含高濃度6-ba的培養(yǎng)基中會導(dǎo)致基部愈傷組織增多，葉片愈傷化，葉柄甚至全株玻璃化。玻璃化試管苗畸形生長，增殖系數(shù)及生根率極低，移栽后難以成活。bornman等研究表明，6-ba的積累與不定芽分化和玻璃化是同步的，由此可見，6-ba是導(dǎo)致試管苗玻璃化的重要因素。技術(shù)(3)降低6-ba濃度雖然可以減輕玻璃化，但試管苗增殖系數(shù)極低(2.73)，不能滿足生產(chǎn)需求。總之，現(xiàn)有的龍腦樟增殖技術(shù)均不能同時有效的解決試管苗增殖及玻璃化問題。
褐化是導(dǎo)致龍腦樟試管苗增殖系數(shù)不高的另一個重要因素，培養(yǎng)基中的酚類物質(zhì)被氧化成褐色有毒的醌類物質(zhì)，直接毒害試管苗，導(dǎo)致增殖系數(shù)及試管苗質(zhì)量下降。現(xiàn)有龍腦樟增殖技術(shù)并未針對褐化問題進(jìn)行相關(guān)研究，導(dǎo)致多代培養(yǎng)后龍腦樟試管苗褐化嚴(yán)重，葉片發(fā)黃枯萎，生根移栽困難。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明是針對龍腦樟長期離體增殖培養(yǎng)過程中存在的增殖系數(shù)不高、玻璃化、褐化等問題，提供一種增殖系數(shù)高、有效降低玻璃化和褐化，提高試管苗質(zhì)量的增殖復(fù)壯培養(yǎng)方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
a.增殖培養(yǎng)方式：切取龍腦樟叢生芽上莖段長度為1～2cm的不定芽，切去葉片，在距芽基部1/3處進(jìn)行平切刻傷后接種于增殖培養(yǎng)基中。
b.增殖培養(yǎng)基：以改良ms(氯化鈣成分加倍，硝酸銨減至原濃度的1/4)為基本培養(yǎng)基(表1)，并附加分裂素6-ba0.8～1.2mg/l、生長素naa0.045～0.055mg/l、赤霉素ga30.1～0.3mg/l、防褐劑agno31.0～2.0mg/l、蔗糖25～35g/l以及卡拉膠5.0～6.0g/l，ph＝6.0。
c.增殖培養(yǎng)條件：將不定芽接種于增殖培養(yǎng)基后，先置于黑暗環(huán)境下培養(yǎng)1～3天(agno3見光分解)，之后轉(zhuǎn)光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度2000～3000lx，光照周期12h/d，培養(yǎng)溫度25±1℃，培養(yǎng)周期為25～35天。
d.復(fù)壯培養(yǎng)方式：連續(xù)增殖培養(yǎng)三代后轉(zhuǎn)復(fù)壯培養(yǎng)。以增殖培養(yǎng)末期獲得的叢生芽為材料，切取健壯的不定芽并保留2～3片葉，接種于復(fù)壯培養(yǎng)基中。
e.復(fù)壯培養(yǎng)基：以改良1/2ms(大量元素成分為改良ms的1/2，其他成分不變)為基本培養(yǎng)基，附加生長素naa0.045～0.055mg/l、活性炭1.0～1.5g/l、椰汁50～100ml/l、蔗糖25～35g/l以及卡拉膠5.0～6.0g/l，ph＝6.0。
f.復(fù)壯培養(yǎng)條件：將不定芽接種于復(fù)壯培養(yǎng)基后進(jìn)行光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度2000～3000lx，光照周期12h/d，培養(yǎng)溫度25±1℃，培養(yǎng)周期為15～20天。
龍腦樟增殖培養(yǎng)過程中發(fā)生玻璃化和褐化問題是導(dǎo)致試管苗增殖系數(shù)及生長質(zhì)量下降的主要原因。連續(xù)多代使用高濃度細(xì)胞分裂素6-ba雖然有助于提高試管苗增殖系數(shù)，但增殖的芽往往生長勢減弱，不定芽短小，發(fā)生玻璃化現(xiàn)象，導(dǎo)致無法進(jìn)行生根培養(yǎng)；即使能夠生根，移栽成活率也不高。本發(fā)明通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度，降低培養(yǎng)基中分裂素6-ba濃度，結(jié)合低濃度ga3、naa配合使用，在提高試管苗增殖系數(shù)的同時顯著減輕玻璃化現(xiàn)象。
通過將ms培養(yǎng)基中氯化鈣含量加倍，硝酸銨含量降至原濃度1/4，從而提高培養(yǎng)基中ca2+濃度，降低nh4+濃度，有利于組培苗的生長，同時能減輕組培苗葉片發(fā)黃萎蔫現(xiàn)象。
試管苗在離體培養(yǎng)過程中會產(chǎn)生影響植物生長和分化的乙烯，硝酸銀中的ag+可以抑制乙烯活性，從而促進(jìn)植物的生長增殖。本發(fā)明在增殖培養(yǎng)階段添加防褐劑agno31.0～2.0mg/l，并結(jié)合1～3天短期暗培養(yǎng)可顯著減輕龍腦樟試管苗褐化問題，同時提高增殖系數(shù)。
