【技術領域】
本發明涉及植物培育繁殖技術領域，具體涉及一種香樟的組織培養方法。
背景技術：
香樟樹是一種重要的多種用途生態和經濟樹種，其木材致密美觀，具有芳香味，防蟲擊蚊之用；香樟樹樹姿秀麗，四季常青且枝葉茂密，具有很強吸塵能力和抗霧霾能力；香樟樹的木材、根、葉及果實皆含精油，是天然樟腦，芳香油和芳香醇的重要來源，其精油和芳香醇價格每噸18-32萬之間，其精加工產品涉及眾多領域和行業。
在培育過程中，香樟樹通常以種子進行繁殖，后代變異極大，扦插繁殖和分蘗繁殖等能最大限度保持母本優良特性，生產成本相對較低，而隨著香樟樹特色資源利用水平的不斷提高，特別是產業脫貧項目上，扦插繁殖難于在短時間內滿足規模化生產的需求，還具有根系不發達，浪費枝條等缺點，因此，研究出一種縮短其育苗時間、提高出芽存活率，滿足規模化生產的香樟組培技術有著十分重要的意義。
技術實現要素：
有鑒于此，本發明的目的在于，提供一種香樟的組織培養方法，本發明的香樟的組織培養方法在含有不同激素配比的wpm培養基上誘導香樟的愈傷組織，通過誘導培養基、增殖培養基以及生根培養基的培養，獲得香樟的再生苗，其培養方法取材方便，材料來源、數量充足，容易獲得無菌材料，能夠用較少的優良母本，繁殖出大批量的種苗，適用于規?；a。
為了解決上述技術問題，本發明采用了如下的技術方案：
一種香樟的組織培養方法，具體包括如下步驟：
(一)外植體的預處理：剪取經過挖根處理后長出的嫩芽作為外植體，將外植體剪成4-6cm的條狀物，然后用大蒜汁將外植體浸泡15-30min(浸泡時間長短視材料木質化程度而定)，浸泡過程不斷進行振蕩，浸泡完成后用無菌水將外植體沖洗4-6次，然后放置于無菌接種盤吹干其表面水分，切去葉片以及舊的切口，切成2-2.5cm帶3個芽的莖段，將帶芽莖段置于自來水下沖洗30min，用濾紙吸干帶芽莖段備用；
(二)培養基的培養：
(1)誘導培養：將上述步驟獲得的帶芽莖段先接種到誘導培養基上，黑暗條件下培養5-10天，然后按光照和黑暗時間比為2:1交替進行誘導培養，誘導新芽長高至4-5cm后，將新芽的葉片切去，切成2-3cm的莖段；
所述誘導培養基含有wpm培養基+2.5mg/l6-ba+0.25mg/lnaa+4.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖；
(2)增殖培養：將步驟(1)培養后處理得到的莖段接種到增殖培養基上培養35-40天后，將新芽轉到新的增殖培養基培養，增殖倍數達到3-4倍；
所述增殖培養基的成分為：wpm+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+3.5g/l瓊脂+25g/l蔗糖；
(3)生根培養：將經步驟(2)增殖培養得到的叢芽切除其多余的側面芽或不定芽，按照高度為1.5-3cm將具有單芽的小枝剪切下來，然后將剪切后的小枝放到生根培養基進行生根培養，培養24-26天后即可出瓶煉苗；
所述生根培養基的成分為：wpm+2.0mg/l生根粉+4.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖；
上述三種培養基的制備方法是將組成培養基的原料混合攪拌均勻后，將其煮沸至ph值調節至5.6-6.0，然后裝入培養器皿中，在120-123℃高溫下蒸汽滅菌15-20min后進行冷卻，得到培養基備用；
(三)大棚煉苗：用鑷子將小苗從培養器皿中取出，用自來水將小苗根部的培養基洗凈，然后種植到培養土苗盤里并噴淋定根水，待葉面干后，噴施800-1000倍液的農用鏈霉毒，7-15天后噴施20-30倍的沼氣液，在大棚內培育3-5個月后進行移栽。
優選地，所述組織培養方法還包括外植體準備的步驟，具體為：通過檢測取含精油量和芳香醇高的香樟樹作為母體，將母體進行挖根處理，經過挖根處理待斷根處長出嫩芽后，取斷根位置新長出的嫩芽作為外植體。
