本發明涉及一種植物植物種子成苗的培養方法，具體為白芨種子培育成苗培養方法。

背景技術：

白芨(bletillastriata(thunb．)reichb．f．)為蘭科白芨屬多年生草本植物，初生假鱗莖是圓球形，生長到一定程度才形成v字形塊狀假鱗莖；葉4～6枚，狹長圓形或披針形，長8～29厘米，寬1.5～4厘米，先端漸尖，基部收狹成鞘并抱莖；花序具3～10朵花，常不分枝或極罕分枝；花序軸或多或少呈“之”字狀曲折；花苞片長圓狀披針形，長2～2.5厘米；花大，紫紅色或粉紅色；花期4～5月；果期8～11月；白芨的種子極細小，似粉末，狀沒有胚乳，只有幾個細胞構成的發育不完全的胚；在自然條件下，種子萌發率低。白芨的塊莖為我國傳統中藥，具有補肺、消腫、生肌、止血、斂瘡等功效，用于治療肺傷咳血、金瘡出血、潰瘍疼痛、湯火灼傷、手足皸裂等癥。

利用白芨種子無菌誘導萌發產生實生苗，然后通過壯苗生根后移栽可獲得白芨種苗。此育種方法能快速獲得白芨種苗，能明顯縮短繁種周期，并且培育的種苗健壯、根系發達，移栽成活率高。

目前已報道的白芨組培快繁育苗技術中，需要經過外植體選擇、原球莖誘導培養、叢生芽增殖培養、生根誘導及煉苗移栽等生產環節才能批量生產出種苗。這種組培繁育體系，中間生產環節多，生產周期長，用工成本高；通過原球莖分化及叢生芽增殖培養，雖可增加繁種系數，但組培苗與本技術培育的苗相比苗較弱、根系不發達，移栽成活率低。

技術實現要素：

本發明的目的在于克服現有白芨組培育苗技術存在的缺陷，得到一種能夠通過白芨種子無菌誘導成苗的組培方法，為白芨組織培養提供了一種效率高、成活率高的方法，在短期內迅速獲得大量健壯、安全、生活力強的白芨種苗。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

1、一種白芨種子培養成苗的培養方法，包括以下步驟：

（1）種子采集、貯藏：采集成熟的白芨蒴果并密封保存于4℃的冰箱貯藏備用；所述白芨蒴果的實際貯藏數量為計劃播種量的120～130%；（由于隨貯種時間的延長，種子萌發率會有所下降，所以在貯種時，可增加20～30%貯種量，解決貯種過程中種子萌發率下降的所造成的消耗量;）

（2）消毒滅菌：從中選取未開裂的白芨蒴果，用流水沖洗30～40min后在超凈工作臺上用75%酒精處理20～40s，再用0.1％的升汞浸泡10～15min，再用無菌水漂洗4～5次，每次1～2min，然后用無菌干燥濾紙吸干蒴果表面水分備用；

（3）誘導成苗：在超凈工作臺上，以接種針從上一步處理過的白芨蒴果中挑取種子接種到誘導培養基上，暗培養到13～17d后，接著光培養60～70d，直至分化形成具有2片以上真葉、帶有根的種子芽；所述培養基ph值為5.8±0.2，培養溫度為24±2℃，光照強度為1200lx，光照時間12h／d；根據生產需要，從每年的9月開始至次年6月，每月誘導萌發一批種子，為壯苗生根提供足夠的種苗；

(4)壯苗生根：將上一步所得無菌苗轉移到壯苗生根培養基中進行生根培養，直至形成帶有圓球形假鱗莖的完整植株；所述培養基ph值為5.8±0.2，培養溫度為24±2℃，光照強度為1200lx，光照時間12h／d；

(5)煉苗與移栽：將上一步所得完整植株的無菌瓶置于蔭棚中煉苗15～20d，然后在蔭棚中打開瓶蓋放置3～5d后將苗取出，洗凈根部培養基，即刻移栽到經消毒的基質中，待組培移栽苗新葉展開和新根長出后，即可按常規管理。