本發(fā)明在每增殖三代后交替進(jìn)行復(fù)壯培養(yǎng)，可以改變試管苗內(nèi)源激素水平平衡，減輕玻璃化，提高試管苗質(zhì)量，從而有利于后期的生根和移栽。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
⑴本發(fā)明的增殖方式使龍腦樟試管苗增殖系數(shù)達(dá)到9.0～11.0，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出背景技術(shù)中的三種增殖方法的增殖系數(shù)水平(2.0～6.4)。
⑵試管苗基部愈傷組織極少，葉片嫩綠，莖干充實，基本無玻璃化現(xiàn)象，試管苗生長健壯。
⑶增殖培養(yǎng)過程中組培苗褐化程度明顯減輕，培養(yǎng)基輕微或無褐化現(xiàn)象，試管苗生長后期葉片正常，無發(fā)黃萎蔫現(xiàn)象。
⑷復(fù)壯培養(yǎng)能夠減輕玻璃化現(xiàn)象，同時調(diào)節(jié)試管苗體內(nèi)激素平衡，降低外源激素對其生長的影響，有利于試管苗后期生根移栽。
具體實施方式
實施例一、
a、增殖培養(yǎng)：切取莖段長度為1～2cm的龍腦樟不定芽，切去全部葉片，在距側(cè)芽基部1/3處進(jìn)行平切刻傷后接種于改良ms(氯化鈣加倍，硝酸銨減至原濃度的1/4)培養(yǎng)基(表1)中，并附加分裂素6-ba1.0mg/l、生長素naa0.05mg/l、赤霉素ga30.3mg/l、防褐劑agno3(見光分解)1.0mg/l、蔗糖30g/l以及卡拉膠6.0g/l，ph＝6.0。培養(yǎng)條件：接種后先置于暗環(huán)境下培養(yǎng)3天(避免硝酸銀分解)，之后轉(zhuǎn)光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度3000lx，光照周期12h/d，培養(yǎng)溫度25±1℃，培養(yǎng)周期30天。
b、復(fù)壯培養(yǎng)：組培苗連續(xù)增殖三代后轉(zhuǎn)復(fù)壯培養(yǎng)，切取健壯不定芽并保留2～3片葉，接種于含生長素naa0.05mg/l的改良1/2ms(大量元素成分為改良ms的1/2，其他成分不變，如表1’)培養(yǎng)基中，并添加活性炭1.5g/l、椰汁100ml/l、蔗糖30g/l以及卡拉膠6.0g/l，ph＝6.0。培養(yǎng)條件：接種后進(jìn)行光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度3000lx，光照周期12h/d，培養(yǎng)溫度25±1℃，培養(yǎng)周期為20天。復(fù)壯培養(yǎng)之后繼續(xù)轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基。
表1改良ms培養(yǎng)基成分表
表1’改良1/2ms培養(yǎng)基成分表
實施例二、
與實施例一相比，步驟a中培養(yǎng)周期更換為25天，步驟b培養(yǎng)周期更換為15天。培養(yǎng)末期，組培苗平均增殖系數(shù)達(dá)9.28，基本無玻璃化現(xiàn)象。
實施例三、
與實施例一相比，步驟a、b中光照強(qiáng)度均更換為2000lx。培養(yǎng)末期，組培苗平均增殖系數(shù)達(dá)9.07，基本無玻璃化現(xiàn)象。
以下為本發(fā)明中各種因素對龍腦樟增殖壯苗的影響：
試驗1復(fù)壯時間對試管苗增殖及生長的影響
①材料：龍腦樟繼代培養(yǎng)試管苗。
②方法：試管苗連續(xù)增殖培養(yǎng)三代后，培養(yǎng)末期切取健壯不定芽并保留2～3片葉，接種于復(fù)壯培養(yǎng)基中進(jìn)行不同時間復(fù)壯處理(0，5，10，15，20，25，30天)。以改良1/2ms附加生長素naa0.05mg/l，活性炭1.5g/l，椰汁100ml/l，蔗糖30g/l，卡拉膠6.0g/l，ph＝6.0為復(fù)壯培養(yǎng)基。完成復(fù)壯培養(yǎng)后再將試管苗分別接種于增殖培養(yǎng)基。每個處理接種20個單芽，重復(fù)3次。
③培養(yǎng)條件與數(shù)據(jù)處理：復(fù)壯培養(yǎng)光照強(qiáng)度為3000lx，光照周期12h/d，培養(yǎng)溫度25±1℃。增殖培養(yǎng)30天后統(tǒng)計試管苗增殖系數(shù)、芽的質(zhì)量、玻璃化率及葉片情況。
④結(jié)果：連續(xù)多代增殖培養(yǎng)后進(jìn)行一代復(fù)壯培養(yǎng)可以在一定程度上減輕龍腦樟試管苗玻璃化現(xiàn)象，但復(fù)壯時間過長(30天)會導(dǎo)致試管苗分化能力下降，組織衰老，再轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基后表現(xiàn)出增殖率下降，葉片萎蔫的現(xiàn)象。綜合考慮，以復(fù)壯時間15～20天為最佳處理，組培苗生長健壯，且玻璃化情況明顯低于對照(表2)。