優選地，步驟(1)所述誘導培養是在溫度為26-28℃，濕度為65-80％，ph值為5.6-6.0的條件下進行的，誘導培養中的光照為自然光照2000-2500lux。
優選地，步驟(2)所述增殖培養是在溫度為26-28℃，濕度為50-75％，ph值為5.6-6.0的條件下進行的，所述增殖培養光照強度為2000-3000lux，光照時度為12-14h/天。
優選地，步驟(3)所述生根培養是在溫度為24-27℃，濕度為40-60％，ph值為5.6-6.0，光照強度為2000-3000lux，光照時度為12-14h/天的條件下進行的。
優選地，步驟(3)所述生根粉為abt1號生根粉。
優選地，所述作為外植體的嫩芽為4-6月份非下雨天期間長出的嫩芽。
本發明經大棚煉苗得到的香樟苗從大棚內取出，放入清水盆中，洗去根部瓊脂，然后撈出，用多菌靈處理后移栽至營養土中，營養土上層為2cm河沙，下層為4cm珍珠巖、蛭石及腐殖質混合物，待有新葉長出后按常規苗圃育苗措施管理。
綜上所述，由于采用了上述技術方案，本發明的有益效果是：
1、本發明的一種香樟的組織培養方法在選擇外植體時，選擇通過檢測取含精油量和芳香醇高的香樟樹作為母體，將母體進行挖根處理，經過挖根處理待斷根處長出嫩芽后，取斷根位置新長出的嫩芽作為外植體，用上述方法得到的外植體可以有效的保持了優良母本的穩定性狀，通過組織培養對外植體進行處理，與常規的扦插和壓條繁殖相比，組織培養能夠用較少的優良母本，繁殖出大批量的種苗，適用于規?；a。
2、本發明的香樟的組織培養方法在含有不同激素配比的wpm培養基上誘導愈傷組織，通過誘導培養基、增殖培養基以及生根培養基的培養，獲得香樟的再生苗，其培養方法取材方便，材料來源、數量充足，容易獲得無菌材料；篩選獲得植株再生的香樟無性系，可大大提高農桿菌介導遺傳轉化的轉基因獲得率，有效縮短香樟的遺傳轉化周期，是一套易于掌握、簡便節約、快速高效的再生體系。
【具體實施方式】
下面的實施例可以幫助本領域的技術人員更全面地理解本發明，但不可以以任何方式限制本發明。
實施例1
本實施例提供一種香樟的組織培養方法，具體包括如下步驟：
(一)外植體的準備：通過檢測取含精油量和芳香醇高的香樟樹作為母體，將母體進行挖根處理，經過挖根處理待斷根處長出嫩芽后，取斷根位置新長出的嫩芽作為外植體，其中，嫩芽為4-6月份非下雨天期間長出的嫩芽；
(二)外植體的預處理：剪取經過挖根處理后長出的嫩芽作為外植體，將外植體剪成4cm的條狀物，然后用大蒜汁將外植體浸泡15min，浸泡過程不斷進行振蕩，浸泡完成后用無菌水將外植體沖洗4次，然后放置于無菌接種盤吹干其表面水分，切去葉片以及舊的切口，切成2cm帶3個芽的莖段，將帶芽莖段置于自來水下沖洗30min，用濾紙吸干帶芽莖段備用；
(三)培養基的培養：
(1)誘導培養：將上述步驟獲得的帶芽莖段先接種到誘導培養基上，黑暗條件下培養5天，然后按光照和黑暗時間比為2:1交替進行誘導培養，誘導新芽長高至4cm后，將新芽的葉片切去，切成2cm的莖段；誘導培養是在溫度為26℃，濕度為65％，ph值為5.6的條件下進行的，誘導培養中的光照為自然光照2000lux；其中，誘導培養基含有wpm培養基+2.5mg/l6-ba+0.25mg/lnaa+4.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖；
(2)增殖培養：將步驟(1)培養后處理得到的莖段接種到增殖培養基上培養35天后，將新芽轉到新的增殖培養基培養，增殖倍數達到3倍；增殖培養是在溫度為26℃，濕度為50％，ph值為5.6的條件下進行的，所述增殖培養光照強度為2000lux，光照時度為12h/天；其中，增殖培養基的成分為：wpm+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+3.5g/l瓊脂+25g/l蔗糖；