進一步：所述第（3）步中誘導培養基成分為：ms+芐基腺嘌呤6-ba0.5mg／l+α-萘乙酸naa0.1mg／l+2.5％蔗糖。

進一步：所述第（4）步中誘導培養基成分為：ms+芐基腺嘌呤6-ba0.5mg／l+α-萘乙酸naa1.5mg／l+0.5mg／l矮壯素+2.5％蔗糖。

進一步：所述第（1）步中白芨蒴果的采集時間是9～10月，當白芨蒴果由淡黃轉褐色成熟之際。

進一步：所述第（5）步中蔭棚遮蔭度為60～80%。

有益技術效果

本發明是充分利用豐富的白芨種子資源，通過組培無菌培養技術，在解決白芨種子在自然條件下萌發率低的技術問題的同時、將其直接誘導萌發生長成苗；本發明與現有組培技術相比，主要有以下三方面不同：一是通過種子的誘導萌發、直接長大成苗，減少了組培生產過程中的原球莖誘導培養、叢生芽增殖培養等環節，縮短了育苗生產周期，節約用工成本；二是利用豐富的白芨種子資源，根據生產需要分批次進行種子無菌播種，為下一個生產環節提供充足種源；三是通過本發明生產的種苗，與傳統組培生產的組培苗不同，屬種子誘導萌發的實生苗，植株健壯、根系發達，移栽成活高。

具體實施方式

下面結合實例對本發明操作技術作出進一步說明。

實施例1：一種白芨種子培養成苗的培養方法，包括以下步驟：

(1)種子采集、貯藏：9-10月，當白芨蒴果由淡黃轉褐色成熟之際，采集成熟的白芨蒴果并密封保存于4℃的冰箱貯藏備用；所述白芨蒴果的實際貯藏數量為計劃播種量的120%；

(2)消毒滅菌：取具有4月胚齡、在4℃冰箱中貯藏1個月的種子，作為備用材料，從備用材料中選取未開裂的白芨蒴果，用流水沖洗30min，在超凈工作臺上用75％酒精處理30s后再用0.1％升汞浸泡10min，倒掉升汞溶液，用無菌水漂洗4次，每次1min，用無菌干燥濾紙吸干蒴果表面水分備用；

(3)誘導成苗：在超凈工作臺上，以接種針從上一步處理過的白芨蒴果中挑取種子接種到誘導培養基上，暗培養到13d，接著光培養60d，直至分化形成具有2片以上真葉、帶有根的種子芽，誘導培養基成分優選為：ms+芐基腺嘌呤6-ba0.5mg／l+α-萘乙酸naa0.1mg／l+2.5％蔗糖；培養基ph值為5.6，培養溫度為22℃，光照強度為1200lx，光照時間12h／d；根據生產需要，從每年的9月開始至次年6月，每月誘導萌發一批種子，為壯苗生根提供足夠的種苗；

(4)壯苗生根：將上一步所得無菌苗轉移到壯苗生根培養基中進行壯苗生根培養，直至形成帶有圓球形假鱗莖的完整植株；壯苗生根培養基成分優選為：ms+芐基腺嘌呤6-ba0.5mg／l+α-萘乙酸naa1.5mg／l+0.5mg／l矮壯素+2.5％蔗糖；培養基ph值為5.6，培養溫度為22℃，光照強度為1200lx，光照時間12h／d。

(5)煉苗與移栽：將上一步所得完整植株的無菌瓶置于遮蔭度為60%的蔭棚中煉苗15d，然后在蔭棚中打開瓶蓋放置3d，將苗取出，洗凈根部培養基即刻移栽到經消毒的基質中，適度遮蔭，保持一定的濕度，待組培移栽苗新葉展開和新根長出后，即可按常規管理。

實施例2：一種白芨種子培養成苗的培養方法，包括以下步驟：

(1)種子采集、貯藏：9-10月，當白芨蒴果由淡黃轉褐色成熟之際，采集成熟的白芨蒴果并密封保存于4℃的冰箱貯藏備用；所述白芨蒴果的實際貯藏數量為計劃播種量的130%；

(2)消毒滅菌：取具有4月胚齡、在4℃冰箱中貯藏1個月的種子，作為備用材料，從備用材料中選取未開裂的白芨蒴果，用流水沖洗40min，在超凈工作臺上用75％酒精處理30s后再用0.1％升汞浸泡15min，倒掉升汞溶液，用無菌水漂洗5次，每次2min，用無菌干燥濾紙吸干蒴果表面水分備用；