表2復(fù)壯時間對試管苗增殖及生長的影響
表注：表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，不同小寫字母表示在p≤0.05差異顯著。芽的質(zhì)量等級：+++粗壯；++健壯；+細(xì)弱。
試驗26-ba和ga3濃度對試管苗增殖及生長的影響
①材料：龍腦樟繼代培養(yǎng)試管苗。
②方法：切取龍腦樟單芽接種于改良ms培養(yǎng)基中，附加生長素naa0.05mg/l，蔗糖30g/l，卡拉膠6.0g/l，ph＝6.0，設(shè)置不同濃度的細(xì)胞分裂素6-ba(0.5，1.0，1.5，2.0mg/l)和赤霉素ga3(0，0.1，0.3，0.5mg/l)處理。每個處理接種20個單芽，重復(fù)3次。
③培養(yǎng)條件與數(shù)據(jù)處理：試管苗接種后進(jìn)行光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度3000lx，光照周期12h/d，培養(yǎng)溫度25±1℃，培養(yǎng)周期為30天。連續(xù)增殖培養(yǎng)三代后進(jìn)行復(fù)壯培養(yǎng)，即將不定芽接種于含naa0.05mg/l的改良1/2ms培養(yǎng)基中，并添加活性炭1.5g/l、椰汁100ml/l，光照培養(yǎng)20天，其余培養(yǎng)條件同增殖培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)六代后統(tǒng)計試管苗增殖系數(shù)、葉片數(shù)、芽的質(zhì)量以及玻璃化情況。
④結(jié)果：結(jié)果顯示，6-ba和ga3配合使用能夠顯著提高龍腦樟試管苗增殖系數(shù)，當(dāng)6-ba濃度為1.0～2.0mg/l，ga3濃度0.1～0.3mg/l時，試管苗增殖系數(shù)顯著提高，可達(dá)6.07～9.43(表3)，但試管苗玻璃化程度與生長調(diào)節(jié)劑濃度成正比。僅當(dāng)6-ba濃度為1.0mg/l，ga3濃度為0.1～0.3mg/l時，試管苗增殖率高，莖干充實，葉片嫩綠，無玻璃化現(xiàn)象。因此，龍腦樟試管苗增殖的最佳處理為6-ba1.0mg/l和ga30.1～0.3mg/l，增殖系數(shù)可達(dá)7.78～9.22，試管苗生長健壯。
表36-ba和ga3濃度對試管苗增殖及生長的影響
表注：表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，不同小寫字母表示在p≤0.05差異顯著。芽的質(zhì)量等級：+++粗壯；++健壯；+細(xì)弱。
試驗3防褐劑agno3濃度對試管苗褐化的影響
①材料：龍腦樟繼代培養(yǎng)試管苗。
②方法：切取龍腦樟單芽接種于改良ms培養(yǎng)基，附加分裂素6-ba1.0mg/l，赤霉素ga30.3mg/l，生長素naa0.05mg/l，蔗糖30g/l，卡拉膠6.0g/l，ph＝6.0。設(shè)置不同濃度的防褐劑agno3(0，1.0，2.0，3.0mg/l)處理。每個處理接種20個單芽，重復(fù)3次。
③培養(yǎng)條件與數(shù)據(jù)處理：試管苗接種后先置于黑暗環(huán)境下培養(yǎng)3天(agno3見光分解)，之后轉(zhuǎn)光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度3000lx，光照周期12h/d，培養(yǎng)溫度25±1℃，培養(yǎng)周期為30天。統(tǒng)計試管苗增殖系數(shù)、葉片數(shù)、芽的質(zhì)量以及玻璃化情況。
④結(jié)果：添加防褐劑是目前防止褐化效果最好的方法，結(jié)果顯示，agno3能夠有效減輕龍腦樟試管苗褐化，但不同濃度間防治褐化效果差別不顯著。低濃度agno3能促進(jìn)試管苗增殖，當(dāng)agno3濃度為1.0～2.0mg/l時，試管苗增殖系數(shù)可達(dá)10.17～10.50，顯著高于對照(表4)，且組培苗葉片嫩綠，生長健壯。但濃度達(dá)到3.0mg/l后試管苗增殖則受到抑制，增殖效果不如對照。因此，agno3濃度為1.0～2.0mg/l是龍腦樟最佳增殖處理方式。
表4防褐劑agno3濃度對試管苗褐化的影響
表注：表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，不同小寫字母表示在p≤0.05差異顯著。芽的質(zhì)量等級：+++粗壯；++健壯；+細(xì)弱。褐化程度：a褐化嚴(yán)重；b褐化中等；c輕微或無褐化。