(3)生根培養：將經步驟(2)增殖培養得到的叢芽切除其多余的側面芽或不定芽，按照高度為1.5cm將具有單芽的小枝剪切下來，然后將剪切后的小枝放到生根培養基進行生根培養，培養24天后即可出瓶煉苗；生根培養是在溫度為24℃，濕度為40％，ph值為5.6，光照強度為2000lux，光照時度為12h/天的條件下進行的；其中，生根培養基的成分為：wpm+2.0mg/labt1號生根粉+4.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖；
上述三種培養基的制備方法是將組成培養基的原料混合攪拌均勻后，將其煮沸至ph值調節至5.6，然后裝入培養器皿中，在120℃高溫下蒸汽滅菌15min后進行冷卻，得到培養基備用；
(四)大棚煉苗：用鑷子將小苗從培養器皿中取出，用自來水將小苗根部的培養基洗凈，然后種植到培養土苗盤里并噴淋定根水，待葉面干后，噴施800倍液的農用鏈霉毒，7天后噴施20倍的沼氣液，在大棚內培育3個月后進行移栽。
實施例2
本實施例提供一種香樟的組織培養方法，具體包括如下步驟：
(一)外植體的準備：通過檢測取含精油量和芳香醇高的香樟樹作為母體，將母體進行挖根處理，經過挖根處理待斷根處長出嫩芽后，取斷根位置新長出的嫩芽作為外植體，其中，嫩芽為4-6月份非下雨天期間長出的嫩芽；
(二)外植體的預處理：剪取經過挖根處理后長出的嫩芽作為外植體，將外植體剪成5cm的條狀物，然后用大蒜汁將外植體浸泡22min，浸泡過程不斷進行振蕩，浸泡完成后用無菌水將外植體沖洗5次，然后放置于無菌接種盤吹干其表面水分，切去葉片以及舊的切口，切成2.2cm帶3個芽的莖段，將帶芽莖段置于自來水下沖洗30min，用濾紙吸干帶芽莖段備用；
(三)培養基的培養：
(1)誘導培養：將上述步驟獲得的帶芽莖段先接種到誘導培養基上，黑暗條件下培養7天，然后按光照和黑暗時間比為2:1交替進行誘導培養，誘導新芽長高至4cm后，將新芽的葉片切去，切成2cm的莖段；誘導培養是在溫度為27℃，濕度為75％，ph值為5.8的條件下進行的，誘導培養中的光照為自然光照2250lux；其中，誘導培養基含有wpm培養基+2.5mg/l6-ba+0.25mg/lnaa+4.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖；
(2)增殖培養：將步驟(1)培養后處理得到的莖段接種到增殖培養基上培養38天后，將新芽轉到新的增殖培養基培養，增殖倍數達到3倍；增殖培養是在溫度為27℃，濕度為65％，ph值為5.8的條件下進行的，所述增殖培養光照強度為2500lux，光照時度為13h/天；其中，增殖培養基的成分為：wpm+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+3.5g/l瓊脂+25g/l蔗糖；
(3)生根培養：將經步驟(2)增殖培養得到的叢芽切除其多余的側面芽或不定芽，按照高度為1.9cm將具有單芽的小枝剪切下來，然后將剪切后的小枝放到生根培養基進行生根培養，培養25天后即可出瓶煉苗；生根培養是在溫度為25℃，濕度為50％，ph值為5.8，光照強度為2500lux，光照時度為13h/天的條件下進行的；其中，生根培養基的成分為：wpm+2.0mg/labt1號生根粉+4.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖；
上述三種培養基的制備方法是將組成培養基的原料混合攪拌均勻后，將其煮沸至ph值調節至5.8，然后裝入培養器皿中，在122℃高溫下蒸汽滅菌17min后進行冷卻，得到培養基備用；