(3)誘導成苗：在超凈工作臺上，以接種針從上一步處理過的白芨蒴果中挑取種子接種到誘導培養基上，暗培養到17d，接著光培養70d，直至分化形成具有2片以上真葉、帶有根的種子芽，誘導培養基成分優選為：ms+芐基腺嘌呤6-ba0.5mg／l+α-萘乙酸naa0.1mg／l+2.5％蔗糖；培養基ph值為6，培養溫度為26℃，光照強度為1200lx，光照時間12h／d；根據生產需要，從每年的9月開始至次年6月，每月誘導萌發一批種子，為壯苗生根提供足夠的種苗；

(4)壯苗生根：將上一步所得無菌苗轉移到壯苗生根培養基中進行壯苗生根培養，直至形成帶有圓球形假鱗莖的完整植株；壯苗生根培養基成分優選為：ms+芐基腺嘌呤6-ba0.5mg／l+α-萘乙酸naa1.5mg／l+0.5mg／l矮壯素+2.5％蔗糖；培養基ph值為6，培養溫度為26℃，光照強度為1200lx，光照時間12h／d。

(5)煉苗與移栽：將上一步所得完整植株的無菌瓶置于遮蔭度為80%的蔭棚中煉苗20d，然后在蔭棚中打開瓶蓋放置5d，將苗取出，洗凈根部培養基即刻移栽到經消毒的基質中，適度遮蔭，保持一定的濕度，待組培移栽苗新葉展開和新根長出后，即可按常規管理。

實施例3：一種白芨種子培養成苗的培養方法，包括以下步驟：

(1)種子采集、貯藏：9-10月，當白芨蒴果由淡黃轉褐色成熟之際，采集成熟的白芨蒴果并密封保存于4℃的冰箱貯藏備用；所述白芨蒴果的實際貯藏數量為計劃播種量的125%；

(2)消毒滅菌：取具有4月胚齡、在4℃冰箱中貯藏1個月的種子，作為備用材料，從備用材料中選取未開裂的白芨蒴果，用流水沖洗35min，在超凈工作臺上用75％酒精處理30s后再用0.1％升汞浸泡13min，倒掉升汞溶液，用無菌水漂洗4次，每次1min，用無菌干燥濾紙吸干蒴果表面水分備用；

(3)誘導成苗：在超凈工作臺上，以接種針從上一步處理過的白芨蒴果中挑取種子接種到誘導培養基上，暗培養到15d，接著光培養65d，直至分化形成具有2片以上真葉、帶有根的種子芽，誘導培養基成分優選為：ms+芐基腺嘌呤6-ba0.5mg／l+α-萘乙酸naa0.1mg／l+2.5％蔗糖；培養基ph值為5.8，培養溫度為24℃，光照強度為1200lx，光照時間12h／d；根據生產需要，從每年的9月開始至次年6月，每月誘導萌發一批種子，為壯苗生根提供足夠的種苗；

(4)壯苗生根：將上一步所得無菌苗轉移到壯苗生根培養基中進行壯苗生根培養，直至形成帶有圓球形假鱗莖的完整植株；壯苗生根培養基成分優選為：ms+芐基腺嘌呤6-ba0.5mg／l+α-萘乙酸naa1.5mg／l+0.5mg／l矮壯素+2.5％蔗糖；培養基ph值為5.8，培養溫度為24℃，光照強度為1200lx，光照時間12h／d。

(5)煉苗與移栽：將上一步所得完整植株的無菌瓶置于遮蔭度為70%的蔭棚中煉苗18d，然后在蔭棚中打開瓶蓋放置4d，將苗取出，洗凈根部培養基即刻移栽到經消毒的基質中，適度遮蔭，保持一定的濕度，待組培移栽苗新葉展開和新根長出后，即可按常規管理。

為了進一步反映本發明的技術效果，提供以下試驗數據：

（1）種子成熟度及最佳采集期確定

種子萌發率、萌發時間等與胚齡的大小關系密切，種子的成熟度用胚齡來表示，胚齡為從授粉開始到子房膨大成果實所需時間。本技術為了采集到最佳成熟度的種子，選取白芨胚齡為3、4、5、6個月的胚，無菌播種在種子誘導培養基中：ms+6-ba0.5mg／l+naa0.1mg／l+2.5％蔗糖；ph值為5.8±0.2，25℃暗培養15d后，可見種子膨大萌發，接著以1200lx光照強度、12h/d的光照時間培養30-60d，調查種子的萌發率和萌發時間，研究種子成熟度對種子萌發的影響；