(四)大棚煉苗：用鑷子將小苗從培養器皿中取出，用自來水將小苗根部的培養基洗凈，然后種植到培養土苗盤里并噴淋定根水，待葉面干后，噴施900倍液的農用鏈霉毒，12天后噴施25倍的沼氣液，在大棚內培育4個月后進行移栽。
實施例3
本實施例提供一種香樟的組織培養方法，具體包括如下步驟：
(一)外植體的準備：通過檢測取含精油量和芳香醇高的香樟樹作為母體，將母體進行挖根處理，經過挖根處理待斷根處長出嫩芽后，取斷根位置新長出的嫩芽作為外植體，其中，嫩芽為4-6月份非下雨天期間長出的嫩芽；
(二)外植體的預處理：剪取經過挖根處理后長出的嫩芽作為外植體，將外植體剪成6cm的條狀物，然后用大蒜汁將外植體浸泡30min，浸泡過程不斷進行振蕩，浸泡完成后用無菌水將外植體沖洗6次，然后放置于無菌接種盤吹干其表面水分，切去葉片以及舊的切口，切成2.5cm帶3個芽的莖段，將帶芽莖段置于自來水下沖洗30min，用濾紙吸干帶芽莖段備用；
(三)培養基的培養：
(1)誘導培養：將上述步驟獲得的帶芽莖段先接種到誘導培養基上，黑暗條件下培養10天，然后按光照和黑暗時間比為2:1交替進行誘導培養，誘導新芽長高至5cm后，將新芽的葉片切去，切成3cm的莖段；誘導培養是在溫度為28℃，濕度為80％，ph值為6.0的條件下進行的，誘導培養中的光照為自然光照2500lux；其中，誘導培養基含有wpm培養基+2.5mg/l6-ba+0.25mg/lnaa+4.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖；
(2)增殖培養：將步驟(1)培養后處理得到的莖段接種到增殖培養基上培養40天后，將新芽轉到新的增殖培養基培養，增殖倍數達到4倍；增殖培養是在溫度為28℃，濕度為75％，ph值為6.0的條件下進行的，所述增殖培養光照強度為3000lux，光照時度為12-14h/天；其中，增殖培養基的成分為：wpm+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+3.5g/l瓊脂+25g/l蔗糖；
(3)生根培養：將經步驟(2)增殖培養得到的叢芽切除其多余的側面芽或不定芽，按照高度為3cm將具有單芽的小枝剪切下來，然后將剪切后的小枝放到生根培養基進行生根培養，培養26天后即可出瓶煉苗；生根培養是在溫度為27℃，濕度為60％，ph值為6.0，光照強度為3000lux，光照時度為14h/天的條件下進行的；其中，生根培養基的成分為：wpm+2.0mg/labt1號生根粉+4.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖；
上述三種培養基的制備方法是將組成培養基的原料混合攪拌均勻后，將其煮沸至ph值調節至6.0，然后裝入培養器皿中，在123℃高溫下蒸汽滅菌20min后進行冷卻，得到培養基備用；
(四)大棚煉苗：用鑷子將小苗從培養器皿中取出，用自來水將小苗根部的培養基洗凈，然后種植到培養土苗盤里并噴淋定根水，待葉面干后，噴施1000倍液的農用鏈霉毒，15天后噴施30倍的沼氣液，在大棚內培育5個月后進行移栽。
效果驗證
為了進一步說明本發明香樟的組織培養方法的應用價值，實施人分為以下四組做對比試驗：
第一組：實施例1所述的組織培養方法；
第二組：實施例2所述的組織培養方法；
第三組：實施例3所述的組織培養方法；
第四組：培養基配方更換為wpm培養基+2.5mg/l6-ba+0.5mg/liba-d+30g/l蔗糖，其他方式嚴格按照實施例2進行。
s1：觀察上述四組在組培苗情況，記錄各組的生根苗數、生根率和多根率，結果見表1；
表1四組香樟組培苗情況表
根據上表可知：采用本發明的組織培養方法培育得到的香樟種苗，生根苗數多，生根率以及多根率高，適用于大規模種植，值得推廣。
雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。