其萌發時間隨著胚齡的增加而減小，3個月的白芨種子萌發時間最長為60天，4～5個月的白芨萌發時間為30天左右，6個月胚齡種子的萌發時間與3個月種子大致相當；白芨種子的萌發率和成苗率在胚齡為3個月時萌發率和成苗率均較低，都在30%以下，胚齡在4～5個月的白芨種子發芽率和成苗率基本保持不變，胚齡在6個月的白芨種子發芽率和成苗率有所下降，在75%，但6個月以上胚齡滅菌時蒴果易開裂，污染嚴重，且生長緩慢；

因此，綜合考慮，白芨無菌萌發最合適的胚齡為4～5個月，萌發時間為28天，萌發率和成苗率最高，分別為93%和92%，幼苗生長最好。說明4～5個月的胚齡（也就是9～10月，當白芨蒴果由淡黃轉褐色成熟之際），胚發育成熟，比較適合于白芨種子的無菌萌發和成苗；

（2）種子貯備

種子生活力是指種子發芽的潛在能力或種胚具有的生命力，它是本技術發明的一個重要技術參數。采集具有3～4個月的胚齡的蒴果，將表面的灰塵清洗掉，室溫下放置2天，然后把部分蒴果放于牛皮紙袋內，置于3種溫度條件下作貯存處理：20℃冰箱；4℃冰箱；室溫條件；貯藏時間為1、3、6個月，貯藏期間1、3和6個月后隨機取樣作種子發芽測定和活力測定；

通過實驗，就貯存時間來看，白芨種子貯存一個月時，較新采集時的種子活力高，可能原因是白芨種子存在后熟現象，貯存3個月時，種子活力有所下降，貯存6個月時，種子萌發率下降幅度較大。三種貯存方式，4℃冰箱貯存效果較好，貯存一個月后，種子萌發率為99%，種子染色率為99%，貯存6個月時，萌發率在70%以上；其它兩種貯存方式，種子萌發率和活力下降幅度較大，貯存效果較差；

由此可知，4℃冰箱貯存是白芨石斛種子短時間保存的最佳方式；

（3）消毒滅菌

從密封于4℃冰箱中保存備用材料中選取未開裂的白芨蒴果，用流水沖洗30～40min，在超凈工作臺上用75％酒精處理30s后再用0.1％升汞浸泡10～15min，倒掉升汞溶液，用無菌水漂洗4～5次，每次1～2min，用無菌干燥濾紙吸干蒴果表面水分備用；

（4）種子無菌誘導成苗

在超凈工作臺上，以接種針從滅過菌的白芨蒴果中挑取種子接種到誘導培養基上，暗培養到13～17d，接著光培養60～70d，直至分化形成具有2片以上真葉、帶有根的種子苗；

誘導培養基成分優選為：ms+芐基腺嘌呤6-ba0.5mg／l+α-萘乙酸naa0.1mg／l+2.5％蔗糖；培養基ph值為5.8±0.2，培養溫度為24+2℃，光照強度為1200lx，光照時間12h／d；

根據生產需要，從9月開始至次年6月，每月無菌誘導萌發一批種子，為壯苗生根提供足夠的種苗；

（5）壯苗生根

將上一步所得無菌苗轉移到壯苗生根培養基中進行壯苗生根培養，直至形成帶有圓球形假鱗莖的完整植株；

壯苗生根培養基成分優選為：ms+芐基腺嘌呤6-ba0.5mg／l+α-萘乙酸naa1..5mg／l+0.5mg／l矮壯素+2.5％蔗糖；培養基ph值為5.8±0.2，培養溫度為24+2℃，光照強度為1200lx，光照時間12h／d；

（6）煉苗與移栽

將上述獲得完整植株的無菌瓶，置于遮蔭度達60～80%蔭棚中煉苗15～20d，然后在蔭棚中打開瓶蓋放置3～5d，將苗取出，洗凈根部培養基即刻移栽到經消毒的基質中，適度遮蔭，保持一定的濕度，待組培移栽苗新葉展開和新根長出后，即可按常規管理。

在不脫離本發明范圍的情況下，還可以對發明進行各種變換及等同代替，因此，本發明專利不局限于所公開的具體實施過程，而應當包括落入本發明權利要求范圍內的全部實施方案。